Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Thilo D&#246;rfler; Tobias Eilert; Carlheinz R&#246;cker; Julia Nagy; Jens Michaelis

doi:10.3791/54782

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochemistry

Structurele Informatie van Single-molecule FRET experimenten met de Fast Nano-positioneringssysteem

Published: February 09, 2017

doi:

10.3791/54782

Thilo Dörfler*¹, Tobias Eilert*¹, Carlheinz Röcker¹, Julia Nagy¹, Jens Michaelis¹

¹Institute of Biophysics,Ulm University

Summary

We present the setup and experimental procedure to obtain smFRET data from large donor-acceptor networks with a TIRF microscope. The step-by-step analysis of these measurements with the Bayesian inference software Fast-NPS yields high-resolved structural information via the application of adapted dye models.

Abstract

Single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. Thereby, multiple smFRET measurements are used to localize an unknown dye position inside a protein complex by means of trilateration. In order to obtain quantitative information, the Nano-Positioning System (NPS) uses probabilistic data analysis to combine structural information from X-ray crystallography with single-molecule fluorescence data to calculate not only the most probable position but the complete three-dimensional probability distribution, termed posterior, which indicates the experimental uncertainty. The concept was generalized for the analysis of smFRET networks containing numerous dye molecules. The latest version of NPS, Fast-NPS, features a new algorithm using Bayesian parameter estimation based on Markov Chain Monte Carlo sampling and parallel tempering that allows for the analysis of large smFRET networks in a comparably short time. Moreover, Fast-NPS allows the calculation of the posterior by choosing one of five different models for each dye, that account for the different spatial and orientational behavior exhibited by the dye molecules due to their local environment.

Here we present a detailed protocol for obtaining smFRET data and applying the Fast-NPS. We provide detailed instructions for the acquisition of the three input parameters of Fast-NPS: the smFRET values, as well as the quantum yield and anisotropy of the dye molecules. Recently, the NPS has been used to elucidate the architecture of an archaeal open promotor complex. This data is used to demonstrate the influence of the five different dye models on the posterior distribution.

Introduction

Het bepalen van de structuur van een biomolecuul is een belangrijke voorwaarde voor het begrijpen van zijn functie. Twee goed gevestigde methoden voor structuurbepaling zijn cryo-elektronenmicroscopie en X-ray kristallografie ^{^1,} ^2. Vandaag, beide methoden bieden een hoge-resolutie structurele informatie met een resolutie tot aan de Angstrom niveau. Deze twee methoden zijn uitgebreid gebruikt om de structuur van grote biomoleculen zoals helderen eiwitcomplexen. Hoewel de bestaande werkwijzen continu gedurende de laatste jaren verbeterd, de complexiteit van biologische structuren vormt nog steeds een belangrijke uitdaging voor structurele biologie, in het bijzonder bij grote, dynamische en kortlevende complexen onderzocht ^3.

Om de dynamiek van macromoleculaire complexen en de structuur-functie relatie name bestuderen single-molecule methodologieën provided nuttige informatie ^4. Verschillende nieuwe strategieën ontwikkeld verschaffen van een orthogonale aanpak op het verwerven van structurele en dynamische informatie. Voorbeelden zijn hoge snelheid AFM ^5, mechanische manipulatie ^6, fluorescentie microscopie lokalisatie ^7, evenals individuele molecuul Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) ^{^8,} ^9. Aangezien al vroeg FRET is genoemd moleculair liniaal, door de afstand afhankelijkheid van de lengteschaal van biomacromoleculen ^10.

Een bijzonder interessante toepassing van smFRET is de afstand informatie van smFRET metingen gebruiken om afleiden structurele informatie ^{^11,} ^{^12,} ^{^13,} ^{^14,} ¹⁵ </sup^>, ^{^16,} ^{^17,} ^{^18,} ^{^19,} ^{^20,} ^{^21,} ^{^22,} ^23. Vanwege de hoge tijdsresolutie van smFRET kan de positie van de beweegbare delen van een eiwitstructuur worden gelokaliseerd. Echter, om kwantitatieve informatie smFRET data belangrijk correctieparameters de kleurstofmoleculen extraheren moet tijdens de meting ²⁴ te bepalen. Met deze correctiefactoren, kan de FRET efficiëntie E _FRET worden berekend met de formule

,

waar ik _A en I _D </sub> de fluorescentie-intensiteit van de donor en de acceptor molecule zijn (zie figuur 2). De β-factor is goed voor cross-talk, het lekken van donor-emissie in de acceptor kanaal en wordt berekend door

waarin I 'en _A _Ik zou de fluorescentie-intensiteit van de donor en de acceptor molecule na bleken door het acceptormolecuul.

Het γ-factor corrigeert het verschil in de relatieve detectie-efficiëntie van de twee kanalen en de verschillen in de fluorescentie kwantumopbrengst van de donor en de acceptor kleurstof. Het wordt berekend op basis van elk individu tijd spoor door

Merk op, dat deze beschrijving verwaarloost directe excitatie van de acceptor molecule, die soms belangrijk wordt en zou moeten worden gecorrigeerd ook. Voor het vaststellen van deze correctiefactoren is het nuttig om zowel de donor als de acceptor wekken in een afwisselend schema ²⁵ om onderscheid te maken tussen foto-fysische veranderingen en structuurdynamica.

Om niet alleen kwantitatieve smFRET efficiëntie maar ook kwantitatieve structurele informatie te verkrijgen, de Nano-Positioning System (NPS) werd in 2008 ^26. De naam werd gekozen op basis van de overeenkomsten met de satelliet-gebaseerde Global Positioning System (GPS). De NPS is een hybride techniek combineert smFRET en röntgenkristallografie gegevens voor het lokaliseren van onbekende kleurstof posities in Biomacromoleculaire complexen. de crystal structuur fungeert als referentieframe en de smFRET resultaten worden gebruikt om informatie afstand tussen een onbekende fluorofoor positie (antenne) en staat bekend uit de kristalstructuur (satelliet) te verkrijgen. In opeenvolgende experimenten werd de afstand tussen de antenne en meerdere satellieten worden gemeten en de positie van de antenne wordt bepaald met behulp van een statistisch rigoureuze analyseschema Bayesian parameterschatting. Daardoor is niet alleen de meest waarschijnlijke positie van de antenne berekend, maar de volledige 3D onzekerheid distributie, de zogenaamde posterior, gevisualiseerd door geloofwaardige volumes. Bovendien NPS uitgebreid, teneinde de analyse van complete netwerken smFRET ^27.

De NPS is gebruikt om een aantal belangrijke vragen in eukaryote transcriptie, namelijk tijdens het stroomopwaartse DNA, de niet-matrijs-DNA en de ontluikende mRNA in het RNA polymerase II elongatie co lossenmplex ^{^12,} ^28, blijkt ook het effect van transcriptie initiatie factoren ²⁶ en de dynamische architectuur van een open-promotor complex ^29. Bovendien, de NPS werd gebruikt om de structuur van de Archaea RNA Polymerase geopend complex ³⁰ met name de positie van transcriptie initiatie factor TFE, die competitief aan dezelfde plaats als transcriptiefactor elongatie factor Spt4 / 5 ³¹ helderen.

