הפרעות של במחזור miRNAs ב תסמונת מעי רגיז זוהו באמצעות פלטפורמת ביטוי גני תפוקה הגבוהה Multiplexed
Summary
We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.
Abstract
את assay פלטפורמת ביטוי גנים מאפשר כימות חזקים מאוד לשחזור של הביטוי של עד 800 תמלילי (mRNA או miRNAs) בתגובה אחת. את assay מירנה סופרת תמלילים ידי הדמיה במישרין דיגיטלי ספירת מולקולות מירנה כי מסומן עם ערכות בדיקת המינימרקטים ניאון בצבעים (בדיקת כתב בדיקה לכידה). ברקודים הם הכלאה ישירות להבשיל miRNAs כי כבר מוארך ידי ligating תג oligonucleotide ייחודי (miRtag) עד הסוף '3. שעתוק הגברה הפוך של התמלילים אינם נדרשים. בדיקות Reporter להכיל רצף של שש עמדות צבע המאוכלסות באמצעות שילוב של ארבעה צבעי ניאון. ארבעת הצבעים על פני שש עמדות משמשים כדי לבנות רצף ברקוד צבע גן ספציפי. עיבוד פוסט כלאה הוא אוטומטית על תחנת הכנת רובוטית. לאחר כלאה, החלליות העודפות נשטפות, ואת המבנים המשולשים (פרו ללכודחללית-מירנה-עיתונאי להיות) שתוקנה לשקופית streptavidin מצופה באמצעות החללית ללכוד שכותרתו ביוטין. ספירת הדמיה ברקוד נעשית באמצעות נתח דיגיטלי. MiRNAs המינימרקטים המשותק הם דמיינו הדמיה באמצעות מיקרוסקופ מצלמה, ואת ברקודים הייחודיים מפוענחים ומנה. בקרת איכות נתונים (קוו), נורמליזציה, וניתוח הם הקלו על ידי תוכנה אישית מעוצב עיבוד נתונים וניתוח המלווה את תוכנת assay. את assay מדגים ליניאריות גבוהה על פני טווח רחב של ביטוי, כמו גם רגישות גבוהה. לדוגמא והכנת assay אינה כרוכה תגובות אנזימטיות, שעתוק לאחור, או הגברה; יש כמה צעדים; והוא אוטומטי בעיקר הקטנת השפעה חוקרת וכתוצאה מכך עקביות גבוהה שחזור טכני. כאן, אנו מתארים את היישום של טכנולוגיה זו לזיהוי הפרעות מירנה במחזור תסמונת מעי רגיז.
Introduction
תסמונת המעי הרגיז (IBS) היא האבחנה אשפוז הנפוץ ביותר לגסטרואנטרולוגיה, שפוקדת 10 – 15% מכלל האוכלוסייה וייצוג נטל משמעותי על שירותי בריאות. נכון לעכשיו, אין הם מקובלים סמנים ביולוגיים לאבחון IBS (כלומר, האבחנה מבוססת על תסמינים קליניים ו פוסלים הפרעות אורגניות אחרות, כגון ממאירות במערכת העיכול, מחלות מעי דלקתיות, ומערכת העיכול (GI) זיהומים). כאשר לומדים פרופילי ביטוי גני מצבים שכיחים עם histopathology תת קליני, כגון תסמונת מעי רגיז, רגישות גבוהה ודיוק (שחזור) יש צורך, כמו הפרעות פרופילי ביטוי גנים הן בדרך כלל עדינות 1-3. miRNAs זוהה שני מטרות האבחון הפונקציונליות IBS 4,5, ואנחנו מעוניינים במיוחד בהערכת השימוש שלהם כמו במחזור ביומרקרים של 3,4,6,7 הפרעות ביולוגיות הקשורים IBS. הניצול הקליני של circulaביומרקרים טינג הוא של ריבית הנוכחית בשל הקלות וטבע פולשנית של האוסף של "מקור הסמנים הביולוגיים (למשל, דם היקפי) מחולים.
