Perturbações de circulação miRNAs na Síndrome do Cólon Irritável detectada usando um multiplexado de alta capacidade: Plataforma Gene Expression
Summary
We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.
Abstract
O ensaio de plataforma de expressão do gene permite a quantificação e altamente reprodutível robusto da expressão de até 800 transcritos de ARNm (ou miARNs) numa única reacção. O ensaio miRNA conta transcrições por imagem direta e digital contando moléculas miRNA que são rotulados com conjuntos com códigos de cores fluorescentes com código de barras sonda (uma sonda repórter e uma sonda de captura). Os códigos de barras são hibridizados directamente para amadurecer miARNs que foram alongados por ligação de uma marcação de oligonucleótido original (miRtag) à extremidade 3 '. A transcrição reversa e a amplificação dos transcritos não são necessários. sondas repórter contém uma sequência de seis posições de cor preenchida usando uma combinação de quatro cores fluorescentes. As quatro cores com mais de seis posições são usados para construir uma sequência de cores de código de barras específico para o gene. processamento pós-hibridação é automatizado em uma estação de preparação de robótica. Após a hibridação, as sondas em excesso são lavados, e as estruturas tripartidas (pro capturaser-miARN-repórter sonda) são fixados a uma lâmina revestida de estreptavidina através da sonda de captura marcada com biotina. Imagem e código de barras contagem é feita usando um analisador digital. Os miRNAs com código de barras imobilizados são visualizados e fotografada usando um microscópio e câmera, e os códigos de barras único são decodificados e contadas. controle de qualidade de dados (QC), normalização e análise são facilitados por um software de processamento de dados e análise de design personalizado que acompanha o software de ensaio. O ensaio demonstra elevada linearidade ao longo de um amplo intervalo de expressão, bem como uma elevada sensibilidade. Exemplo de preparação e ensaio não envolve reacções enzimáticas, de transcrição reversa ou de amplificação; tem poucas etapas; e é amplamente automatizadas, reduzindo os efeitos investigador e resultando em alta consistência e reprodutibilidade técnica. Aqui, descrevemos a aplicação desta tecnologia para identificar circulam perturbações miRNA na síndrome do intestino irritável.
Introduction
Síndrome do Cólon Irritável (SII) é o diagnóstico ambulatorial mais comum em Gastroenterologia, que atinge 10 – 15% da população em geral e representando um encargo significativo para os serviços de saúde. Biomarcadores diagnósticos atualmente, não há geralmente aceites para IBS (ou seja, o diagnóstico é baseado em sintomas clínicos e excluir outros distúrbios orgânicos, tais como malignidade GI, doenças inflamatórias do intestino, e gastrointestinal (GI) infecções). Ao estudar perfis de expressão gênica em doenças comuns com histopatologia subclínica, como IBS, alta sensibilidade e precisão (reprodutibilidade) são necessários, como perturbações nos perfis de expressão gênica são muitas vezes sutis 1-3. miRNAs foram identificados como os dois alvos diagnósticos e funcionais em IBS 4,5, e estamos particularmente interessados em avaliar a sua utilização como biomarcadores de 3,4,6,7 perturbações biológicas IBS-associados circulação. A utilização clínica de circulabiomarcadores ting é de interesse atual, devido à facilidade e à natureza minimamente invasiva da coleção de fonte dos biomarcadores (por exemplo, sangue periférico) de pacientes.
Gene ensaios de expressão de plataforma, por causa da sua química única e simplificada, na maior parte do fluxo de trabalho automatizado, proporcionar uma plataforma de microarray que fornece largura personalizada cobertura (800 alvos numa única reacção) do transcriptoma para a descoberta de alvo. Eles também produzir alta precisão e linearidade ao longo de um amplo espectro de níveis de expressão na quantificação dos objectivos transcriptomic. O ensaio não requer a transcrição inversa do ARN, a amplificação do ADNc resultante, ou quaisquer outras reacções enzimáticas. Assim, os potenciais erros introduzidos pelos números altos ciclos de amplificação a partir de espécies de RNA com baixa abundância ou variantes de splicing raras são reduzidos pelo processo de contagem digital. Isto significa que uma grande variedade de tipos de amostras, tais como o total de purificadoARN (isto é, ARNm + miARN), RNA de amostras fixadas com formalina e embebidos em parafina (FFPE), assim como o tecido de células em bruto e lisados, podem ser utilizados com os ensaios.
ARN de interesse são detectados utilizando um par de sondas de captura e sondas (repórter), cada uma contendo uma sequência especifica de alvo que reconhece uma região correspondente no ARN alvo. A fim de assegurar a detecção de RNAs de curta duração (isto é, miARNs), a sequência de miARN madura é alongada por emparelhamento uma marcação de oligonucleótido original (miRtag) à extremidade 3 'da molécula. Um oligonucleótido de ponte, que é complementar a uma porção tanto da miARN alvo maduro e o miRtag específicos de miARN, é usado para assegurar a especificidade da sequência. As sondas de captura e reporter ligar-se a 3 'e 5' do complexo madura miARN-miRtag, respectivamente. As sondas de captura possuem um marcador de biotina na extremidade 3 ', o que lhes permite fixar à superfície de uma lâmina de vidro revestida com estreptavidina, Fixing a captura sonda-miRNA-miRtag-repórter complexo sonda ao slide. Uma corrente eléctrica é então usada para orientar o complexo sobre a superfície da corrediça, permitindo que os códigos de barras fluorescentes realizadas pela sonda repórter na extremidade 5 'para ser visualizado utilizando um microscópio e dispositivo de carga acoplado da câmara (CCD). Os códigos de barras são contadas e descodificado, obtendo-se uma contagem dos miARN alvo específicos. O código de barras fluorescente consiste de seis posições, que pode ser ocupada por um de quatro cores fluorescentes, as quais podem ser utilizadas para a construção de mais de 4000 combinações de cor-de código de barras, cada codificante para um ARN específico.
A preparação da amostra (isto é, a purificação ou preparação de ARN lisado de células / tecido), bem como a hibridação das sondas de captura e repórter, são feitas na bancada. Doze espécimes podem ser multiplexados em um único slide. Após a hibridação durante a noite, toda a preparação adicional amostra é realizado por uma estação de preparação robótico. As lâminas carregadas são depois transferidos para o ADanalisador igital para geração de imagens, contando, decodificação e processamento de dados. Os dados resultantes são importados para o software que o acompanha, onde são tratados posteriormente com um alto grau de controle do usuário. A única química, preparação simples, natureza automatizada, tipo de dados simples (contagem), e fluxo de trabalho simplificado geral do ensaio facilitar de alta precisão a expressão do gene quantificação, tornando-se uma ferramenta útil no estudo que circulam perfis de expressão de miRNA e assinaturas em condições funcionais, tais como SII.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passos críticos dentro do Protocolo
Para o ensaio de miARN em particular, é crítica a não utilizar lisados não purificados (estes podem ser utilizados em ensaios de proteína e ARNm), tal como os reagentes não foram optimizados para a utilização com lisados, e as reacções de preparação de amostras são susceptíveis de ser inibida. Além disso, os contaminantes transitar de passos de lise e purificação de ARN (por exemplo, compostos de guanidina, etanol, e fenóis) podem inibir reacções de ligação e de purificação da amostra. RNA de boa qualidade é, portanto, fundamental para a sensibilidade e precisão do ensaio miRNA.
Usando um termociclador com uma tampa aquecida é crítico para assegurar o controlo da temperatura apropriado para optimizar o desempenho de todos os passos de reacção. Durante o passo 3.5.1, é importante para não remover as tiras do termociclador, a fim de manter a temperatura durante a adição da ligase. A remoção das tiras para adicionar a ligaseirá comprometer a reação. Ao executar as etapas de hibridização, é fundamental para evitar a agitação vigorosa, pipetagem, ou tocar rapidamente quando a mistura de reagentes nos tubos, pois isso pode distorcer as sondas repórter. Para garantir o melhor desempenho e consistência, é importante para misturar reagentes nos tubos sacudindo suave. Sempre girar reações após a mistura, e usar uma nova pipeta de ponta cada vez que um reagente é dispensado para assegurar pipetagem precisa e para evitar a contaminação cruzada acidental.
Modificações e resolução de problemas
Os conjuntos de códigos pode ser personalizado para incluir apenas os alvos de interesse. Desta forma, os custos podem ser equilibrada para permitir o teste de grandes conjuntos de amostras quando se investiga mais ou validando um bio-assinatura. Sondas personalizadas podem ser projetados para genes ou não alvos disponíveis a partir do menu à la carte. Sensibilidade para alvos menos abundantes ou RNA baixa concentração pode sermanipulado por permitindo um tempo mais longo de hibridação e / ou por meio de contagem digital de resolução mais alta.
Em nosso estudo utilizamos o painel predefinido miRNA 800 alvo com RNA total a partir de sangue total; no entanto, os ensaios podem ser personalizados para incluir menos miRNAs se é necessária uma abordagem mais centrada. Um total de 24 amostras pode ser preparado num único dia, escalonados em dois conjuntos de 12, porque dois cartuchos pode confortavelmente ser passado através do processamento pós-hibridação na estação de preparação robótico e fotografada no analisador digital, o dia seguinte. processamento escalonado das amostras em lotes de 12 é importante padronizar o tempo de hibridação. Cartuchos que foram fotografadas podem ser salvos e armazenados a 4 ° C a ser digitalizado novamente caso de análises de dados sugerem que uma varredura de resolução mais alta pode melhorar a detecção de miRNAs mais raros. A detecção de moléculas mais raras podem também ser melhorada por hibridação de amostras durante mais tempo; No entanto, a hibridação pode prolongada Result em sobressaturação e só pode melhorar os resultados se as concentrações de ARN de partida são baixos (como em RNA derivado de vesículas extracelular). sensibilidade e precisão da plataforma permitem que relativamente miRNAs baixa abundância para ser contado de forma confiável.