Sindsdien zijn er een aantal smFRET gebaseerd structurele aanpak is gepubliceerd op ^{^15,} ^{^18,} ^{^21,} ^23. Bij het vergelijken van verschillende smFRET gebaseerd structurele methoden, wordt duidelijk dat de schijnbare nauwkeurigheid van de werkwijze sterk afhankelijk van de bepaalde keuze van kleurstof modellen. Men moet er rekening mee datkleurstofmoleculen kunnen verschillende ruimtelijke en oriënterende gedrag vertonen afhankelijk van de lokale omgeving.

Hiertoe werd Fast-NPS ³² geïntroduceerd. Fast-NPS maakt gebruik van een geavanceerde sampling algoritme het verminderen van de rekentijden drastisch. Bovendien, Fast-NPS maakt het mogelijk om een structurele analyse uit te voeren en voor elke kleurstof molecule kan de gebruiker kiezen uit een reeks van vijf verschillende kleurstof modellen die volgende zal worden beschreven. De meest conservatieve model, de zogenaamde klassieke, gaat ervan uit dat de kleurstof neemt slechts één, maar onbekende, positie. Bij deze stand kan de fluorofoor vrij draaien binnen een kegel, waarvan de grootte wordt bepaald door zijn respectieve (tijdsafhankelijke) fluorescentie anisotropie. De oriëntatie van de conus is onbekend, wat leidt tot grote onzekerheden bij het converteren van gemeten smFRET efficiëntie in afstanden. In dit opzicht is het model conservatief, omdat het leidt tot de kleinste precisie vergeleken met andere kleurstoffen modusls. Alleen voor zeer korte afstanden moet de aannames van het klassieke model leiden tot een merkbaar onjuiste positiebepaling. Voor typische smFRET waarden wordt de juiste positie steeds ingesloten in het relatief grote volume geloofwaardig.

Aangezien een hogere nauwkeurigheid gewenst is, is het belangrijk om te ontwikkelen en te testen alternatieve modellen kleurstof, die kan bijdragen tot de nauwkeurigheid te verbeteren. Als de kleurstof veel sneller dan zijn inherente fluorescentie levensduur roteert, kan de zogenaamde iso model worden toegepast. Hier is de oriëntatie factor ^K2 (nodig voor het berekenen van de karakteristieke isotrope Förster radius ) Is ingesteld op 2/3. Dientengevolge, de berekende geloofwaardige volumes bijna twee orden van grootte kleiner in vergelijking met die in de klassieke model ^32. In het geval dat de fluorofoor in een omgeving die niet alleen snel maakt reorientatie, maar daarnaast snelle beweging over haar toegankelijke volume moet de meanpos-iso-model worden gebruikt. In dit model, de kleurstof effectief neemt slechts een gemiddelde positie, waarbij de ruimtelijke middeling wordt verklaard door een polynoom afstand conversie ^15. Dit model is van toepassing als bijvoorbeeld de (algemeen hydrofobe) kleurstof wordt een hydrofiel gebied, bijvoorbeeld het DNA bevestigd. Toepassing van de meanpos iso-model leidt tot een verdere verkleining van de geloofwaardige volumes met een factor van ongeveer twee. Echter, kan een kleurstof gebonden aan een eiwit reversibel binden aan verscheidene hydrofobe vlekken in het sterisch toegankelijke volume (AV). Een fluorofoor dat onmiddellijk schakelt tussen deze regio's, maar binnen één regio ondergaat vrije rotatie en snelle gelokaliseerde beweging wordt het best beschreven door de var-meanpos-iso-model. Voor een vergelijkbare situatie waarbij de kleurstof niet vrij de var-meanpos model geldt roteren. meer d IJZE over deze modellen kunt u vinden in onze recente publicatie ^32.

Deze modellen bieden een uitgebreid repertoire om specifiek rekening te houden met de verschillende omgevingen een kleurstof tegenkomen en de toepassing ervan optimaliseert wijselijk de lokalisatie precisie. Fast-NPS elke kleurstof molecuul gekoppeld aan een bepaalde positie kan worden toegewezen aan een specifiek voertuig, zodat FRET-partners mogen verschillende modellen. Dit maakt het mogelijk onbeperkt en close-to-natuur modellering. Het is echter belangrijk dat men voert strikt statistische proeven uit teneinde de door de uiteindelijke modellencombinatie resultaat nog steeds in overeenstemming met de experimentele gegevens. Deze tests zijn in de Fast-NPS software.

Om Fast-NPS toepassing op experimentele gegevens van de meting (alleen) drie invoerparameters vereist. Ten eerste, de kleurstof-pair specifieke isotrope Förster radii (/54782/54782eq5.jpg "/>) Moeten worden bepaald. Daarom is de kwantumopbrengst (QY) van de donorkleurstof, de donor fluorescentie-emissiespectra en de acceptor absorptie spectra te meten nodig. Deze metingen kunnen worden uitgevoerd in bulk, met een standaard spectrometer en een standaard fluorescentie spectrometer. Voor elk paar, het R ₀ wordt vervolgens berekend met de freeware PhotochemCAD en kan worden gebruikt in de NPS analyse. Ook de (Tijdsgeresolveerde) fluorescentie anisotropie van de kleurstofmoleculen moeten worden verkregen met een polarisatie (en tijd) gevoelige fluorescentie spectrometer. de belangrijkste invoerparameters voor Fast-NPS zijn smFRET rendementen gemeten op een enkel-molecuul fluorescentie microscopie setup, zoals een totale interne reflectie fluorescentie microscoop (TIRFM) .

Hier presenteren we een stap-voor-stap protocol voor het verkrijgen smFRET databank toepassen Fast-NPS (figuur 1).

Protocol

1. Vereisten en Lab Equipment Opmerking: Het samenstel van de meetkamer is in Figuur 3. De sandwich-ontwerp van de meetkamer bestaat uit drie belangrijke componenten: een kwartsglas (fused silica) glijbaan, een afdichtende film en een dekglaasje dat de stroom kamer afsluit. De meetkamer wordt op een aangepaste monsterhouder gemonteerd. De afmetingen van de monsterkamer en de metalen houder worden afgestemd om te passen op een standaard microscopie kwartsglas schuif (76 mm x 26 mm). Geslepen kwarts glasplaatjes met een diamantboor (0,75 mm) op posities in figuur 4. Het ontwerp van het kwartsglas objectglaasjes asymmetrisch is om onderscheid te maken tussen de twee zijden van elke dia. NB: De kwarts dia's kunnen worden hergebruikt na de meting tot het oppervlak wordt bekrast. Om de kamers te monteren, gebruik aangepaste metalen monster houders zoals weergegeven in figuur 5 </ Strong>. De monsterhouders bevatten twee draden (M4) om een inlaat en een uitlaat slang van de stromingskamer sluiten. Bovendien gebruiken draden (M3) bij de monsterkamer monteren op de houder metaal en draden (M3) bij de prismahouder op de onderste helft van de metalen houder vast. Voer de smFRET metingen op een soort prisma totale interne reflectie fluorescentie microscoop (TIRFM) (figuur 6). OPMERKING: De TIRFM heeft drie lasers: Een groene (532 nm Nd: YAG laser) en een rode laser (643 nm diodelaser) voor de excitatie van de donor en de acceptor kleurstofmoleculen en een blauwe laser (491 nm , dpss-laser) voor het bleken van de fluorescerende achtergrond verontreinigingen op de monsterkamer voor de smFRET meting. De drie laserstralen zijn ruimtelijk gecombineerd en kunnen worden geselecteerd via een akoestisch-optische afstembare filter (AOTF). De fluorescentie licht wordt opgevangen door een hoge doelstelling opening, gesplitst in een donor en een accepterenof een kanaal met behulp van een dichroïsche spiegel en geprojecteerd op twee EM-CCD-camera's. De monsterkamer is een micrometer podium waardoor beweging in x- en y-richting met twee stappenmotoren bevestigd. Een derde piëzo motor wordt gebruikt samen met een IR-laser en een positiegevoelige detector een autofocussysteem bouwen om optimale scherpstelling gedurende het experiment te verzekeren. Gebruik afwisselende laser excitatie (ALEX) wanneer dynamiek in de FRET tijd trajecten in acht worden genomen 25. Dergelijke dynamiek kan worden veroorzaakt door ofwel conformationele veranderingen in de moleculen of door schommelingen in helderheid en acceptor acceptor knipperen. LET OP: ALEX maakt het mogelijk om onderscheid te maken tussen deze twee mogelijke oorzaken en voorkomt verkeerde interpretatie van dynamische FRET trajecten. Omwille van de eenvoud, de protocolgedeelte beperkt tot de analyse van films genomen zonder Alex. Let op: klasse 3B lasers worden gebruikt in de enkel-molecuul fluorescentie setup. Zorg ervoor dat er voldoende laveiligheid ser voorzorgsmaatregelen, volgens de plaatselijke regelgeving van de overheid, zijn genomen voordat het systeem wordt bediend. Voer de absorptiemeting ter bepaling van de kwantumopbrengst een UV-VIS spectrometer (zie Materialen en Werkwijzen). Voer de meting van de donor fluorescentie-emissiespectrum, de acceptor absorptiespectrum en de fluorescentie anisotropie op een fluorescentie spectrometer (zie Materialen en Werkwijzen). Bereid monsterkamers volgens gepubliceerde procedures 33. Als alternatief kan de procedure beschreven in [34] worden gebruikt. Label de onderzochte monsters met een donor-acceptor kleurstofmolecuul pair geschikt voor smFRET en zorgen voor een biotinegroep voor immobilisatie op het oppervlak van de monsterkamer. LET OP: Om een onbekende antenne kleurstof positie met de Fast-NPS-software verschillende monster constructies nodig te lokaliseren. Elk construct needs een label aan de onbekende antennekleurstof positie en een label met een satelliet-positie bekend is uit de kristalstructuur te hebben. Ten minste drie verschillende constructen met aan de antennepositie kleurstoffen en drie verschillende satellietposities nodig voor nauwkeurige resultaten. Metingen tussen antennes en tussen satellieten zijn ook nuttig om de nauwkeurigheid te verbeteren, maar dit vereist uitwisseling van kleurstofmoleculen die moet correct in de analyse opgenomen. 2. Montage van Flow Chambers in een aangepaste Holder Pull silicone buis (0,8 mm inwendige diameter, 2,4 mm OD) tot holle tab (M4) en snijd de buis aan beide uiteinden rechte waardoor een overhang van 1 cm aan beide zijden met een scherp scheermesje. Stel de overhang van de buis tot ongeveer 2 mm aan één zijde van de tab schroef. Monteer de stromingskamer in de monsterhouder zodanig dat de gaten in het kwartsglas schuif overeenkomen met de draden in de monsterhouder. aandraaieninlaat en uitlaat schroeven voorzichtig aan de inlaat en uitlaat van de monsterkamer nog doordringbaar. Voorzichtig draai de vier schroeven van de acrylglas houder om de positie van de stroom kamer op te lossen. Cut silicone (0,58 mm ID, 0,96 mm OD) in 20 cm lange stukken. Plaats een van de stukken om de inlaat en de uitlaat van de schroef meetkamer. Sluit de inlaat en uitlaat slang met een klem. OPMERKING: De geassembleerde monsterkamers kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur gedurende maximaal twee weken. 3. smFRET Meting op de TIRF microscoop Gebruik een injectiespuit naar de monsterkamer wassen met 500 pi PBS. Voorkomen dat er luchtbellen in de monsterkamer te allen tijde door een druppel aan het uiteinde van de inlaatslang voordat u een ander bufferoplossing. Spoel de monsterkamer met 100 pl neutravidine (/ ml in PBS 0,5 mg) oplossing en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur. Wassende neutravidine oplossing met 500 ul van PBS. Schroef de metalen houder voor het prisma op de monsterkamer. Monteer het monster kamer naar de micrometer fase van de TIRF-microscoop. Zorg ervoor dat de monsterkamer horizontaal zo recht mogelijk te monteren in de voorkant van de doelstelling om te voorkomen dat onscherp tijdens het scanproces. Start de software regelen van de EM-CCD-camera en de software voor het besturen van de piëzo-motoren van het podium. Pas de scherpstelling van het microscoopobjectief door naar de reflecties van de IR laser. Plaats het prisma (PS991, n = 1,52) bovenop de metalen prismahouder. Pas de laterale positie van het prisma om ervoor te zorgen dat de laserstralen raakte de prisma vervolgens een hechtmiddel en incubeer met UV licht gedurende 5 minuten. OPMERKING: Opgezette prisma kan worden hergebruikt door het schoonmaken. In de camera control software klik "Setup Acquisition" en de volgende acquisitie parameters te definiëren: 100 ms integration tijd, 401 frames / film (groen camera), 400 frames / film (rood camera), electron multiplier krijgen 225, voorversterker gain 5x en uitlezing rate 3 MHz bij 14 bit. Maak een map op de lokale harde schijf voor de meting. Kies een gewenste naam voor het meten van bestanden, bijvoorbeeld Jaar-Maand-Dag. In de software-instellingen gaat u naar de "Auto-Save" ruiter, enable "Auto save" en kies bestandsformaat * .sif voor de film overname. Selecteer de map op de harde schijf. Gebruik de naam van de map als filestem. Maak de "AutoIncrement" -functie (ingestelde startwaarde tot 1). Schakel de bevestiging van een operator aan de bestandsnaam. Gebruik "DON" en "ACC" voor de donor en de acceptor kanaal, respectievelijk. Kies "_" als separator. In de camera control software klikt u op "Video" om het live-beeld van de camera en bleekmiddel achtergrond fluorescentie te beginnen door het scannen van de monsterkamer met behulp van laser maximale intensiteit van de drie lasers (COMgecombineerde ≈3,000 W / cm2 gedurende 10 s per gezichtsveld). Schakel de blauwe laser. Verlaag de intensiteit van de groene laser tot ongeveer 200 W / cm2 en ongeveer 40 mW / cm 2 voor de rode laser bij afwisselende laser excitatie (Alex) gebruikt. Verdun het gebiotinyleerde fluorescerende monster tot een concentratie van 50-100 pM. Belasting 100 pi van de oplossing. Het monster wordt geïmmobiliseerd op de kamer oppervlak na binding. OPMERKING: Zorg ervoor dat de kamer niet te overbelasten. Naburige moleculen moeten van elkaar gescheiden. Plaats indien nodig een extra 100 ui 2x geconcentreerde monster aan de kamer. Dicht de inlaat en uitlaat slang van de meetkamer met klemmen nadat het laden is voltooid. Schakel alle lasers en gebruik maken van de piëzo-motoren om de stroom kamer twee gezichtsvelden verder te gaan. In de camera control software klik op "Take signaal" om de filmopname en switch startDe laser tegelijkertijd. Zorgen dat meer dan 80% van de moleculen worden gebleekt door het einde van de film van het laservermogen aan. Herhaal stap 3.17 en 3.18 voor de hele Voorgebleekte monsterkamer regio. 