מבחני פלטפורמת התבטאות גנים, בגלל הכימיה הייחודית שלהם יעילה, זרימת העבודה אוטומטית בעיקר, לספק פלטפורמת microarray המספקת כיסוי רחב להתאמה אישית (800 מטרות לתגובה אחת) של transcriptome על גילוי ממוקד. הם גם להניב דיוק ליניאריות גבוה על פני ספקטרום רחב של רמות ביטוי הכימות של מטרות transcriptomic. את assay אינו מחייב את שעתוק לאחור של RNA, הגברה של וכתוצאה cDNA, או כל תגובות אנזימטיות אחרים. לפיכך, שגיאות פוטנציאליות שהנהיגו את מספרי מחזור הגבוהים של הגברה ממיני RNA עם שפע נמוך או גרסות אחוי נדירות מופחתות על ידי התהליך של ספירה דיגיטלית. משמעות הדבר היא כי מגוון רחב של סוגי מדגם, כגון כולל מטוהריםRNA (כלומר, mRNA + מירנה), RNA מן-מוטבע פרפין קבוע פורמלין (FFPE) דגימות, כמו גם lysates רקמות תאים גולמיים, ניתן להשתמש עם המבחנים.
RNAs של עניין מזוהה באמצעות זוג חלליות (לכידת בדיקות כתב), שכל אחת מהן מכיל רצף מסוים-יעד שמכיר אזור מתאים על RNA היעד. על מנת להבטיח זיהוי של RNAs הקצר (כלומר, miRNAs), רצף מירנה הבוגר מוארך על ידי חישול תג oligonucleotide ייחודי (miRtag) עד סוף '3 של המולקולה. Oligonucleotide גישור, אשר משלים חלק השני של מירנה היעד הבוגר ואת miRtag מירנה הספציפי, משמש כדי להבטיח סגולי רצף. לכידה וכתב בדיקות ולקשור אל 3 'ו 5' מסתיימת של מתחם מירנה-miRtag הבוגרת, בהתאמה. הבדיקות הלכידות יש תווית ביוטין על 'סוף 3, אשר מאפשרת להם לצרף אל פני השטח של שקופיות זכוכית מצופית-streptavidin, fixing במתחם החללי ללכוד בדיקת מירנה-miRtag-כתב לשקופית. זרם חשמלי לאחר מכן נעשה שימוש כדי לכוון את המורכבות על פני שטח השקופיות, המאפשר ברקודים פלורסנט נישאו על ידי חללית הכתב על קצה '5 להיות דמיינו באמצעות מיקרוסקופ ומכשיר תשלום מצמיד (CCD) מצלמה. ברקודים נספרים מפוענח, מניב ספירה של miRNAs היעד המבוקש. הברקוד פלורסנט מורכב משש עמדות שניתן שנכבשו על ידי אחד מארבעת בצבעי ניאון, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לבנות למעלה מ -4,000 שילובי צבעים-ברקוד, כל קידוד עבור RNA ספציפי.
להכנת דגימות (כלומר, טיהור RNA או הכנת lysate תא / רקמה), כמו גם הכלאה של בדיקות ללכוד כתב, נעשית על הספסל. שנים עשר דגימות יכול להיות מרובבים בשקופית אחת. לאחר ההכלאה בין הלילה, כל הכנת הדגימה הנוספת מבוצעת על ידי תחנת הכנת רובוטית. השקופיות נטענות מועברות לאחר מכן למודעהמנתח igital הדמיה, ספירה, פענוח, ועיבוד נתונים. כתוצאת הנתונים מיובאים התוכנה הנלווית, שם הם מעובדים נוספים עם רמה גבוהה של שליטה של משתמש. הכימיה הייחודית, הכנה פשוטה, טבע אוטומטי, סוג נתונים פשוט (ספירות), ואת זרימת עבודה יעילה כוללת של assay להקל כימות ביטוי גני דיוק גבוה, מה שהופכת אותו לכלי שימושי בלימוד פרופילי ביטוי מירנה במחזור וחתימות בתנאים פונקציונליים, כגון IBS.
Protocol
Representative Results
Discussion
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
עבור assay מירנה בפרט, חשוב לא להשתמש lysates unpurified (אלה יכולים לשמש mRNA מבחני חלבון), כמו ריאגנטים שלא היו מותאמים לשימוש עם lysates, ותגובות הכנת המדגם צפויות להיות מעוכב. בנוסף, מזהמים שמקורם השלבים לטיהור תמוגה ו- RNA (למשל, תרכובות guanidinium, אתנול, ו פנולים) יכול לעכב תגובות קשירת מדגם טיהור. RNA באיכות טובה ולכן קריטי רגישות ודיוק של assay מירנה.