Limitações da técnica
A plataforma de ensaio de expressão do gene descrito só acomoda até 800 alvos por matriz. Por conseguinte, não é adequado para toda miRNA-transcriptoma / estudos de transcriptoma inteiras. Apenas conhecido, descrito, e os alvos especificados podem ser detectados utilizando a plataforma, de modo que não é adequado para a descoberta de novas espécies moleculares. Outros métodos, como RNA-Seq ou outros métodos de microarray tradicionais, são mais adequados para estudos exploratórios toda transcriptoma.
Importância da Técnica em Matéria de Existentes / Métodos Alternativos
O IBS é caracterizado por uma combinação de sintomas, principalmente incluindo dor abdominal; hipersensibilidade visceral; e alterações nos hábitos intestinais, tais como diarreia frequente, constipação, ou uma combinação de ambos 9,10. IBS sintomas não têm nenhuma causa orgânica conhecida, e os pacientes não apresentam com a inflamação clinicamente significativo, perturbações histopatológicas de tecidos gastrointestinais, ou marcadores sistêmicos 9-12. A pesquisa sugere que a desregulação biológica em IBS é sutil, subclínica e heterogêneo, com temas comuns emergentes em torno de inflamação e função imunológica 10. Portanto, é necessário para controlar variação introduzida-experimentador e usar uma plataforma que foi capaz de detectar com fiabilidade perturbações sutis na expressão do gene. Os atributos exclusivos do ensaio e sistema de padronizar o processamento da amostra e reduzir experimentador manipulação por meio da automação, reduzindo variância técnica para produzir dados altamente reproduzíveis. Estas características permitem investigações focadas e produzir altamente preciso e rdados eplicable. Isto permite a detecção de perturbações subtis e perturbações entre os alvos de baixo de expressão que pode ser negligenciado ou sobrecarregadas com os sinais de alvos mais abundantes ao usar intensity- ou amplificação baseada em métodos. microarrays baseados em PCR e métodos de RNA-Seq são alternativas viáveis para o uso da plataforma descrito e pode ser atraente como alternativa quando débitos mais elevados são necessários ou quando o objetivo é caracterizar o transcriptoma completo ou procurar novas moléculas. No entanto, as alternativas podem não funcionar tão bem em precisão e sensibilidade detectar e quantificar metas raras e perturbações sutis.
Aplicações futuras ou chegar depois de dominar esta técnica
Circulando expressão miRNA em participantes IBS mostrou uma série de perturbações que foram encontrados para ser significativa e consistente dentro das categorias. Os miARNs identificados foram associados com pathwa relevanteys e condições patológicas, incluindo uma condição funcional dor (miR-342-3p: dor crônica da bexiga) 8 e inflamação (miR-150) 13. O estudo exemplo foi baseado em uma coorte exploratória utilizada para definir metas e sistemas de interesse. Uma disposição mais específica, menor miRNA foi então construído, diminuindo o custo por amostra e permitindo a grupos muito maiores para serem analisados de uma forma rentável, a fim de validar e refinar assinaturas e biomarcadores. O sistema de ensaio plataforma de expressão do gene estabelece um equilíbrio entre a natureza exploratória tradicional do microarray e mais orientada, a coleta de dados orientado a hipótese para refinar e testar assinaturas moleculares e biomarcadores 14-16. O método vai ser usado para examinar e perturbações moleculares de proteínas in vivo e em modelos in vitro, onde os miARN alvo descritos são experimentalmente sobre-expressos ou inibida. Novos ensaios de permitir a quantificação simultânea de ARNm e Proteins directamente a partir de lisados celulares e de tecidos. Além disso, através da optimização da purificação de fracções específicas de sangue periférico e excrementos (por exemplo, urina) e por a personalização e optimização de certos parâmetros de ensaio, os perfis moleculares e assinaturas das fracções de concentração de baixo peso molecular (por exemplo, fracções exosomal) será examinada.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the U.S. Department of Health and Human Services, the National Institutes of Health, the National Institute of Nursing Research, and the Division of Intramural Research to Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06; the Intramural Research Training Awards to Nicolaas H. Fourie, Ralph M. Peace, Sarah K. Abey, and Leeanne B. Sherwin; and special support from the Burroughs Wellcome Fund to Howard Hughes-NIH Research Scholar Ralph M. Peace.
The opinions expressed herein and the interpretation and reporting of these data are the responsibility of the author(s) and should not be seen as an official recommendation, interpretation, or policy of the National Institutes of Health or the United States Government.
Materials
| nCounter Prep-Station | Nanostring | N/A | Essential |
| nCounter Digital Analyzer | Nanostring | N/A | Essential |
| Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | Can use suitable equivalent |
| Centrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| MiniMicroCentrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Pipettes (1000, 100, 20, 10ul) | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Qiacube | Qiagen | 9001292 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood miRNA Kit | Qiagen | 763134 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood Tubes | VWR | 77776-026 | Can use suitable equivalent |
| nCounter Human miRNA Assay Kit | Nanostring | 150625 | Essential |
| nCounter Master Kit | Nanostring | 100050 | Essential |
| nSolver | Nanostring | N/A | Essential |
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