4. Overname van de Transformatie Map ( "beadmap") Bereid een stromingskamer, zoals beschreven in de paragrafen 1.1, 1.2 en 2. Met avidine beklede fluorescerende multispectrale parels die fluorescentie-emissie van de donor en de acceptor kanaal tonen. Vortex de voorraad voor 1 min, vervolgens verdunnen 50 pi van de voorraad in 50 pi DDH 2 O. vortex opnieuw voor 1 min, ultrasone trillingen 1-2 min, vortex vervolgens nog eens 10 s. Voer de stappen beschreven voor smFRET metingen (Sectie 3,5-3,10). Belasting 100 pi (1 kamer volume) van de 1: 2 verdund fluorescerende kralen in de stroom kamer. Wacht 10 min voor de fluorescerende kralen te binden aan het oppervlak. Gebruik de acquisitie parameters in 3.9, maar change lengte van de film tot en met 26 (groen camera) en 25 (rood camera) en het elektron multiplier winst tot 10. Stel de intensiteit van de groene laser tot een waarde van 20 W / cm2. Neem een filmpje op een gezichtsveld met ongeveer 50-100 kralen. 5. verwerking en analyse van gegevens smFRET Gebruik de op maat geschreven software SM FRET voor de analyse van de beadmap (zie materialen en methoden) en de verworven films. Start het programma viewPlot1.m. Klik op Analyse | Batch Analysis, schakelt u de optie 'ALEX "als het niet is gebruikt. Voor de beste prestaties kiest u de drempel voor piek bevinding "high". Druk op OK". Kies "NO" op de vraag of een beadmap reeds onderzocht. Blader door de map met de verworven beadmap en selecteer het * .sif-bestand (door te dubbelklikken op het). In het volgende dialoogvenster op "OK". LET OP: Als een beadmap al heeft geanalyseerd in een eerdere maatregelment, kiest u "YES" hier en kies het opgeslagen beadmap door te bladeren naar de juiste map en te dubbelklikken op het beadmap * .map bestand. Ga verder met stap 5.8. Kies twee enkele parels gepositioneerd in tegenovergestelde hoeken van het gezichtsveld. De pixel intensiteiten zijn kleurcode van donkerblauw (lage intensiteit) tot donkerrood (hoge intensiteit). Op het midden van de eerste kraal. Als het centrum van het molecuul duidelijk kan worden gelokaliseerd door de kleurcodering, kiest u "YES" of anders op "NO" en kies een ander molecuul paar. Plaats de crosshair op de pixel met de maximale intensiteit en druk op "HOUD". Herhaal het proces met het tweede kanaal. Klik op het molecuul in de tegenovergestelde hoek en herhaal stap 5.5 en 5.6. LET OP: De relatieve pixel verschuiving van de twee kanalen wordt weergegeven in het commando venster en de transformatie kaart wordt automatisch opgeslagen als * .map bestand in de map met de beadmap * .sif bestand <./ Li> Om de donor en acceptor-films (* SIF) voor de "batch analyse" te laden, ga naar de map, selecteert u alle films die worden geanalyseerd en klik op "OK". In het volgende dialoogvenster, druk op "OK". LET OP: De batch analyse is voltooid wanneer de laatste rijstrook weergegeven in het commando venster begint met "Finished analyseren …". De gedetecteerde moleculen worden in een nieuw venster, waarop ook de relatieve verschuiving van de donor en de acceptor kanaal bepaald door de transformatie kaart. Laden de gebundeld filmbestanden klik op Bestand | Load. Verwijder het vinkje bij de optie 'ALEX "als het niet is gebruikt. Stel de smoothwidth tot 10 en klik op "OK". Kies de map met de * .ttr bestanden en klik op "Alles selecteren" en "OK" in de volgende context menu. Als de weergegeven spoor is voorzien van de kenmerkende smFRET fasen (figuur 2) druk op de schakelknop "Niet geselecteerd" en de eersteselecteert u het tijdstip van het begin van de FRET-evenement door het bewegen van de lijn met de muis en klik op de linker muisknop. selecteert het volgende tijdstip van het bleken van het acceptormolecuul en tenslotte het tijdstip van het bleken van het donormolecuul. In het volgende venster de FRET efficiëntie is uitgezet in het blauw. Om de trace druk op de knop "Ja" anders kiezen "Nee". Om opnieuw toegang te krijgen tot een tijd trace klik op de "Terug" knop. Herhaal deze procedure tot de laatste molecuul van de film. Na analyse van de laatste molecuul in een film op te slaan de geselecteerde sporen door te klikken op "File | Save". Sla de geselecteerde sporen in dezelfde map als de * SIF-bestanden. Herhaal stap 5,10-5,13 voor alle verworven films. Voer het programma combine_fret_results.m. Selecteer de map met de * .res bestanden en alle * .FRETonly_trace bestanden. Sla het molecuul-wise FRET en het frame-wise FRET-bestanden als MW.dat enFRW.dat respectievelijk. LET OP: De * .dat bestanden worden opgeslagen als ASCII-bestanden. De FRW.dat bestand bevat zes kolommen en één rij voor elk FRET-frame. De zesde kolom bevat de gecorrigeerde frame wise FRET efficiency. De MW.dat bestand bevat 21 kolommen en een rij per geselecteerde FRET molecuul. De derde kolom bevat het molecuul-wise FRET efficiency. 6. Artikel smFRET Gegevens in Histograms Opmerking: Om de gemiddelde smFRET efficiëntie van alle opgeslagen data smFRET het frame-wise data of molecuul-wise data zijn uitgezet in histogrammen en geanalyseerd middels Gaussische past op (meervoudige) pieken extraheren. Hierna het protocol gebruikt een commercieel data analysesoftware (zie Materialen List). Echter, elke andere beschikbare software worden gebruikt. Open een data-analyse software (zie Materials List). Klik op File | Import | meerdere ASCII. Selecteer de map met het FRW.dat bestand. Selecteer het bestand en druk op "OK & #34 ;. Accepteer de input optie met "OK" zonder een verandering. Selecteer de derde kolom C (Y) met de gecorrigeerde FRET efficiëntie, met de rechtermuisknop op de kolom en selecteer Plot | Statistieken | Histogram. In het histogram venster dubbelklikt u op de kolommen en verwijder het vinkje "automatische binning" en selecteer een gewenste bin-size, bijvoorbeeld 0,05. Kies ook begin en einde waarden, bijv, -0,025 en 1,025. Selecteer de kolommen van het histogram door met de linkermuisknop te klikken op hen. Klik met de rechtermuisknop en kies "ga naar Bin werkblad". Selecteer de kolom "Counts" door met de linkermuisknop op te klikken en klik met de rechtermuisknop en kies Plot | Column / Bar / Pie | Column. In de kolom bar plot naar Analyse | Montage | lineaire curve fit | Open dialoog. Kies "Gaussian" onder Function ga dan naar het "Parameter" ruiter. Hef de selectie van auto-parameter initialisatie. Bevestig de offset-waarde (y0) op 0. Klik op "Fit". OPMERKING: De aanpassingsfunctie en de fitting destaarten worden nu weergegeven in de plot kolom. De "xc" waarde geeft het centrum van de aanpassingsfunctie, dat wil zeggen, de gemiddelde FRET efficiëntie die dient als invoerparameter voor de NPS software. 7. Meting van de kwantumopbrengst Voer kwantumopbrengst bepalen met de bijbehorende werkwijze vergelijkbaar met de door Würth et al procedure. 35, gebruik Rhodamine 101 opgelost in ethanol (QY = 91,5%) als een standaard. Neem absorptiespectra in een UV-VIS-spectrometer met een 80 pl volume per absorptie cuvet van 1 cm lengte pad. De absorptie bij de golflengte die wordt gebruikt voor fluorescentie excitatie moet ≤ 0,05. Record emissiespectra op een lamp gekalibreerd spectrometer bedreven in foton-telmodus. Voer de metingen met Glan-Thompson polarisatoren in de excitatie (0 °) en emissie (54,7 °) pad (magic angle omstandigheden) met behulp van een spectr al bandbreedte van ongeveer 5 nm en 2,5 nm voor excitatie en emissie monochromator, respectievelijk. Maatregel monsters na het overzetten naar een fluorescentie cuvette met 3 mm weglengte zorg ervoor dat de telling niet meer bedraagt dan 10 6 s -1. Bereken kwantumopbrengst volgens waarbij n en n Std zijn de brekingsindices van het oplosmiddel van het monster en de standaard, respectievelijk. f (λ) en f_Std (λ) de fluorescentie-intensiteit van het monster en de standaard bij de golflengte λ. A (λ ex) en A std (ex λ) de absorptie van het monster en referentie bij de excitatiegolflengte en Φ std is de kwantumopbrengst van de standaard. le "> 8. Berekening van de isotrope Förster Radius Bereken de straal isotrope Förster ( ) Vanaf het emissiespectrum van de donor molecule, het absorptiespectrum van de acceptor molecule, de kwantumopbrengst van de donor en de brekingsindex van het medium. Gebruik de freeware PhotochemCAD voor de berekening van . Echter andere beschikbare software kan in plaats daarvan 36 worden gebruikt. 9. Meting van de anisotropie Bepalen steady-state fluorescentie anisotropie van opnames van fluorescentie spectra met verschillende excitatie- / emissie polarisator instellingen (V / V, V / H, H / V, H / H) 36. Bereken de G-factor, die corrigeert voor polarisatie artefacten van het instrument, voor elke golflengte van deverhouding en gebruiken om de anisotropie voor elke golflengte te berekenen: waar ik xy geeft de intensiteit voor excitatie polarisatie x en emissie polarisatie y. Het gemiddelde van de waarden die aan de overkant van de emissie spectrale bereik van de steady-state fluorescentie anisotropie te berekenen. 10. Installatie van Fast-NPS Software Download UCSF Chimera uit http://www.cgl.ucsf.edu/chimera en volg de installatiehandleiding. Ga naar de website van het "Institute of Biophysics"bij Ulm University: https://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html. Download de huidige versie van Fast-NPS en pak het uit naar een map naar keuze. Open de submap "Redistributable" en installeer de Visual C ++ Redistributable die geschikt is voor het systeem. 11. centreren pdb File Open het pdb file (s) van belang bij Chimera. Selecteer alle atomen van de macromoleculaire complex en bereken de coördinaten van het zwaartepunt (Extra | Structuur Analyse | Bijlen / Planes / centroïdes | Define zwaartepunt … | Ok). Open het antwoord Log (favorieten | Antwoord Log) en de Transformation Tool (Extra | Beweging | Transform Coördinaten). Voer de coördinaten van de in het antwoord Log in het tekstvak "Shift" van het venster Transform Coördinaten zwaartepunt en verander het teken van elke coördineren. Druk op "Apply" en sla het bestand met de "Save PDB" (File | Save VOB). 12. Instellinghet Position Priors LET OP: Alle waarden worden beschouwd in Angstrom. Start de technical computing taal en de huidige map wijzigen om de lokale Fast-NPS map. Voer in het commando venster: FastNPS. Maak een nieuwe jobfile in de Project Manager (Project | Nieuw). Stel de positie voorafgaand (Extra | Model kleurstof voorafgaand). In het panel "voorafgaande basics" van de ruimtelijke resolutie van het standpunt te bepalen voorafgaand door het invoeren van zijn waarde (2 wordt aanbevolen). Uitsluiten het interieur van het macromolecuul door het activeren van het selectievakje en te klikken op de "load VOB" knop. Selecteer en de gecentreerde pdb bestand te laden zoals beschreven in paragraaf 11. Geef de geschatte diameter (13 A wordt aanbevolen, zie bespreking) van de kleurstof door het invoeren van de waarde ervan. Voer een skeletvorming afstand, dat wil zeggen, de afstand die de kleurstof molecuul kan doordringen in de macromolecule (2 A wordt aanbevolen). In depanel "maximale voorafgaand size" voert u de minimale en maximale coördinaten van de situatie vóór (aanbevolen: x in [-150.150], y in [-150.150] en z in [-150.150]). Bij het definiëren van een satelliet, activeer de checkbox "attachment via flexibele linker" in het panel "voorafgaande basics" en voer in het paneel "linker" de coördinaten van het atoom (in de gecentreerde pdb-bestand) waarmee de kleurstof molecuul is bevestigd. Verder geeft u de lengte en de diameter van de linker door het invoeren van hun waarden (13 A en 4,5 A worden aanbevolen, zie bespreking). In het geval van een antenne overslaan dit punt. Druk op de knop "bereken toegankelijk volume". Sla de situatie vóór en eventueel exporteren voor visualisatie doeleinden met behulp van software zoals Chimera. 13. Het definiëren van de Network Geometry Open het definiëren Measurement Window (Modus | bewerken Geometry). Maak een nieuwe kleurstof molecuul door te drukken op de kontop "Nieuw" in het panel "Kleurstoffen". Stel de fluorescentie anisotropie (hoofdstuk 9) door het invoeren van een waarde in en selecteer een kleurstof model binnen het dropdown menu "Dye-model". Druk op de knop "Load", selecteert u de overeenkomstige positie vóór en vink het vakje activeren van de kleurstof. Herhaal deze procedure voor alle kleurstoffen, dwz voor alle antennes en voor alle satellieten. Na het aanmaken van alle kleurstoffen, bepalen de metingen. Maak een nieuwe meting door te klikken op "Nieuw" in het panel "Metingen". Selecteer haar FRET partners in het dropdown menu's "Dye1" en "Dye2" hieronder. Voer de smFRET efficiency met fout en de isotrope Förster radius van deze kleurstof pair. Ten slotte, controleer dan de activeren selectievakje van de meting. Herhaal deze procedure voor alle metingen. OPMERKING: Vaak het netwerk wordt steeds complexer, zodat de gebruiker in de war zou kunnen krijgen. Om en om te voorkoment fouten, controleer het netwerk visueel door op de "Check Network" knop. De figuur toont de geactiveerde kleurstoffen en geeft metingen via leidingen onderling verbinden van de FRET-kleurstoffen. 14. Berekening Open het Calculation venster (weergave | Calculation). Als elke kleurstof in het netwerk een specifiek model toegewezen, selecteert u "User defined" en start de berekening door te drukken "Calculation". Om alle kleurstoffen in hetzelfde model, selecteert u één van de vijf modellen (klassiek, iso, meanpos-iso, var-meanpos-iso en var-meanpos) en ga verder. OPMERKING: Het venster commando zal de voortgang van de berekening te geven. Fast-NPS zal dat doen met een pop-up bericht, wanneer de berekening is voltooid. 15. Visualisatie van de resultaten Met het oog op de geloofwaardige volumes van de kleurstoffen te exporteren, de View Results venster te openen (Model | Bekijk resultaten). Export kleurstofdensiteiten: Exporterenkleurstoffen afzonderlijk of allemaal tegelijk. Met het oog op export een enkele kleurstof selecteert u deze in het paneel "Weergegeven Kleurstoffen" en druk op "Export Density". Voer een resolutie (2 wordt aanbevolen) en kies een bestandstype voor de export. Rechts de dichtheid voorbeelden en sommige van de wiskundige kenmerken ervan zijn. Om te exporteren alle kleurstoffen gelijktijdig duwen "Batch Export". Open de resulterende dichtheid bestanden in Chimera. 16. Consistentie controleren van gekozen model Combination Open het View Results Window (Model | Bekijk resultaten). Als in het panel "Calculation Info" het tekstvak "Consistency" geeft een waarde van minder dan 90% van de huidige model niet voldoende vertegenwoordigen de gemeten smFRET efficiëntie en is dus inconsistent. In het geval van inconsistentie druk op de knop "Gedetailleerde Consistency". Zoek de metingen die een waarde onder de 90% hebben. Indien een of meer kleurstofs zijn voornamelijk betrokken bij deze metingen, de modellen waarschijnlijk een inconsistentie veroorzaken. Overweeg verschillende kleurstof modellen voor deze kleurstoffen en voer de Fast-NPS berekening.

Representative Results

Transcriptie is de eerste stap in genexpressie in alle organismen. In Archaea, wordt transcriptie door één RNA-polymerase (RNAP) uitgevoerd. Ten opzichte van eukaryoten, de Archaea RNAP draagt een opvallende structurele gelijkenis met hun eukaryote tegenhangers, terwijl met een eenvoudiger transcriptie machines. Aldus kan Archaea worden gebruikt als een modelsysteem voor de eukaryote transcriptie-initiatie door RNA polymerase bestuderen II (Pol II). Onlangs heeft de volledige architectuur van de Archaea RNA-polymerase geopende complex is vastgesteld op basis van single-molecule FRET en NPS. De gegevens uit NPS analyse werd gebruikt om een model van de volledige Archaea geopend promotor complex dat bruikbaar inzicht geeft in de werking van transcriptie initiatie bouwen. Om deze structuur op te helderen, werden smFRET rendementen gemeten tussen onbekende antenne kleurstofmoleculen gelegen binnen de open promotor complex en verschillende bekende satelliet kleurstofmoleculen die op vijf referentie-sites in de RNAP, waarvan de posities zijn bekend uit kristallografische structuren (pdb-ID: 2WAQ) werden opgenomen 37. De antenne kleurstoffen werden vastgemaakt aan één van verschillende posities op de niet-matrijs-DNA, TFB, TBP of TFE. Totale netwerk gebruikt in deze studie bestond uit meer dan 60 gemeten afstanden. Figuur 7 toont het model van de volledige Archaea geopend promotor complex gebouwd van de NPS-analyse. Het omvat de dubbelstrengs promotor DNA (licht en donker blauw), het RNA-polymerase (grijs) en de transcriptie initiatie factoren TBP (paars), TFB (groen) en TFE (geel). Het model wordt gesuperponeerd met de resultaten van de NPS analyse, de geloofwaardige volumes, die werden berekend met het klassieke model (A), het iso-model (B), de meanpos-iso-model (C), de var-meanpos-iso model (D) en de var-meanpos model (E). Figuur 1: Workflow van de overname en de verwerking van de parameters die nodig zijn voor de Fast-NPS berekening. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Voorbeelden van fluorescentie-intensiteit tijd spoor van een smFRET evenement. De fluorescentie-intensiteiten van de donor (groen) en het acceptormolecuul (rood) van de drie karakteristieke fasen: I: smFRET, II: donor fluorescentie na fotobleken acceptor, III: achtergrondfluorescentie donor na fotobleken.g2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Schematische weergave van de stromingskamer voor smFRET experimenten. De stroom kamer wordt op een op maat gemaakte metalen houder met acryl glazen houders gemonteerd. Het sandwich-ontwerp van de stromingskamer omvat een kwartsglas (fused silica) schuiven met twee gaten voor de bevestiging en uitlaat slang, een afdichtingsfolie en een dekglaasje dat de stromingskamer gesloten. Het prisma voor TIRF verlichting wordt op de onderste helft van de stroom kamer gemonteerd. Hollow tab schroeven zorgen voor de inlaat en uitlaten voor de stroom kamer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt = "Figuur 4" src = "/ files / ftp_upload / 54782 / 54782fig4.jpg" /> Figuur 4: Bereiding van het kwartsglas glijbaan en het afsluitfolie. Mechanische tekening van het kwartsglas slede waarop de plaats van de openingen (in mm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Mechanische tekening van de stroom kamer. De maatregelen voor de aluminium prisma houder, acryl glazen houders en aluminium montageframe worden gegeven in millimeters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. IGUUR 6 "src =" / files / ftp_upload / 54782 / 54782fig6.jpg "/> Figuur 6: Schematische weergave van het prisma-type TIRF setup voor smFRET experimenten. Afkortingen voor optische componenten: A, opening; DM, dichroïsche spiegel; F, emissie-filter; L, lens; M, spiegel; O, objectief; P, prisma; PSD, positiegevoelige fotodiode; S, monster; PS, positionering stadium; T, telescoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 7: Simulatie resultaten van de verschillende modelveronderstellingen. Alle foto's tonen de Archaea RNA-polymerase (pdb-ID: 2WAQ, bovenaanzicht) samen met het model voor promotor DNA (TDNA en ntDNA in blauw en cyaan, respectievelijk), TBP (paars), TFB (groen) en TFE (geel)in de Archaea openen complex 30. De geloofwaardige volumes worden gelegd voor de NPS simulatie resultaten van (A) het klassieke model, (B) de iso-model, (C) de meanpos-iso-model, (D) de var-meanpos-iso-model en (E) de var -meanpos model. Alle volumes worden getoond bij 68% geloofwaardigheid. De klassieke en de var-meanpos netwerken zijn in overeenstemming met de smFRET data. In tegenstelling netwerken waarbij voor alle kleurstoffen de iso, meanpos-iso of de var-meanpos-iso-model wordt gekozen in strijd zijn met de gemeten data. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

We presenteren de opzet en experimentele procedure nauwkeurig te bepalen FRET efficiënties tussen kleurstoffen verbonden via flexibele linkers aan biomacromoleculen, dwz, nucleïnezuren en / of eiwitten.

Om te garanderen smFRET nauwkeurige metingen (paragraaf 3), is het cruciaal om lucht uit de stromingskamer dat op elk moment tijdens de meting. Bovendien, zorg ervoor dat niet te veel stroom kamer met fluoroforen. De fluoroforen moeten duidelijk gescheiden om een correcte analyse te waarborgen. Zoals smFRET paren, die niet bleken van de donor vertonen hebben van de analyse uitgesloten, ervoor zorgen dat> 80% van de moleculen in het gezichtsveld worden gebleekt op het einde van de film. Om rekening te houden inhomogeniteiten in het monster de β-factor en de γ-factor corrigeren van overspraak en relatieve detectie efficiency van de donor en acceptor kanaal respectievelijk worden voor elk afzonderlijk FRET paar.

<p class= "Jove_content"> De camera-instellingen (integratie tijd, electron multiplier gain, voorversterker gain en uitlezing tarief in paragraaf 3.9 beschreven) moet worden ingesteld op waarden van het geven van de beste afweging tussen de signaal-ruisverhouding, dynamisch bereik en tijdsresolutie. Ze moeten opnieuw worden afgesteld voor verschillende experimenten of andere hardware wordt gebruikt. Het aantal frames moeten hoog genoeg zodat het merendeel van de donor moleculen bleken binnen de observatietijd worden.

Voor de metingen van de fluorescentie spectrometer (Secties 7 tot 9) een goed compromis tussen de signaalintensiteit en de spectrale resolutie van de geregistreerde gegevens worden gevonden. Daartoe de sleuven in de excitatie en emissie route van de fluorescentie spectrometer hebben afhankelijk van het gebruikte instrument en het monster concentratie worden aangepast.

Bovendien presenteren we de Fast-NPS analysemethode om structurele informatie van voorbijgaande of dynamische Macrom verkrijgenolecular complexen. NPS is toegepast op het pad van de niet-matrijs-DNA-streng en de positie van transcriptie initiatie factoren in het archeale RNA polymerase geopend complex onthullen. Via het netwerk van meer dan 60 verschillende afstandsmetingen we aangetoond dat Fast-NPS, voorzien van een nieuw geïmplementeerde sampling engine (Dave, T., Beckers, M., Drechsler, F. & Michaelis, J. in voorbereiding), vermindert de tijd die nodig is voor de analyse van dit complex smFRET netwerk ≈2 orden van grootte in vergelijking met de oorspronkelijke globale methode NPS ^27. robuustheid van het algoritme is geworteld in een Metropolis-within-Gibbs sampler gecombineerd met een parallel tempering regeling. Fast-NPS toont exacte reproduceerbaarheid van het netwerk van de resultaten en stemt overeen met de resultaten eerder ³⁰ gepubliceerd.

Verschillende methoden zijn gepubliceerd gericht op structurele informatie afleiden uit smFRET metingen ¹¹ </s^up>, ^{^12,} ^{^13,} ^{^14,} ^{^15,} ^{^16,} ^{^17,} ^18. Al deze benaderingen slechts één specifieke kleurstof model. Aldus kleurstoffen, die de aannames van die modellen voldoen, kan niet worden gebruikt of leiden tot vals structurele informatie. Snel NPS daarentegen, maakt het mogelijk om kiest per kleurstofmolecuul een ander model. Dit helpt om rekening te houden verschillende conformationeel gedrag van zowel de kleurstof molecuul zelf, evenals de linker voor de bevestiging. De lokale omgeving van de moleculaire kleurstofmolecuul, evenals de fysische eigenschappen bepalen welk model het meest geschikt is.

Voor de geanalyseerde smFRET netwerk van de Archaea initiatiecomplex, een isotrope aanname voor kleurstofmoleculen leidt tot een drastische afname in de grootte van de geloofwaardige volumes in vergelijking met het klassieke model. In combinatie met een dynamische functie gemiddeld voor verfmoleculen de mediaan van alle geloofwaardige volume maten (95%) beperkt tot minder dan 0,5 nm ^3. Echter, deze kleurstofmolecuul posteriors zijn niet meer met hun smFRET metingen aangeeft dat de veronderstellingen leiden tot vals structurele informatie. In tegenstelling, de in het klassieke model posteriors zijn consistent met de bepaalde smFRET efficiëntie.

Van de hypothese van isotrope en / of dynamische functie gemiddelde voor alle kleurstoffen leiden tot inconsistenties Fast-NPS maakt kleurstofmolecuul prioren waarbij elke kleurstof kan worden toegewezen een van de vijf modellen. Elk model maakt gebruik van dezelfde toegankelijke volume. Het algoritme voor de berekening van de kleurstof AVS maakt aantal aannamen. Eerst wordt de ruimtelijke vorm van de fluorofoor is benaderd door een bol. Dus een diameter inachtneming wid het fluorofoor'sth, hoogte en de dikte moet worden gebruikt (artikel 12). Verder is het verbindingsstuk van vorm benaderd door een flexibele stang. De in artikel 12 waarden werden berekend voor de kleurstof Alexa 647 gekoppeld via een 12-C linker. Tot op heden is het niet mogelijk om nauwkeurig te bepalen a priori welk model het meest geschikt is, aangezien een experimentele geometrie, en dus alle modellen worden getest. In het algemeen zal men het model dat de kleinst mogelijke afmetingen geeft achterste kiezen, terwijl het nog steeds in overeenstemming met de gegevens. Nagaan modelkeuze is met de smFRET data berekenen we zowel het achterste en de waarschijnlijkheid. Consistentie betekent dat meer dan 90% van de vanuit het achterste monsters binnen het 95% betrouwbaarheidsinterval van de waarschijnlijkheid.

Hoewel het waar is dat hoe lager de anisotropie, hoe kleiner de afstand onzekerheid in een netwerk smFRET geometrische opstellingen van de kleurstofmoleculen moeten ook in aanmerking worden genomen. Dus, terwijl representing kleurstofmoleculen met een lage fluorescentie anisotropie met een iso-model is een typische eerste keus, de consistentie test geeft een meer directe manier voor het selecteren van de juiste kleurstof model. De optimale keuze van kleurstof modellen kunnen leiden tot een drastische verhoging lokalisatie precisie en tegelijkertijd behouden consistentie van het netwerk met FRET data.

Om samen te vatten, Fast-NPS maakt het mogelijk om structurele en dynamische informatie van grote macromoleculaire complexen te krijgen. In tegenstelling tot normale structuur werkwijzen zoals x-ray kristallografie of cryo elektronenmicroscopie dit voeren ter controle zeer flexibele of transient complexen, dus sterk verruimen onze mechanistisch begrip van complexe biologische processen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank B. Gruchmann for the mechanical drawings of the flow chamber. Further, we want to express our gratitude to Max Beckers and Florian Drechsler for insightful comments and discussions regarding NPS and the underlying sampling engine.

Materials

Flowchamber preparation
Customized metall sample holder	self-built	n/a
quartz-glass slides, 76 x 26 mm	Technical Glass Products	26007
coverslips, 60 x 24 mm	Marienfeld	101242
detergent, Hellmanex II	Hellma	320.001
ultra-pure water from Synergy UV	Millipore	2512600
Zepto plasma cleaner	Diener	n/a
(3-aminopropyl)-triethoxysilane, p.a.	Sigma-Aldrich	A3648
methoxy PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa	Laysan Bio Inc.	MPEG-SVA-5000-1g
biotinylated PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa	Laysan Bio Inc.	BIOTIN-PEG-SVA-5000
Sodium biocarbonate	Sigma-Aldrich	S5761 Sigma
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S2127 Sigma-Aldrich
sealing film (Nescofilm)	Fisher Scientific	12981805
Tygon Flexible Silicone Tubing, 0.8 mm ID, 2.4 mm OD	Saint-Gobain Performance Plastics	720958
Fine-Bore Polyethylene Tubing, 0.58 mm ID, 0.96 mm OD (Smiths Medical)	Fisher Scientific	12665497
Neutravidin	Life Technologies	A2666
Name	Company	Catalog Number	Comments
Total internal reflection fluorescence microscope
Nd:YAG Laser, 532 nm	Newport Spectra-Physics	EXLSR-532-100-CDRH
diode-pumped solid-state laser, 491 nm, Calypso	Cobolt	904010050
diode laser 643 nm, iBeam smart	Toptica	iBEAM-SMART-640-S
dichroic mirror, 532 RDC	Chroma	F33-540
dichroic mirror, 476 RDC	Chroma	F33-476z
acousto-optic tunable filter	AA Opto-Electronic	AOTFnC-VIS
plano-convex cylindrical lens, f = 75 mm	Thorlabs	LJ1703L1-A
plano-concave cylindrical, f = -300 mm	Thorlabs
prism, PS 991	Thorlabs	PS991
focussing lens, f = 75 mm	Thorlabs	LA1608-B
syringe pump, PHD 2000	Harvard Apparatus	70-2002
2 stepper motors, Z812B	Thorlabs	Z812B
piezoelectric actuator, PE4	Thorlabs	PE4
IR diode laser	Edmund Optics	CPS808	part of the autofocus system
dichroic mirror, 775 DCXR	Chroma	775 DCXR
position-sensing detector (PSD), PDP90A	Thorlabs	PDP90A	part of the autofocus system
water-immersion objective, Plan Apo 60X WI, NA 1.2	Nikon		MRD07601
dichroic mirror, 645 DCXR	Chroma	645 DCXR	part of the emission pathway
emission filter, 3RD550-510	Omega Optical	3RD550-510	green channel in the emission pathway
emission filter, 3RD660-760	Omega Optical	3RD660-760	red channel in the emission pathway
EMCCD camera, iXon+ DU897EBV	Andor	AND-20-00032
EMCCD camera, iXon3 DU897D-BV	Andor	AND-20-000141
Name	Company	Catalog Number	Comments
Miscellaneous
Varian 50	Cary		UV-VIS spectrometer
Fluorolog2	SPEX		fluorescence spectrometer
Solis (V4.15)	Andor		control software for the EM-CCD camera
Apt user utility (V1.022)	Thorlabs		control software for the piezo-motors
Norland Optical Adhesive 68	Thorlabs		adhesive
PC-AFN-0.8 Nile red	Kisker Biotech		avidin-coated fluorescent multispec beads
Matlab	Mathworks		technical computing language for custon written software
Origin (V9.0)	Originlab		scientific graphing and data analysis software
Hellma 105-202-15-40	Hellma	105-202-15-40	absorption cuvette of 1 cm path length
Hellma 105-251-15-40	Hellma	105-251-15-40	fluorescence cuvette with 3 mm path length

References

Cheng, Y. Single-Particle Cryo-EM at Crystallographic Resolution. Cell. 161, 450-457 (2015).
Garman, E. F. Developments in X-ray Crystallographic Structure Determination of Biological Macromolecules. Science. 343 (6175), 1102-1108 (2014).
Sali, A. Outcome of the First wwPDB Hybrid/Integrative Methods Task Force Workshop. Structure. 23, 1156-1167 (2015).
Hopfner, K. P., Michaelis, J. Mechanisms of nucleic acid translocases: lessons from structural biology and single-molecule biophysics. Curr Opin Struct Biol. 17, 87-95 (2007).
Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. High-speed AFM and applications to biomolecular systems. Annu Rev Biophys. 42, 393-414 (2013).
Neuman, K. K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5, 491-505 (2008).
Yildiz, A. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. Advances in Single-Molecule Fluorescence Methods for Molecular Biology. Annu Rev Biochem. 77 (1), 51-76 (2008).
Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).
Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).
Rasnik, I., Myong, S., Cheng, W., Lohman, T. M., Ha, T. DNA-binding Orientation and Domain Conformation of the E. coli Rep Helicase Monomer Bound to a Partial Duplex Junction: Single-molecule Studies of Fluorescently Labeled Enzymes. J Mol Biol. 336 (2), 395-408 (2004).
Andrecka, J. Single-molecule tracking of mRNA exiting from RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (1), 135-140 (2008).
Schröder, G. F., Grubmüller, H. FRETsg: Biomolecular structure model building from multiple FRET experiments. Comput Phys Commun. 158 (3), 150-157 (2004).
Margittai, M. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15516-15521 (2003).
Kalinin, S. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat Methods. 9 (12), 1218-1227 (2012).
Choi, J. N6-methyladenosine in mRNA disrupts tRNA selection and translation-elongation dynamics. Nat Struct Mol Biol. 23 (August 2015), 110-115 (2015).
Svensson, B. FRET-based trilateration of probes bound within functional ryanodine receptors. Biophys J. 107 (9), 2037-2048 (2014).
Stephenson, J. D., Kenyon, J. C., Symmons, M. F., Lever, A. M. L. Characterizing 3D RNA structure by single molecule FRET. Methods. (2016), 1-11 (2016).
Lee, N. K. Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation. Biophys J. 88 (4), 2939-2953 (2005).
McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules. Biophys J. 99 (3), 961-970 (2010).
Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J Struct Biol. 173, 497-505 (2011).
Schuler, B. Single-molecule FRET of protein structure and dynamics – a primer. J nanoboitechnology. 11, 1-17 (2013).
Choi, U. B. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat Struct Mol Biol. 17 (3), 318-324 (2010).
Dale, R. E., Eisinger, J., Blumberg, W. E. The orientational freedom of molecular probes. The orientation factor in intramolecular energy transfer. Biophys J. 26 (2), 161-193 (1979).
Kapanidis, A. N. Alternating-laser excitation of single molecules. Acc Chem Res. 38 (7), 523-533 (2005).
Muschielok, A. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).
Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the nano-positioning system to the analysis of fluorescence resonance energy transfer networks. J Phys Chem B. 115 (41), 11927-11937 (2011).
Andrecka, J. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase ii elongation complex. Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).
Treutlein, B. Dynamic Architecture of a Minimal RNA Polymerase II Open Promoter Complex. Mol Cell. 46 (2), 136-146 (2012).
Nagy, J. Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule. FRET and NPS. Nat Commun. 6, 6161 (2015).
Grohmann, D., et al. The Initiation Factor TFE and the Elongation Factor Spt4/5 Compete for the RNAP Clamp during Transcription Initiation and Elongation. Mol Cell. 43 (2), 263-274 (2011).
Beckers, M., Drechsler, F., Eilert, T., Nagy, J., Michaelis, J. Quantitative structural information from single-molecule FRET. Faraday Discuss. 184, 117-129 (2015).
Bennink, M. L. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nat Struct Biol. 8 (7), 606-610 (2001).
Chandradoss, S. D. Surface passivation for single-molecule protein studies. J Vis Exp. (86), e50549 (2014).
Würth, C., Grabolle, M., Pauli, J., Spieles, M., Resch-Genger, U. Relative and absolute determination of fluorescence quantum yields of transparent samples. Nat Protoc. 8 (8), 1535-1550 (2013).
Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
Korkhin, Y. Evolution of complex RNA polymerases: The complete archaeal RNA polymerase structure. PLoS Biol. 7 (5), (2009).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Dörfler, T., Eilert, T., Röcker, C., Nagy, J., Michaelis, J. Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System. J. Vis. Exp. (120), e54782, doi:10.3791/54782 (2017).

Automatically Generated