באמצעות thermocycler עם מכסה מחומם הוא קריטי כדי להבטיח בקרת טמפרטורה נאותה כדי למטב את הביצועים של כל צעדי התגובה. במהלך שלב 3.5.1, חשוב שלא להסיר את הפסים מן thermocycler על מנת לשמור על הטמפרטורה במהלך התוספת של האנזים. הסרת הרצועות להוסיף את האנזיםיתפשר התגובה. בעת ביצוע השלבים הכולים, הוא קריטי כדי למנוע טלטול נמרץ, pipetting, או מצליף כאשר ערבוב חומרים כימיים בתוך הצינורות, מכיוון שהדבר עלול גזירת חלליות הכתב. כדי להבטיח ביצועים מיטביים ועקביות, חשוב לערבב ריאגנטים ביסודיות צינורות ידי מצליף עדין. תמיד ספין למטה בתגובות לאחר הערבוב, ולהשתמש פיפטה חדש להטות בכל פעם מגיבה הוא חלק כדי להבטיח pipetting מדויק כדי למנוע זיהום צולב בשוגג.
שינויים ופתרון בעיות
מגדיר הקוד יכול להיות מותאם אישית כדי לכלול מטרות רק עניין. בדרך זו, עלויות יכולות להיות מאוזנות כדי לאפשר הבדיקה של ערכות מדגם גדולות כאשר נוסף חוקר או על מנת לאשר ביו-חתימה. בדיקות מותאמות אישית יכולות להיות מיועדות גנים או מטרות לא זמינים מתפריט א-לה-קארט. רגישויות מטרות פחות שופעות או RNA נמוך ריכוז יכולות להיותמניפולציות על ידי הוספת זמן הכלאה ארוכה יותר ו / או באמצעות ספירה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה יותר.
במחקר שלנו השתמשנו בלוח מירנה המוגדר מראש 800 היעד עם RNA הכולל דם כולו; עם זאת, יכולים להיות מותאמים אישית המבחנים לכלול miRNAs פחות אם גישה ממוקדת יותר יש צורך. סך של 24 דגימות ניתן להכין ביום אחד, מעד בשני סטים של 12, כי שתי מחסניות ניתן להעביר בנוחות באמצעות עיבוד פוסט כלאה בתחנת הכנת רובוטיות צלמו על המנתח הדיגיטלי למחרת. עיבוד מדורג של דגימות בקבוצות של 12 חשוב לתקנן את זמן ההכלאה. מחסניות כי כבר צלמו ניתן לשמור ולאחסן ב 4 מעלות צלסיוס ייסרק מחדש אם ניתוחי נתונים מראים כי סריקה ברזולוציה גבוהה יותר עשויה לשפר את זיהוי של miRNAs הנדיר. איתור של מולקולות נדירות עשוי גם להיות משופר על ידי והכלאת דגימות למשך זמן ארוך יותר; עם זאת, הכלאה ממושכת עלולה Result ב oversaturation ועשוי לשפר את התוצאות רק אם ריכוזי RNA החל נמוכים (כמו RNA שלפוחית נגזרות התאי). הרגישות של הפלטפורמה ודיוק לאפשר יחסית miRNAs נמוך שפע ייספר באופן מהימן.
מגבלות של הטכניקה
פלטפורמת assay ביטוי גנים לתאר רק להכיל עד 800 יעדים לכל מערך. לכן הוא לא מתאים ללימודים transcriptome transcriptome-מירנה שלם / כולו. רק ידוע, תאר, ואת היעדים שצוינו ניתן לאתר באמצעות הפלטפורמה, כך שהוא אינו מתאים לגילוי מינים מולקולריים חדשים. שיטות אחרות, כגון RNA-seq או שיטות microarray מסורתיות אחרות, מתאימות יותר ללימודי גישוש transcriptome השלם.
משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות חלופיות
IBS מאופיין על ידי שילוב של תסמינים, principally כולל כאבי בטן; רגישות יתר קרביים; ושינויים בהרגלי היציאות, כגון שלשולים תכופים, עצירות, או שילוב של שניהם 9,10. אין סיבה אורגנית ידועה סימפטומי IBS, וחולים אינם מציגים עם דלקת משמעות קלינית, פרעות histopathological של רקמות של מערכת עיכול, או סמנים מערכתיים 9-12. מחקרים מראים כי חוסר וויסות ביולוגי IBS הוא עדין, תת קלינית, והטרוגנית, עם המתעוררים נושאים משותפים סביב פונקציה דלקת החיסון 10. לכן, אנחנו צריכים לשלוט וריאציה הציג הנסיין ולהשתמש פלטפורמה הייתה מסוגל לאתר הפרעות עדינות אמינים ביטוי גנים. המאפיינים הייחודיים של assay והמערכת לתקנן עיבוד מדגם ולהפחית הנסיין טיפול באמצעות אוטומציה, צמצום שונה טכני להפיק נתונים לשחזור ביותר. תכונות אלו מאפשרות חקירות ממוקדות לייצר מדויק מאוד rנתוני eplicable. זה מאפשר זיהוי של הפרעות עדינות הפרעות בין מטרות נמוך ביטוי ניתן להתעלם או מוצפות על ידי האותות של מטרות שופעות יותר כאשר משתמשים בשיטות intensity- או מבוסס הגברה. microarrays המבוסס PCR ושיטות RNA-seq חלופות קיימא באמצעות הפלטפורמה תארה ועלול להיות אטרקטיבי כפי חלופי כאשר תפוקה גבוהה יותר נדרשות או כאשר המטרה היא לאפיין את transcriptome השלם או לחפש מולקולות רומן. עם זאת, חלופות לא תתפקדנה היטב במדויק וברגישות איתור quantitating מטרות נדירות הפרעות עדינות.
יישומים עתידיים או כיווני לאחר מאסטרינג טכניקה זו
במחזור ביטוי מירנה המשתתפים IBS הראה מספר הפרעות שנמצאו להיות גם הוא משמעותי ומתואם בתוך קטגוריות. MiRNAs המזוהה נקשר pathwa הרלוונטיys ו במצבים פתולוגיים, לרבות בתנאי כאב תפקודיים (Mir-342-3p: כאב בשלפוחית כרוני) 8 ודלקת (Mir-150) 13. המחקר למשל התבסס על עוקבת גישוש המשמשת להגדרת מטרות ומערכות של עניין. עם מיקוד יותר, מערך מירנה קטן נבנה אז, הפחתת מחיר העלות מדגמת ומאפשר מחזורים הרבה יותר גדול להיות מנותחים באופן חסכוני כדי לאמת ולעדן חתימות סמנים ביולוגיות. מערכת assay פלטפורמת ביטוי הגנים מאזנת בין האופי המסורתי הגישוש של microarray וממוקדת יותר, איסוף נתונים מונחה שערה כדי לשכלל ולבחון חתימות מולקולריות ביומרקרים 14-16. השיטה תשמש לבחון הפרעות מולקולריות חלבון in vivo ו במודלים חוץ גופייה שבה miRNAs היעד המתואר הם ניסיוני ביטוי יתר או עכבות. מבחני ניו לאפשר כימות סימולטני של mRNAs ו- proteins ישירות lysates תאים ורקמות. יתר על כן, על ידי אופטימיזציה של הטיהור של שברים מסוימים של דם היקפי וצואה (למשל, שתן) ועל ידי התאמה אישית ואופטימיזציה פרמטרי assay מסוימים, פרופילים מולקולריים וחתימות שברי ריכוז מולקולרי נמוכים (למשל, שברי exosomal) ייבדק.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the U.S. Department of Health and Human Services, the National Institutes of Health, the National Institute of Nursing Research, and the Division of Intramural Research to Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06; the Intramural Research Training Awards to Nicolaas H. Fourie, Ralph M. Peace, Sarah K. Abey, and Leeanne B. Sherwin; and special support from the Burroughs Wellcome Fund to Howard Hughes-NIH Research Scholar Ralph M. Peace.
The opinions expressed herein and the interpretation and reporting of these data are the responsibility of the author(s) and should not be seen as an official recommendation, interpretation, or policy of the National Institutes of Health or the United States Government.
Materials
| nCounter Prep-Station | Nanostring | N/A | Essential |
| nCounter Digital Analyzer | Nanostring | N/A | Essential |
| Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | Can use suitable equivalent |
| Centrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| MiniMicroCentrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Pipettes (1000, 100, 20, 10ul) | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Qiacube | Qiagen | 9001292 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood miRNA Kit | Qiagen | 763134 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood