Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Thilo D&#246;rfler; Tobias Eilert; Carlheinz R&#246;cker; Julia Nagy; Jens Michaelis

doi:10.3791/54782

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochemistry

מידע מבני מ-מולקולה בודדת סריג ניסויים באמצעות מערכת ננו-המיצוב המהירה

Published: February 09, 2017

doi:

10.3791/54782

Thilo Dörfler*¹, Tobias Eilert*¹, Carlheinz Röcker¹, Julia Nagy¹, Jens Michaelis¹

¹Institute of Biophysics,Ulm University

Summary

We present the setup and experimental procedure to obtain smFRET data from large donor-acceptor networks with a TIRF microscope. The step-by-step analysis of these measurements with the Bayesian inference software Fast-NPS yields high-resolved structural information via the application of adapted dye models.

Abstract

Single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. Thereby, multiple smFRET measurements are used to localize an unknown dye position inside a protein complex by means of trilateration. In order to obtain quantitative information, the Nano-Positioning System (NPS) uses probabilistic data analysis to combine structural information from X-ray crystallography with single-molecule fluorescence data to calculate not only the most probable position but the complete three-dimensional probability distribution, termed posterior, which indicates the experimental uncertainty. The concept was generalized for the analysis of smFRET networks containing numerous dye molecules. The latest version of NPS, Fast-NPS, features a new algorithm using Bayesian parameter estimation based on Markov Chain Monte Carlo sampling and parallel tempering that allows for the analysis of large smFRET networks in a comparably short time. Moreover, Fast-NPS allows the calculation of the posterior by choosing one of five different models for each dye, that account for the different spatial and orientational behavior exhibited by the dye molecules due to their local environment.

Here we present a detailed protocol for obtaining smFRET data and applying the Fast-NPS. We provide detailed instructions for the acquisition of the three input parameters of Fast-NPS: the smFRET values, as well as the quantum yield and anisotropy of the dye molecules. Recently, the NPS has been used to elucidate the architecture of an archaeal open promotor complex. This data is used to demonstrate the influence of the five different dye models on the posterior distribution.

Introduction

קביעת המבנה של ביו-מולקולות היא תנאי מפתח להבנת תפקודו. שתי שיטות ומבוססות על קביעת מבנה הן במיקרוסקופ אלקטרוני cryo- ו רנטגן קריסטלוגרפיה ^{^1,} ^2. היום, שתי השיטות לספק מידע מבני ברזולוציה גבוהה עם רזולוציה עד לרמת אנגסטרום. שתי שיטות אלה נעשה שימוש נרחב על מנת להבהיר את המבנה של מולקולות ביולוגיות גדולות כמו קומפלקסים חלבונים. למרות השיטות קיימות שופרו ללא הרף לאורך כל העשורים האחרונים, את המורכבות של מבנים ביולוגיים עדיין מהוות אתגר גדול לביולוגיה מבנית, בפרט כאשר קומפלקסים גדולים, דינמיים חולפים נחקרים ^3.

כדי ללמוד את הדינמיקה של מתחמי macromolecular ומערכת היחסים פונקציית המבנה בפרט, יש מתודולוגיות מולקולה בודדת prov⁴ ided מידע שימושי. אסטרטגיות חדשות אחדות פותחו מתן גישה מאונכת על רכישת מידע מבני ודינמי. דוגמאות לכך הן במהירות גבוהה AFM ^5, מניפולציה מכאנית ^6, מיקרוסקופיה לוקליזציה קרינה ^7, כמו גם העברת מולקולה בודדת פורסטר תהודת אנרגיה (smFRET) ^{^8,} ^9. מאז די מוקדם על הסריג זכה לכינוי סרגל מולקולרי, בשל תלות המרחק בסולם אורך Biomacromolecules ^10.

אחת במיוחד יישום מעניין של smFRET הוא להשתמש במידע המרחק המתקבל מדידות smFRET להסיק מבניים מידע ^{^11,} ^{^12,} ^{^13,} ^{^14,} ¹⁵ </sup^>, ^{^16,} ^{^17,} ^{^18,} ^{^19,} ^{^20,} ^{^21,} ^{^22,} ^23. בשל ברזולוציה הגבוהה בזמן של smFRET, עמדת חלקים ניידים של מבנה חלבון יכולה להיות מקומית. עם זאת, על מנת לחלץ מידע כמותי מן הפרמטרים תיקון חשוב נתונים smFRET על מולקולות צבע צריך להיקבע בזמן המדידה ^24. עם גורמי תיקון אלה, הסריג היעיל E _הסריג ניתן לחשב באמצעות הנוסחא

,

איפה אני _A ו- _D אני </s UB> הם עוצמות הקרינה של התורם לבין מולקולת acceptor, בהתאמה (ראה איור 2). Β-הגורם מהווה צולבות לדבר, הדליפה של פליטת תורם לתוך תעלת acceptor והוא מחושב על ידי

איפה אני _A ו- _הייתי הם עוצמות הקרינה של התורם לבין מולקולת acceptor לאחר צילום לבן של מולקולת acceptor.

The-גורם γ מתקן את ההבדל היעיל הגילוי ביחס בשני הערוצים, כמו גם את ההבדלים בתשואת קוונטי הקרינה של התורם לצבוע acceptor. זה מחושב מכל שמץ זמן מסוים על-ידי

שים לב, כי תיאור זה מזניח עירור ישיר של מולקולת acceptor, שלעתים הופכת להיות חשובים והיה צורך לתקן גם כן. לקביעת גורמי תיקון אלה כדאי לעורר הן התורם וכן acceptor ב בסכימת לסירוגין ²⁵ כדי להבחין בין שינויים בתמונה-פיזית דינמיקה מבנית.

על מנת לא רק להשיג יעילות smFRET כמותית אלא גם מידע מבני כמותית, מערכת ננו-המיקום (NPS) הוצגה בשנת 2008 ^26. השם נבחר על סמך הדמיון שלה אל מערכת המיקום הגלובלית מבוסס לווין (GPS). NPS היא טכניקה היברידית המשלבת smFRET ונתונים קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן עבור לוקליזציה של עמדות לצבוע ידוע מתחמי biomacromolecular. גמבנה rystal משמש מסגרת התייחסות ותוצאות smFRET משמשות לקבלת מידע המרחק בין עמדת fluorophore ידועה (אנטנה) ועמדה הידועה מן המבנה הגבישי (לווין). בניסויים רצופים המרחקים בין האנטנה לבין מספר לווינים נמדדים ואת המיקום של האנטנה נקבע באמצעות ערכת ניתוח קפדנית סטטיסטי על סמך הערכת פרמטר בייס. כתוצאה מכך, לא רק את המיקום הסביר ביותר של האנטנה חושב, אבל הפצת הוודאות המלאה 3D שלה, האחורי מה שנקרא, מדמיין ידי כרכים אמינים. יתר על כן, NPS הורחב כדי לאפשר ניתוח של רשתות smFRET שלמה ^27.

NPS נעשה שימוש כדי לפתור מספר שאלות חשובות בתעתיק איקריוטיים, כלומר במהלך DNA במעלה הזרם, ה- DNA הלא התבנית ואת mRNA המתהווה בתוך שיתוף התארכות RNA פולימראז II¹² ^mplex, ^28, גם הוכחת השפעת ייזום שעתוק גורמי ²⁶ והארכיטקטורה הדינמית של ²⁹ פתוח promotor מורכב. יתר על כן, NPS שימש על מנת להבהיר את המבנה של המתחם פתוח RNA פולימראז archaeal ³⁰ ובמיוחד עמדת TFE גורם ייזום שעתוק, אשר נקשר תחרותי לאותו אתר כגורם התארכות שעתוק Spt4 / 5 ^31.

מאז, מספר גישות מבנה המבוסס smFRET פורסמו ^{^15,} ^{^18,} ^{^21,} ^23. בהשוואת שיטות מבניות שונות המבוססות smFRET, מתברר כי הדיוק לכאורה של השיטה תלוי מאוד על בחירה המסוימת של מודלים לצבוע. יש לציין כימולקולות צבע עשויות להפגין התנהגות מרחבית orientational שונה, בהתאם לסביבה המקומית שלהם.

לשם כך, Fast-NPS הוצג ^32. -NPS המהיר משתמש אלגוריתם דגימה מתקדם הפחתת פעמי החישוב באופן דרסטי. יתר על כן, Fast-NPS מאפשר לבצע ניתוח מבני עבור כל מולקולה לצבוע המשתמש יכול לבחור מתוך סדרה של חמישה דגמים לצבוע שונים שתתואר הבא. המודל השמרני ביותר, שנקרא קלאסי, מניח כי לצבוע תופסת רק אחד, אבל לא ידוע, עמדה. בעמדה זו, fluorophore יכול לסובב בחופשיות בתוך חרוט, שגודלם נקבע מ (תלוי זמן) אנאיזוטרופיה הקרינה שלו בהתאמה. האורינטציה של החרוט אינה ידועה, אשר מובילה חוסר ודאות גדולה בעת המרת יעילות smFRET נמדדה לתוך מרחקים. מבחינה זו, המודל הוא שמרני, שכן הוא יוביל את הדיוק הקטן ביותר בהשוואה למצב הצבע האחרls. רק למרחקים קצרים מאוד צריך את ההנחות ביתרון המודל הקלסי קביעת עמדה שגויה באופן ניכר. עבור ערכי smFRET טיפוסיים, המיקום הנכון הוא מוקף תמיד בהיקף האמין יחסית הגדול.

עם זאת, מאז דיוק גבוה רצוי, חשוב לפתח ולבחון מודלי צבע חלופיים, אשר יכול לעזור לשפר את הדיוק. אם לצבוע מסתובב הרבה יותר מהר מאשר בחי הקרינה הכרוכים בו, מודל iso מה שנקרא יכול להיות מיושם. כאן, הגורם אוריינטציה κ ² (נדרש לחישוב רדיוס פורסטר איזוטרופיים מאפיין ) מוגדר 2/3. כתוצאה מכך, היקפי אמינה מחושב כמעט בשני סדרי גודל קטנים יותר בהשוואה לאלו במודל הקלאסי ^32. במקרה כי fluorophore נמצא בסביבה המאפשרת לא רק reori מהרentation, אלא גם תנועה מהירה בכל רחבי ההיקף הנגיש שלה, מודל meanpos-ISO אמור לשמש. במודל זה, לצבוע התופסת ביעילות רק עמדה אחת כלומר, איפה מיצוע מרחבי מטופלת על ידי מרת מרחק פולינום ^15. מודל זה חל אם למשל לצבוע (הידרופובי נפוץ) מצורף אזור הידרופילי, למשל, ה- DNA. יישום של מודל meanpos-iso מוביל לירידה נוספת בגודל של הכרכים האמינים בפקטור של שני כ. עם זאת, צבע הקשור חלבון עלול להיקשר הפיך תיקונים הידרופובי מספר נפחיו sterically הנגישים (AV). Fluorophore כי בוררים מיידי בין אזורים אלה, אך בתוך אזור אחד עובר סיבוב חופשי ותנועה מקומי מהר מתוארת בצורה הטובה ביותר על ידי מודל var-meanpos-ISO. לקבלת במצב דומה שבו לצבוע אינו חופשי לסובב את המודל var-meanpos חל. עוד ד etails על מודלים אלה ניתן למצוא בפרסום האחרון שלנו ^32.

מודלים אלה מספקים רפרטואר נרחב לתת דין וחשבון במיוחד עבור הסביבות השונות צבע עשוי להיתקל וליישם אותם בתבונה מייעלת דיוק הלוקליזציה שלה. ב Fast-NPS כל מולקולה לצבוע מצורף למקום מסוים ניתן להקצות מודל פרט, כך-שותפי סריג רשאים יש דגמים שונים. זה מאפשר מודלים בלתי מוגבלים וקרובים לטבע. עם זאת, חשוב כי אחד מבצע בדיקות סטטיסטיות קפדניות על מנת להבטיח כי התוצאות המתקבלות על ידי שילוב המודל הסופי עדיין הסכם עם נתוני הניסוי. בדיקות אלה כלולים בתוכנה Fast-NPS.

על מנת ליישם Fast-NPS נתוני ניסוי למדידה (רק) שלושה פרמטרי קלט נדרשה. ראשית, רדיוס איזוטרופיים פורסטר ספציפי-זוג לצבוע (/54782/54782eq5.jpg "/>) צריך להיקבע. לכן, תשואת הקוונטים (QY) של צבע התורם, ספקטרה פליטת הקרינה התורמת ואת ספקטרום קליטת acceptor צריכות להימדד. מדידות אלה יכולים להתבצע בתפזורת, באמצעות ספקטרומטר סטנדרטי ספקטרומטר הקרינה סטנדרטי. עבור כל זוג, R ₀ לאחר מכן מחושב באמצעות PhotochemCAD freeware וניתן להשתמש בניתוח NPS. יתר על כן, (זמן נפתרה) הקרינה anisotropies של מולקולות צבע צריך עם זאת כדי להשיג באמצעות קיטוב (וזמן) ספקטרומטר קרינה הרגיש., פרמטרי התשומה החשובים ביותר עבור Fast-NPS הם יעילים smFRET נמדדת על התקנה מיקרוסקופ פלואורסצנטי מולקולה בודדת, כגון מיקרוסקופ פלואורסצנטי החזרה הגמור (TIRFM) .

כאן, אנו מציגים צעד-אחר-צעד פרוטוקול לקבלת נתוני smFRET ויישום מהיר-NPS (איור 1).

Protocol

תנאים מוקדמים 1. וציוד מעבדה הערה: ההרכבה של חדר המדידה מתוארת באיור 3. הכריך-העיצוב של חדר המדידה מורכב משלושה מרכיבים עיקריים: זכוכית קוורץ (סיליקה התמזגה) שקופיות, סרט איטום ו coverslip האוטמת את תא הזרימה. תא המדידה הוא רכוב על בעל מדגם אישית. הממדים של החדר המדגם בעל מתכת מיועדים להתאים לשקופית זכוכית קוורץ מיקרוסקופיה סטנדרטית (76 מ"מ x 26 מ"מ). Cut קוורץ שקופיות זכוכית באמצעות מקדח יהלום (0.75 מ"מ) על עמדות מופיעות באיור 4. העיצוב של שקופיות זכוכית קוורץ הוא סימטרי על מנת להבחין בין שני הצדדים של כל שקופית. הערה: שקופיות קוורץ יכול להיות שימוש חוזר לאחר המדידה עד פני השטח הופך שרוט. כדי לעגן את החדר, להשתמש מחזיקי מדגם מתכת אישית כמתואר באיור 5 </ Strong>. מחזיקי המדגם מכילים שני נושאים (M4) כדי לחבר מפרצון צינורות מוצאים תא הזרימה. יתר על כן, להשתמש אשכולות (M3) לעלות לתא המדגם על בעל המתכת כמו גם נושאים (M3) לתקן את בעל מנסרה על אל החלק התחתון של בעל המתכת. לבצע את המדידות smFRET על מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת סוג פריזמה (TIRFM) (איור 6). הערה: TIRFM כולל שלושה לייזרים: ירוק (532 ננומטר, Nd: YAG) ו לייזר אדום (643 ננומטר, לייזר דיודה) עבור עירור של התורם מולקולות צבע acceptor וכן לייזר כחול (491 ננומטר , לייזר מצב מוצק שאוב דיודה) עבור הלבנת זיהומים ניאון רקע על החדר המדגם לפני המדידה smFRET. השלוש קרנות הליזר משולבות מרחבית ניתן לבחור באמצעות מסנן מתכונן acousto האופטי (AOTF). אור הקרינה נאסף על ידי מטרת צמצם גבוהה, התפצל תורם וכן לקבלאו ערוץ באמצעות מראה dichroic ו מוקרן שתי מצלמות EM-CCD. תא המדגם מחובר בשלב מיקרומטר המאפשר תנועת x ו- y-כיוון עם שני מנועי צעד. מנוע פייזו השלישי משמש יחד עם לייזר IR ואת גלאי רגיש בעמדה לבנות מערכת פוקוס אוטומטי כדי להבטיח מוקד אופטימלי לאורך הניסוי. השתמש עירור ליזר לסירוגין (אלכס) כאשר דינמיקת מסלולי זמן סריג הם נצפו 25. יכול להיגרם דינמיקה כזו או על ידי שינויים מרחביים בתוך המולקולות או מתנודות בהירות acceptor וממצמץ acceptor. הערה: ALEX מאפשר האפליה בין שני אלה גורמים אפשריים ומונע מוטעה של מסלולי סריג דינמיים. עם זאת, מטעמי פשטות, חלק הפרוטוקול מוגבל בניתוח הסרטים שצולמו ללא ALEX. זהירות: לייזרים 3B מחלקה משמשים ההתקנה הקרינה מולקולה בודדת. ודא la הולםאמצעי בטיחות ser, על פי תקנות שלטון מקומיות, ננקט לפני המערכת מופעלת. בצע את מדידת הקליטה המשמשת לקביעת תשואת הקוונטים על UV-VIS ספקטרומטר (ראה חומרים ושיטות). בצע את המדידה של ספקטרום פליטת קרינה על התורם, על ספקטרום ספיגת acceptor ואת אנאיזוטרופיה הקרין על ספקטרומטר קרינה (ראה חומרים ושיטות). כן תא המדגם על פי נהלים שפורסמו 33. לחלופין, ההליך מתואר [34] ניתן להשתמש. לייבל הדגימות נחקרו עם זוג מולקולה לצבוע acceptor התורם מתאים smFRET ולהבטיח כי קיימת מחצית ביוטין עבור חוסר התנועה על פני השטח של החדר המדגם. הערה: על מנת לבצע לוקליזציה עמדה לצבוע אנטנה ידועה עם תוכנת Fast-NPS בונה דגימה שונה נדרשות. כל מבנה needs יש תווית אחת במיקום לצבוע אנטנה הידוע ותווית אחד בכל עמדת לווין הידועה מן המבנה הגבישי. לפחות שלושה מבנים שונים עם צבעים המצורפים את מיקום האנטנה שלוש עמדות לווין שונות נדרשים עבור תוצאות מדויקות. מדידות בין אנטנות וכן בין הלוויינים שימושיות גם כדי לשפר את הדיוק, אך זה דורש חילופי מולקולות צבע אשר צריכה להיות הוזנו בצורה נכונה בניתוח. השמה 2. תזרים צ'יימברס בפומית אישית משוך צינורות סיליקון (0.8 מ"מ מזהה, 2.4 מ"מ OD) לתוך ברגי כרטיסייה חלולים (M4) וחותך את הצינורות משני ישר מסתיים עזב סככה של 1 סנטימטר משני הצדדים באמצעות סכין גילוח חד. התאם את הסככה של הצינורות אל על 2 מ"מ בצד אחד של בורג הכרטיסייה. הר תא הזרימה לתוך מחזיק המדגם באופן חורה שקופית זכוכית קוורץ להתאים את האשכולות של בעל המדגם. לְהַדֵקמפרצון והברגים לשקע בעדינות על מנת להבטיח כי הכניסה והיציאה של החדר המדגם עדיין חדירות. בעדינות להדק את ארבעת הברגים של בעל זכוכית אקרילית לתקן את המיקום של תא הזרימה. צינורות סיליקון Cut (מזהה 0.58 מ"מ, 0.96 מ"מ OD) לתוך 20 ס"מ חתיכות ארוכות. הכנס אחת היצירות אל כניסת הבורג לשקע של החדר המדיד. סגור את צינורות הכניסה והיציאה באמצעות מהדק. הערה: תאי מדגם התאספו ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר למשך עד שבועיים. 3. מדידה smFRET על מיקרוסקופ TIRF השתמש במזרק כדי לשטוף את תא המדגם עם 500 μL של PBS. למנוע בועות אוויר מלהיכנס קאמרי מדגם בכל העת על ידי יצירת אגל בסוף של צינורות היניקה לפני שינוי פתרון חיץ שונה. שטוף את תא המדגם עם 100 μL neutravidin (0.5 מ"ג / מ"ל ב PBS) פתרון דגירה 15 דקות בטמפרטורת החדר. לִשְׁטוֹףאת הפתרון neutravidin עם 500 μL של PBS. בורג בעל מתכת עבור מנסרה על קאמרית המדגם. הר הקאמרי מדגם לשלב מיקרומטר של מיקרוסקופ TIRF. הקפד להתקין את תא המדגם אופקי ישרה ככל האפשר מול המטרה להימנע defocusing במהלך סריקת תהליך. הפעל את תוכנת שליטה על מצלמות EM-CCD ואת התוכנה לשליטה על-מנועי piezo של הבמה. התאם את המיקוד של המטרה מיקרוסקופ מלהסתכל השתקפויות של לייזר IR. מניחים את פריזמה (PS991, n = 1.52) על גבי מחזיק פריזמה מתכת. לשנות את מיקום לרוחב של פריזמה לוודא כי קרני הלייזר פגע הפריזמה מכן להשתמש דבק דגירה עם אור UV במשך 5 דקות. הערה: פריזמה רכוב ניתן לעשות שימוש חוזר על ידי ניקוי. בשנת לחץ על תוכנות שליטה המצלמה "רכישת Setup" ולהגדיר את הפרמטרים רכישת הבאים: 100 ms integratזמן יון, 401 מסגרות / סרט (מצלמה ירוקה), 400 מסגרות / סרט (מצלמה אדומה), מכפיל אלקטרונים להרוויח 225, 5x רווח קדם מגבר ו MHz שיעור 3 ההודעה ב -14 ביט. צור תיקייה בכונן הקשיח המקומי עבור המדידה. בחר שם רצוי עבור הקבצים המדידים, למשל, בהשוואה לתקופה מקבילת חודש-יום. בתוכנה הגדרות עבור אל הסעיף "שמירה אוטומטית" הרוכב, לאפשר "שמירה אוטומטית" ובחר בפורמט הקובץ * .sif לרכישת הסרט. בחר את התיקייה בדיסק הקשיח. השתמש בשם התיקייה כמו filestem. הפעל את (ערך ההתחלה מוכן 1) "AutoIncrement" פונקציה. הפעל את הקובץ המצורף של מפעיל לשם הקובץ. השתמש "DON" ו "ACC" עבור התורם וערוץ acceptor, בהתאמה. בחר "_" כמפריד. בשינה לחץ על תוכנות שליטת מצלמה על "וידאו" כדי להתחיל את דמותה החיה של קרינת מצלמת אקונומיקת רקע ידי סריקה הקאמרית מדגם באמצעות עוצמת ליזר מרבית של כל שלושת הלייזרים (combined ≈3,000 W / 2 ס"מ על 10 s לכל שדה הראייה). כבה את הליזר הכחול. להקטין את עוצמת הלייזר הירוק סביב 200 W / 2 ס"מ לסביבות 40 mW / cm 2 עבור לייזר אדום אם לסירוגין עירור לייזר (אלכס) משמש. לדלל את מדגם ניאון biotinylated לריכוז של 50-100 PM. טען 100 μL של פתרון. המדגם הוא משותק על פני השטח הקאמריים על כריכה. הערה: ודא שלא להעמיס את החדר. מולקולות שכנות חייבות להיות מופרדות זה מזה. במידת הצורך, לטעון נוספים 100 μL של מדגם 2x יותר מרוכז לתא. חותם את צינורות הכניסה והיציאה של החדר המדידה באמצעות מלחציים לאחר הטעינה הושלמה. כבה את כל הלייזרים ולהשתמש-מנועי piezo כדי להזיז את תא הזרימה בשני תחומי מבט נוסף. בשנת תוכנות שליטה המצלמה לחץ על "אות קח" כדי להתחיל להקליט את הסרט ואת מתגעל לייזר בעת ובעונה אחת. ודא כי יותר מ -80% של המולקולות מולבנים עד סוף הסרט על ידי התאמת כוח הליזר. חזור על שלבי 3.17 ו -3.18 עבור האזור הקאמרי מדגם prebleached כולו. 4. רכישת מפת טרנספורמציה ( "beadmap") הכינו תא תזרים כמתואר בסעיפים 1.1, 1.2 ו -2. השתמש חרוזים multispectral פלורסנט מצופה avidin אשר מראים פליטת הקרינה ב התורם וערוץ acceptor. וורטקס המניות דקות 1, ואז לדלל 50 μL של המניה ב 50 μL DDH 2 O. וורטקס שוב דקות 1, sonicate 1-2 דקות, ולאחר מכן מערבולת עוד 10 שניות. ביצוע השלבים המתוארים למדידות smFRET (סעיף 3.5-3.10). טען 100 μL (נפח תא 1) של 1: 2 חרוזי ניאון מדולל לתוך תא הזרימה. חכה 10 דקות עבור חרוזי הניאון להיקשר אל פני השטח. השתמשו בפרמטרי רכישת 3.9 אבל צ'אןge אורך סרט 26 (מצלמה ירוקה) ו -25 (מצלמה אדומה) ואת רווח מכפיל אלקטרונים עד 10. הגדר את עוצמת לייזר ירוק לערך של 20 וואט / 2 ס"מ. קח סרט אחד בכל שדה הראייה עם כ 50-100 חרוזים. עיבוד 5. וניתוח של נתונים smFRET השתמש סריג SM תוכנה המותאם אישית נכתב לניתוח של beadmap (ראה חומרים ושיטות) ואת הסרטים שנרכשו. הפעילו את תוכנית viewPlot1.m. הקש על ניתוח | תצווה ניתוח, בטל את האפשרות "אלכס" אם זה לא נעשה שימוש. לביצועים הטובים ביותר לבחור את הסף לממצא שיא "גבוה". לחץ על "אישור". בחר "לא" כאשר נשאל אם beadmap כבר ניתחו. חפש את התיקייה המכילה את beadmap רכשה ובחרו בקובץ * .sif (על-ידי לחיצה כפולה על זה). בעיתונות חלון הדיאלוג הבאה "אישור". הערה: אם beadmap כבר נתח בשנת מידה קודמתment, לבחור "YES" כאן ובחר את beadmap הציל באמצעות כניסה אל התיקייה הנכונה ולחיצה כפולה על הקובץ beadmap * .map. המשך לשלב 5.8. בחר שני חרוזים יחידים ממוקמים ב פינות נגדיות של שדה הראייה. עוצמות פיקסל מקודדים באמצעות צבע כחול כהה (בעצימות נמוכה) לאדום כהה (בעצימות גבוהה). לחץ על מרכז החרוז הראשון. אם במרכז המולקולה יכול להיות ממוקם באופן ברור על ידי קידוד הצבעים, בחר "כן" או אחר לחץ "לא" לבחור זוג מולקולה אחר. מקם את הכוונת על פיקסל שמראה את עוצמת ולחץ מקסימלית "KEEP". חוזרים על הפעולה עם הערוץ השני. הקש על המולקולה בפינה הנגדית וחזור על שלבי 5.5 ו -5.6. הערה: משמרת פיקסל היחסית של שני הערוצים מוצגת בחלון הפקודה ומפת השינוי נשמרה אוטומטית * קובץ .map לתוך התיקייה המכילה את beadmap * .sif קובץ <./ Li> כדי לטעון את הסרטים התורם acceptor (* .sif) עבור "ניתוח אצווה", דפדף אל התיקייה, בחר את כל הסרטים כי יהיה לנתח ולחץ על "אישור". בחלון הדיאלוג הבא, לחצו על "אישור". הערה: הניתוח יצווה נגמר כאשר השביל האחרון המוצג בחלון הפקוד מתחיל עם "ניתוח סיום …". המולקולות זוהו מוצגות בחלון חדש, אשר גם מציין את המשמרת היחסית של התורם וערוץ acceptor נקבע ממפת טרנספורמציה. כדי לטעון את קבצי הסרטים לכלכו לחצו על קובץ | טענו. בטל את האפשרות "אלכס" אם זה לא נעשה שימוש. הגדר את smoothwidth עד 10 ולחץ על "אישור". בחר את התיקייה המכילה את הקבצים .ttr * ולחץ על "בחר הכל" ו "אישור" בתפריט ההקשר הבא. אם העקבות המוצגות כוללות את שלבי smFRET מאפיין (איור 2) לחץ על הלחצן הדו-המצבים "לא נבחר" וקודםלבחור את נקודת הזמן של תחילת אירוע הסריג ידי הזזת הקו עם סמן העכבר ולחיצה על לחצן העכבר השמאלי. הבא לבחור את נקודת הזמן של ההלבנה של מולקולת acceptor ולבסוף נקודת הזמן של ההלבנה של מולקולת התורם. בחלון הבא את יעילות הסריג זממה בכחול. כדי לבחור בעיתונות העקבות "כן" על הכפתור אחרת לבחור "לא". מחדש גישה עקבות הזמן ללחוץ על כפתור "הקודם". חזור על התהליך עד המולקולה האחרונה של הסרט. לאחר ניתוח המולקולה האחרונה בסרט להציל את העקבות שנבחרו על ידי לחיצה על "קובץ | שמור". שמור את עקבות הנבחרות באותה תיקייה כמו קבצי .sif *. חזור על שלבי 5.10-5.13 עבור כל הסרטים רכשו. הפעל את תוכנית combine_fret_results.m. בחר את התיקייה המכילה את הקבצים * .res וכל הקבצים * .FRETonly_trace. שמור את קבצי סריג המולקולה-חכמה סריג ומסגרת-חכמה כמו MW.dat וFRW.dat, בהתאמה. הערה: קבצי .dat * נשמרים כקבצי ASCII. קובץ FRW.dat מכיל שישה עמודים ו שורה אחת עבור כל מסגרת סריג. הטור השישי מכיל את יעילות סריג מסגרת-חכמה תיקן. קובץ MW.dat מכיל 21 עמודים שורה אחת לכל מולקולה שנבחרה סריג. העמודה השלישית מכילה סריג יעילות המולקולה-חכמה. 6. מציג נתוני smFRET ב היסטוגרמות הערה: כדי לחלץ את יעילות smFRET הממוצעת של כל נתוני smFRET רשמו את הנתונים חכמי מסגרת או הנתונים חכמי המולקולה הם זממו היסטוגרמות ונותחו באמצעות גאוס מתאים ל (מרובות) פסגות. בחלק הבא, הפרוטוקול משתמש תוכנת ניתוח נתונים מסחרית (ראה רשימת חומרים). עם זאת, כל תוכנה אחרת זמין יכולה לשמש במקום. פתח תוכנה לניתוח נתונים (ראה רשימת חומרים). לחץ על קובץ | יבוא | ASCII המרובה. בחר את התיקייה המכילה את קובץ FRW.dat. בחר את הקובץ ולחץ על "אישור & #34 ;. קבל את האפשרות קלט עם "אישור" ללא שינוי. בחר את העמודה השלישית C (Y) המכילה את יעילות סריג תיקן, לחץ לחיצה ימנית על העמוד המגרש בחר | סטטיסטיקה | היסטוגרמה. בחלון היסטוגרמה לחץ פעמים על העמודים בטל "binning האוטומטי" ובחר פח בגודל רצוי, למשל, 0.05. גם לבחור ערכים ההתחלה ואת הסוף, למשל, -0.025 ו 1.025. בחר את העמודות של ההיסטוגרמה ידי לחיצה שמאלה עליהם. ואז לחץ לחיצה ימנית ובחר "ללכת סל גליון". בחר בעמודה "ספירות" על ידי לחיצה שמאלה על זה ולאחר מכן לחץ לחיצה ימנית מגרש בחר | טור / בר / פאי | טור. בעלילה ברת טור עבור אל ניתוח | והתאמה | עקומה קוית | הדו-שיח פתיחה. בחר "גאוס" תחת פונקציה ואז ללכת הרוכב "פרמטר". בטל את בחירת אתחול פרמטר אוטומטי. תקן את הערך לקזז (y0) ב 0. לחץ על "התאמה". הערה: פונקציית בכושר כמו גם דה ההולםזנבות מוצגים כעת בעלילת העמודה. הערך "XC" נותן במרכז הפונקציה לנכונה, כלומר, ממוצע סריג היעיל המשמש כפרמטר הקלט עבור תוכנת NPS. 7. מדידה של התשואה קוונטית בצע נחישות תשואת קוונטים עם השיטה היחסית דומה ההליך המתואר על ידי ואח 'וורט. 35, באמצעות Rhodamine 101 מומס באתנול (QY = 91.5%) כסטנדרט. ספקטרום הקליטה שיא ב ספקטרומטר UV-VIS באמצעות נפח 80 μL בתוך קובט ספיגת אורך מסלול 1 ס"מ. את הספיגה באורך הגל אשר תשמש עבור עירור קרינה יש ≤ 0.05. ספקטרום פליטה רשום על ספקטרומטר מנורה-מכויל מופעל במצב ספירת פוטון. לבצע את המדידות עם מקטבים גלאן-תומפסון ב עירור (0 °) ופליטה (54.7 °) נתיב (תנאי זווית הקסם) באמצעות spectr רוחב פס אל של כ -5 ננומטר ו -2.5 ננומטר עבור monochromator עירור ופליטה, בהתאמה. מדוד דגימות לאחר העברתי קובט קרינה עם בלטפל אורך דרך 3 מ"מ כי קצב הספירה אינו עולה על 10 6 s -1. חישוב התשואה הקוונטים פי כאשר n ו- n Std הם מדדי השבירה של הממס המדגם תקן, בהתאמה. f (λ) ו f_Std (λ) הם עוצמות הקרינה של מדגם התקן בבית λ אורך הגל. A (לשעבר λ) ו- A std (לשעבר λ) הם ספיגת של המדגם ועיון באורך גל עירור std Φ הוא התשואה הקוונטי של התקן. le "> 8. חישוב רדיוס איזוטרופי פורסטר חשב את רדיוס איזוטרופיים פורסטר ( ) מן ספקטרום הפליטה של מולקולת התורם, ספקטרום הבליעה של מולקולת acceptor, התשואה הקוונטי של התורם ואת מקדם השבירה של המדיום. השתמש PhotochemCAD החופשית לחישוב . עם זאת כל תוכנה זמינה אחרת יכולה לשמש במקום 36. מדידת 9. של Anisotropies לקבוע anisotropies קרינה היציב מקלטות של ספקטרום קרינה עם הגדרות מקטבות עירור / פליטה שונות (V / V, V / H, H / V, H / H) 36. חשבת את גורם G, מתקנת חפצי קיטוב של המכשיר, עבור כל אורך גל מןיַחַס ולהשתמש בו כדי לחשב את הערך אנאיזוטרופיה עבור כל אורך גל: איפה אני XY מציין את עוצמת עבור x הקיטוב עירור y הקיטוב פליטה. ממוצע הערכים על פני טווח ספקטרלי הפליטה לחשב את אנאיזוטרופיה הקרינה היציבה. 10. התקנה של תוכנת Fast-NPS הורד UCSF כימרה מ http://www.cgl.ucsf.edu/chimera ופעל לפי הוראות ההתקנה. עבור אל אתר האינטרנט של "המכון לביופיזיקה"באולם באוניברסיטת: https://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html. הורד את הגרסה הנוכחית של-NPS המהיר לחלץ אותו לתיקייה של בחירה. פתח את תיקיית המשנה "Redistributable" ולהתקין את C ++ Redistributable החזותית שהוא מתאים למערכת. 11. מרכוז קובץ PDB פתח את קובץ PDB (ים) של עניין כימרה. בחר את כל האטומים של המתחם macromolecular ולחשב את הקואורדינטות של centroid (כלים | ניתוח מבנה | צירים / מטוסים / centroids | הגדר centroid … | אוקי). פתח את יומן התגובה (מועדפת | תגובה התחברו) ואת כלי טרנספורמציה (כלים | תנועה | Transform קואורדינטות). הזן את הקואורדינטות של centroid המוצגים תגובה התחבר לתיבת הטקסט "Shift" של חלון Transform קואורדינטות ולשנות את השלט של כל הצירים. לחץ על "החל" ולשמור את הקובץ עם "שמור PDB" (קובץ | PDB שמור). הגדרה 12.את אפריורי Position הערה: כל הערכים נחשבים אנגסטרום. הפעל את שפת המחשוב הטכנית ולשנות את התיקייה הנוכחית בתיקייה מקומית Fast-NPS. הזן בחלון הפקודה: FastNPS. צור jobfile חדש מנהל הפרויקט (Project | חדש). הגדרת תפקידו הקודם (כלים | לצבוע דגם קודם). בחלונית "היסודות לפני" להגדיר את הרזולוציה המרחבית של תפקידו הקודם על ידי הזנת הערך שלה (2 מומלץ). אל תכלול את הפנים של מקרומולקולה על ידי הפעלת התיבה ולחיצה על הכפתור "PDB עומס". בחר לטעון את קובץ PDB המרוכז כמפורט בסעיף 11. ציין את הקוטר המשוער (13 מומלץ, ראה דיון) של הצבע על ידי הזנת הערך שלה. זן מרחק skeletonization, כלומר, מרחק המולקולה לצבוע עלולה לחדור לתוך מקרומולקולה (2 מומלצים). בתוך הפאנל "גודל לפני מקסימלית" להכניס את הקואורדינטות מינימלי ומקסימלי של תפקידו הקודם (מומלץ: x ב [-150,150], y ב [-150,150] ו- z ב [-150,150]). כאשר מגדיר לווין, הפעל את תיבת הסימון "מצורף באמצעות מקשר גמיש" בחלונית "היסודות לפני" והזן את "המקשר" לוח הקואורדינטות של האטום (בקובץ PDB המרוכז) שבה המולקולה לצבוע מצורפת. יתר על כן, ציין את האורך והקוטר של המקשר ידי הזנת הערכים שלהם (13 A ו- 4.5 מומלצים, ראה דיון). במקרה של אנטנה לדלג נקודה זו. לחצו על כפתור ה "לחשב נפח נגיש". שמור את תפקידיו קודמים ובמידה לייצא אותה למטרות להדמיה באמצעות תוכנה כגון כימרה. 13. הגדרת רשת הגיאומטריה פתח את גדר מדידת חלונות (מצב | ערוך גיאומטריה). צור מולקולה לצבוע חדשה על ידי לחיצה על התחתעל "חדש" בחלונית "צבעים". גדר אנאיזוטרופיה הקרינה שלה (סעיף 9) על ידי הזנת ערך ובחר מודל לצבוע בתוך התפריט הנפתח "מודל דיי". לחצו על כפתור "טען", לבחור את המיקום המתאים לפני וסמן את תיבת הסימון הפעל של צבע. חזור על התהליך עבור כל צבע, כלומר, עבור כל אנטנות, כמו גם עבור כל הלוויינים. לאחר יצירת כל הצבע, להגדיר את המידות. צור מדידה חדשה על ידי לחיצה על "חדש" בחלונית "המדידות". בחר שותפי הסריג שלה תפריטים הנפתחים "Dye1" ו "Dye2" להלן. הזן את יעילות smFRET עם שגיאה ואת הרדיוס פורסטר איזוטרופיים של זוג לצבוע זה. לבסוף, סמן את התיבה הפעל בדיקת המדידה. חזור על התהליך עבור כל המדידות. הערה: לעתים קרובות הרשת הופכת יותר ויותר מורכבת, כך שהמשתמש יכול להתבלבל. כדי המונעת וטיפולt טעויות, לבדוק את הרשת חזותית על ידי לחיצה על כפתור "בדוק רשת". הנתון מציג צבעים המופעלים ומציין מדידות באמצעות קווים מחברי צבעי הסריג. 14. חישוב פתח את חלון חישוב (דרך פעולתו | חישוב). אם כל צבע ברשת יש דגם ספציפי שהוקצה, בחר "משתמש מוגדר" ולהתחיל את החישוב לפי לחיצה "חישוב". כדי לקבל את כל צבעי באותו מודל, בחר אחד מחמשת מודלים (קלאסי, iso, meanpos-iso, var-meanpos-ISO ו var-meanpos) ולהמשיך. הערה: חלון הפקודה יציין את ההתקדמות של החישוב. -NPS המהיר יעשה זאת עם הודעה מוקפצת, כאשר הושלם החישוב. ויזואליזציה 15. של תוצאות על מנת לייצא את הכרכים האמינים של הצבעים, פתח את החלון צפה בתוצאות (דגם | צפו בתוצאות). צפיפויות לצבוע ייצוא: יְצוּאצבענים ביחידים או כל בו זמנית. כדי לייצא צבע יחיד לבחור אותה בלוח "צבעים להציג את הדף 'ולחץ על" צפיפות ייצוא ". זן רזולוציה (2 מומלצים) ולבחור סוג קובץ ליצוא. מימין הצפיפות בעת הצגתה בתצוגה מקדימה וכמה ממאפייניו המתמטיים שלה מוצגות. כדי לייצא את כל הצבע לדחוף בו זמנית "יצוא יצווה". פתח את קבצי צפיפות וכתוצאה מכך כימרה. בדוק עקביות 16. של שילוב המודל שנבחר פתח את החלון צפה בתוצאות (דגם | צפו בתוצאות). אם בלוח "חישוב המידע" בתיבת הטקסט "עקביות" מציג ערך נמוך מ -90% הדגם הנוכחי אינו מייצג את יעילות smFRET נמדד מספיק ולכן היא לא עקבית. במקרה של אי התאמה ללחוץ על הכפתור "עקביות מפורטות". חפש את המדידות שיש להם ערך מתחת ל -90%. אם אחד או יותר צבעהים מעורב בעיקר במדידות אלה, המודלים שלהם הם עלולים לגרום אי ההתאמה. שקול מודלי צבע שונים עבור צבעים אלה מחדש את החישוב המהיר-NPS.

Representative Results

תמלול הוא הצעד הראשון בביטוי גנים בכל היצורים. בשנת הקדומים, שעתוק מתבצע על ידי פולימראז רנ"א חד (RNAP). לעומת אאוקריוטים, את RNAP archaeal יש דמיון מבני מרשים לעמיתיהם איקריוטיים שלהם בזמן שיש מכונות תעתיק פשוט יותר. לפיכך, קדומים ניתן להשתמש כמערכת מודל ללמוד ייזום שעתוק איקריוטיים על ידי RNA פולימראז II (Pol II). לאחרונה, הארכיטקטורה המלאה של המתחם הפתוח RNA פולימראז archaeal נקבעה מ-מולקולה בודדת סריג ו NPS. הנתונים מניתוח NPS שמשו לבניית מודל של מתחם promotor פתוח archaeal מלא, אשר מספק לנו תובנה מועילות שתסייענה המנגנון של חניכת שעתוק. כדי להבהיר את המבנה הזה, יעילות smFRET נמדדה בין מולקולות צבע אנטנה הידועות ממוקמות בתוך com promotor הפתוחplex ומולקולות כמה לצבוע לווין ידוע כי שולבו בחמש הפניה לאתרים של RNAP, שעמדותיהם ידועות ממבני crystallographic (PDB-ID: 2WAQ) 37. צבעי האנטנה צורפו אחד משני עמדות שונות על ה- DNA הלא-תבנית, TFB, TBP או TFE. הרשת מלאה השתמשו במחקר זה כללה יותר מ -60 מרחקים מדודים. איור 7 מציג המודל של מתחם promotor פתוח archaeal השלם הבנוי מניתוח NPS. היא כוללת את promotor גדילי כפול DNA (כחול בהיר וכהה), פולימראז RNA (אפור) וגם בהוצאת שעתוק גורמי TBP (סגול), TFB (ירוק) TFE (צהוב). המודל גבי עם התוצאות מניתוח NPS, ההיקפי האמין, אשר חושבו באמצעות המודל הקלסי (א), מודל ISO (B), המודל-iso meanpos (C), מודל var-meanpos-iso (D) ואת var-meanpos מודל (E). איור 1: Workflow של רכישת ועיבוד של הפרמטרים הדרושים לצורך חישוב מהיר-NPS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2: עקבות הזמן עוצמת הקרינה למופת של אירוע smFRET. עוצמות הקרינה של התורם (הירוקה) לבין מולקולת acceptor (אדום) מראה את השלושה שלבים מאפיינים, כלומר אני: smFRET, II: הקרינה תורמת לאחר photobleaching acceptor, III: קרינה רקע לאחר photobleaching התורם.g2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3: איור סכמטי של תא הזרימה לניסויים smFRET. תא הזרימה הוא רכוב על גבי מתכת מחזיק אישית עם מחזיקי זכוכית אקריליק. הכריך-העיצוב של תא הזרימה כולל זכוכית קוורץ (סיליקה התמזגה) להחליק עם שני חורים לחיבור צינורות כניסה ויציאה, סרט איטום ו coverslip שסוגר תא הזרימה. הפריזמה לתאורת TIRF הוא רכוב על החלק התחתון של החדר לזרום. ברגי כרטיסייה הולו לספק את כניסת שקעים עבור תא הזרימה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt = "איור 4" src = "/ files / ftp_upload / 54,782 / 54782fig4.jpg" /> איור 4: הכנת שקופית קוורץ הזכוכית וסרט האיטום. ציור מכני של שקופיות זכוכית קוורץ המציין את עמדותיהם של חורים (נתון במילימטרים). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 5: ציור מכני של תא הזרימה. מודד לבעל פריזמה האלומיניום, אקריליק מחזיקי זכוכית מסגרת הרכבת אלומיניום ניתן במילימטרים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. igure 6 "src =" / files / ftp_upload / 54,782 / 54782fig6.jpg "/> איור 6: איור סכמטי של ההתקנה פריזמה מסוג TIRF המשמשים בניסויים smFRET. קיצורים עבור רכיבים אופטיים: A, צמצם; DM, מראה dichroic; F, מסנן פליטה; L, עדשה; M, במראה; O, מטרה; P, פריזמה; PSD, עמדת צילום דיודה רגיש; S, מדגם; PS, במת מיצוב; T, טלסקופ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 7: תוצאות סימולציה של נחות המודל השונות. כל התמונות מראות את RNA פולימראז archaeal (PDB-ID: 2WAQ, מבט מלמעלה) יחד עם מודל האמרגן DNA (tDNA ו ntDNA בכחול ציאן, בהתאמה), TBP (סגול), TFB (ירוק) TFE (צהוב)ב archaeal לפתוח 30 מורכבים. הכרכים האמינים מורכבים לתוצאות סימולצית NPS של (א) המודל הקלסי, (ב ') את מודל iso, (C) מודל meanpos-iso, (ד) מודל var-meanpos-ISO ו (ה) var -meanpos מודל. כל הכרכים מוצגים אמין 68%. הקלסי ואת רשתות var-meanpos עולות בקנה אחד עם נתוני smFRET. לעומת זאת, הרשתות שבהן עבור כל צבעי ה- ISO, meanpos-iso או מודל var-meanpos-iso נבחר אינם עולים בקנה אחד עם הנתונים שנמדדו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

אנו מציגים את הליך התקנה וניסיוני לקבוע את יעילות סריג במדויק בין צבעי מחוברים באמצעות linkers הגמישה Biomacromolecules, כלומר, חומצות גרעין ו / או חלבונים.

על מנת להבטיח מדידות מדויקות smFRET (סעיף 3), חשוב להוציא אוויר מאולם הזרימה בכל עת במהלך המדידה. יתר על כן, לוודא שלא להעמיס תא זרימה עם fluorophores. Fluorophores יופרדו בצורה ברורה על מנת להבטיח ניתוח נכון. כמו זוגות smFRET, אשר לא מראים הלבנה של התורם צריך להיות נכללים בניתוח, לוודא כי> 80% של מולקולות בתוך שדה הראייה מולבן בסוף הסרט. כדי להסביר את inhomogeneities ב מדגם β-גורם ואת פקטור γ, תיקון יעיל האיתור צולב לדבר ו יחסי של ערוץ תורם acceptor, בהתאמה, מחושב עבור כל סריג זוג בנפרד.

<p class= "Jove_content"> הגדרות המצלמה (זמן אינטגרציה, רווח מכפיל אלקטרונים, רווח קדם מגבר ו readout שיעור בסעיף 3.9) צריך להיות מוגדר ערכי נתינה מהי הפשרה הטובה ביותר בין יחס אות לרעש, טווח דינמי וזמן ברזולוציה. הם צריכים להיות מחדש מותאם ניסויים שונים או אם חומרה שונה משמשת. המספרים של מסגרות צריך להיות גבוה מספיק כדי להבטיח שרוב התורם מולקולות אקונומיקה בתוך זמן תצפית.

עבור המדידות על ספקטרומטר הקרינה (סעיפים 7 עד 9) פשרה טובה בין עוצמת האות ואת ברזולוציה הספקטרלית של הנתונים שנרשמו יש להימצא. לשם כך לחרכי מסלול עירור ופליטה של ספקטרומטר הקרינה צריך להיות מותאם תלוי המכשיר בשימוש וריכוז המדגם.

יתר על כן, אנו מציגים את שיטת הניתוח המהירה-NPS כדי להשיג מידע מבני של MACROM החולף או דינמימתחמי olecular. NPS יושם כדי לחשוף את הנתיב של גדיל DNA שאינו תבנית ואת המיקום של גורמי ייזום שעתוק במתחם הפתוח RNA פולימראז archaeal. באמצעות רשת של יותר מ -60 מדידות מרחק שונים, הראינו כי Fast-NPS, מצויד במנוע הדגימה מיושם החדש (Eilert, ט, Beckers, מ ', דרכסלר, פ', & מיכאליס, J. בהכנה), מפחית את הזמן הדרוש לניתוח רשת smFRET מורכבת זו על ידי ≈2 סדרי גודל, לעומת השיטה NPS העולמי המקורי ^27. חוסניו של האלגוריתם מושרש סמפלר מטרופוליס-בתוך-גבסתי בשילוב עם ערכת הרפיה במקבילה. -NPS המהיר מראה שחזור מדויק של תוצאות רשת ועולה בקנה אחד עם תוצאות שפורסמו ³⁰ קודם לכן.

כמה שיטות שונות פורסמו במטרה להסיק מידע מבני ממדידות smFRET ¹¹ </s^עד>, ^{^12,} ^{^13,} ^{^14,} ^{^15,} ^{^16,} ^{^17,} ^18. כל הגישות הללו מספקים רק אחד מודל צבע ספציפי. לפיכך, צבעים, שאינו מקיימים את ההנחות במודל בהתאמה, לא ניתן להשתמש או להוביל מידע מבני שווא. -NPS המהיר, להפך, מאפשר לבחור עבור כל מולקולה לצבוע מודל אחר. זה עוזר לתת דין וחשבון על התנהגות קונפורמציה שונה של שניהם, המולקולה לצבוע עצמו, כמו גם המקשר המשמש המצורף שלה. הסביבה המולקולרית המקומית של מולקולת צבען, כמו גם המאפיינים הפיסיים שלו תקבע איזה דגם הוא מתאים ביותר.

עבור רשת smFRET ניתח של המתחם ייזום archaeal, הנחה איזוטרופיים לכל מולקולות צבע מוביל i הירידה הדרסטיתn את גודל הכרכים האמינים לעומת המודל הקלסי. בשילוב עם עמדה דינמית הממוצעת עבור כל צבע המולקולות החציוני מכל גדלי הנפח האמינים (ב 95%) מפחית פחות מ -0.5 ננומטר ^3. עם זאת, posteriors המולקולה לצבוע הללו כבר לא עולים בקנה אחד עם מדידות smFRET שלהם, הדבר המצביע על כך כי ההנחות שנעשו להוביל למידע מבני שווא. לעומת זאת, posteriors נקבע במודל הקלאסי עולות בקנה אחד עם יעילות smFRET נקבע.

כפי ההנחה על המצב איזוטרופיים ו / או דינמי הממוצע עבור כל הצבעים להוביל חוסר עקביות, Fast-NPS מאפשר הרשעות קודמות מולקולה לצבוע שבו כל צבע ניתן להקצות אחד מחמשת הדגמים. כל דגם משתמש באותו נפח נגיש. האלגוריתם לחישוב של AVS לצבוע עושה כמה הנחות. בהתחלה, את הצורה המרחבית של fluorophore מקורבת על ידי כדור. לכן, בקוטר ובהתחשב wid של fluorophoreה, בגובה ובעובי אמור לשמש (סעיף 12). יתר על כן, הצורה של והמקשר מקורב על ידי מוט גמיש. הערכים המוצגים בסעיף 12 חושבו עבור לצבוע אלקסה 647 מחובר דרך מקשר 12-C. נכון להיום, לא ניתן לקבוע מראש במדויק מהו הדגם המתאים ביותר, בהתחשב גיאומטריה ניסיונית, וכך כל הדגמים צריכים להיבדק. באופן כללי, אחד יבחר במודל אשר נותן את הגודל האחורי הקטן ביותר האפשרי, ועדיין להיות בקנה אחד עם הנתונים. כדי לבדוק אם בחירה של מודלים עולה בקנה אחד עם נתוני smFRET, אנו מחשבים הם את האחוריים ואת הסבירות. עקביות כלומר יותר מ -90% מהדגימות שנאספו האחורי נמצאים במרחק רווח סמך 95% את הסיכוי.

אמנם נכון כי נמוך אנאיזוטרופיה, קטנים ודאות המרחק, ברשת smFRET הסדרים גיאומטריים של מולקולות הצבע גם צריכים להילקח בחשבון. וכך, בעוד representing מולקולות צבע עם אנאיזוטרופיה קרינה נמוכה עם מודל ISO הוא בחירה ראשונה טיפוסית, בדיקת העקביות מספקת אמצעי ישיר יותר לבחירת מודל הצבע הנכון. הבחירה האופטימלית של מודלי צבע יכולה להביא לעלייה דרסטית דיוק לוקליזציה ובאותו הזמן לשמור על העקביות של הרשת עם נתוני הסריג שלה.

לסיכום, Fast-NPS מאפשר לצבור מידע מבני ודינמי של מתחמי macromolecular גדולים. בניגוד לשיטות מבניות משותפות כגון קריסטלוגרפיה רנטגן או במיקרוסקופ אלקטרוני cryo זה מאפשר לניטור מתחמים גמישים או חולפים ביותר, ובכך להרחיב הבנת מכניסטית שלנו מאוד של תהליכים ביולוגיים מורכבים.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank B. Gruchmann for the mechanical drawings of the flow chamber. Further, we want to express our gratitude to Max Beckers and Florian Drechsler for insightful comments and discussions regarding NPS and the underlying sampling engine.

Materials

Flowchamber preparation
Customized metall sample holder	self-built	n/a
quartz-glass slides, 76 x 26 mm	Technical Glass Products	26007
coverslips, 60 x 24 mm	Marienfeld	101242
detergent, Hellmanex II	Hellma	320.001
ultra-pure water from Synergy UV	Millipore	2512600
Zepto plasma cleaner	Diener	n/a
(3-aminopropyl)-triethoxysilane, p.a.	Sigma-Aldrich	A3648
methoxy PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa	Laysan Bio Inc.	MPEG-SVA-5000-1g
biotinylated PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa	Laysan Bio Inc.	BIOTIN-PEG-SVA-5000
Sodium biocarbonate	Sigma-Aldrich	S5761 Sigma
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S2127 Sigma-Aldrich
sealing film (Nescofilm)	Fisher Scientific	12981805
Tygon Flexible Silicone Tubing, 0.8 mm ID, 2.4 mm OD	Saint-Gobain Performance Plastics	720958
Fine-Bore Polyethylene Tubing, 0.58 mm ID, 0.96 mm OD (Smiths Medical)	Fisher Scientific	12665497
Neutravidin	Life Technologies	A2666
Name	Company	Catalog Number	Comments
Total internal reflection fluorescence microscope
Nd:YAG Laser, 532 nm	Newport Spectra-Physics	EXLSR-532-100-CDRH
diode-pumped solid-state laser, 491 nm, Calypso	Cobolt	904010050
diode laser 643 nm, iBeam smart	Toptica	iBEAM-SMART-640-S
dichroic mirror, 532 RDC	Chroma	F33-540
dichroic mirror, 476 RDC	Chroma	F33-476z
acousto-optic tunable filter	AA Opto-Electronic	AOTFnC-VIS
plano-convex cylindrical lens, f = 75 mm	Thorlabs	LJ1703L1-A
plano-concave cylindrical, f = -300 mm	Thorlabs
prism, PS 991	Thorlabs	PS991
focussing lens, f = 75 mm	Thorlabs	LA1608-B
syringe pump, PHD 2000	Harvard Apparatus	70-2002
2 stepper motors, Z812B	Thorlabs	Z812B
piezoelectric actuator, PE4	Thorlabs	PE4
IR diode laser	Edmund Optics	CPS808	part of the autofocus system
dichroic mirror, 775 DCXR	Chroma	775 DCXR
position-sensing detector (PSD), PDP90A	Thorlabs	PDP90A	part of the autofocus system
water-immersion objective, Plan Apo 60X WI, NA 1.2	Nikon		MRD07601
dichroic mirror, 645 DCXR	Chroma	645 DCXR	part of the emission pathway
emission filter, 3RD550-510	Omega Optical	3RD550-510	green channel in the emission pathway
emission filter, 3RD660-760	Omega Optical	3RD660-760	red channel in the emission pathway
EMCCD camera, iXon+ DU897EBV	Andor	AND-20-00032
EMCCD camera, iXon3 DU897D-BV	Andor	AND-20-000141
Name	Company	Catalog Number	Comments
Miscellaneous
Varian 50	Cary		UV-VIS spectrometer
Fluorolog2	SPEX		fluorescence spectrometer
Solis (V4.15)	Andor		control software for the EM-CCD camera
Apt user utility (V1.022)	Thorlabs		control software for the piezo-motors
Norland Optical Adhesive 68	Thorlabs		adhesive
PC-AFN-0.8 Nile red	Kisker Biotech		avidin-coated fluorescent multispec beads
Matlab	Mathworks		technical computing language for custon written software
Origin (V9.0)	Originlab		scientific graphing and data analysis software
Hellma 105-202-15-40	Hellma	105-202-15-40	absorption cuvette of 1 cm path length
Hellma 105-251-15-40	Hellma	105-251-15-40	fluorescence cuvette with 3 mm path length

References

Cheng, Y. Single-Particle Cryo-EM at Crystallographic Resolution. Cell. 161, 450-457 (2015).
Garman, E. F. Developments in X-ray Crystallographic Structure Determination of Biological Macromolecules. Science. 343 (6175), 1102-1108 (2014).
Sali, A. Outcome of the First wwPDB Hybrid/Integrative Methods Task Force Workshop. Structure. 23, 1156-1167 (2015).
Hopfner, K. P., Michaelis, J. Mechanisms of nucleic acid translocases: lessons from structural biology and single-molecule biophysics. Curr Opin Struct Biol. 17, 87-95 (2007).
Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. High-speed AFM and applications to biomolecular systems. Annu Rev Biophys. 42, 393-414 (2013).
Neuman, K. K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5, 491-505 (2008).
Yildiz, A. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. Advances in Single-Molecule Fluorescence Methods for Molecular Biology. Annu Rev Biochem. 77 (1), 51-76 (2008).
Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).
Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).
Rasnik, I., Myong, S., Cheng, W., Lohman, T. M., Ha, T. DNA-binding Orientation and Domain Conformation of the E. coli Rep Helicase Monomer Bound to a Partial Duplex Junction: Single-molecule Studies of Fluorescently Labeled Enzymes. J Mol Biol. 336 (2), 395-408 (2004).
Andrecka, J. Single-molecule tracking of mRNA exiting from RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (1), 135-140 (2008).
Schröder, G. F., Grubmüller, H. FRETsg: Biomolecular structure model building from multiple FRET experiments. Comput Phys Commun. 158 (3), 150-157 (2004).
Margittai, M. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15516-15521 (2003).
Kalinin, S. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat Methods. 9 (12), 1218-1227 (2012).
Choi, J. N6-methyladenosine in mRNA disrupts tRNA selection and translation-elongation dynamics. Nat Struct Mol Biol. 23 (August 2015), 110-115 (2015).
Svensson, B. FRET-based trilateration of probes bound within functional ryanodine receptors. Biophys J. 107 (9), 2037-2048 (2014).
Stephenson, J. D., Kenyon, J. C., Symmons, M. F., Lever, A. M. L. Characterizing 3D RNA structure by single molecule FRET. Methods. (2016), 1-11 (2016).
Lee, N. K. Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation. Biophys J. 88 (4), 2939-2953 (2005).
McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules. Biophys J. 99 (3), 961-970 (2010).
Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J Struct Biol. 173, 497-505 (2011).
Schuler, B. Single-molecule FRET of protein structure and dynamics – a primer. J nanoboitechnology. 11, 1-17 (2013).
Choi, U. B. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat Struct Mol Biol. 17 (3), 318-324 (2010).
Dale, R. E., Eisinger, J., Blumberg, W. E. The orientational freedom of molecular probes. The orientation factor in intramolecular energy transfer. Biophys J. 26 (2), 161-193 (1979).
Kapanidis, A. N. Alternating-laser excitation of single molecules. Acc Chem Res. 38 (7), 523-533 (2005).
Muschielok, A. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).
Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the nano-positioning system to the analysis of fluorescence resonance energy transfer networks. J Phys Chem B. 115 (41), 11927-11937 (2011).
Andrecka, J. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase ii elongation complex. Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).
Treutlein, B. Dynamic Architecture of a Minimal RNA Polymerase II Open Promoter Complex. Mol Cell. 46 (2), 136-146 (2012).
Nagy, J. Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule. FRET and NPS. Nat Commun. 6, 6161 (2015).
Grohmann, D., et al. The Initiation Factor TFE and the Elongation Factor Spt4/5 Compete for the RNAP Clamp during Transcription Initiation and Elongation. Mol Cell. 43 (2), 263-274 (2011).
Beckers, M., Drechsler, F., Eilert, T., Nagy, J., Michaelis, J. Quantitative structural information from single-molecule FRET. Faraday Discuss. 184, 117-129 (2015).
Bennink, M. L. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nat Struct Biol. 8 (7), 606-610 (2001).
Chandradoss, S. D. Surface passivation for single-molecule protein studies. J Vis Exp. (86), e50549 (2014).
Würth, C., Grabolle, M., Pauli, J., Spieles, M., Resch-Genger, U. Relative and absolute determination of fluorescence quantum yields of transparent samples. Nat Protoc. 8 (8), 1535-1550 (2013).
Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
Korkhin, Y. Evolution of complex RNA polymerases: The complete archaeal RNA polymerase structure. PLoS Biol. 7 (5), (2009).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Dörfler, T., Eilert, T., Röcker, C., Nagy, J., Michaelis, J. Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System. J. Vis. Exp. (120), e54782, doi:10.3791/54782 (2017).

Automatically Generated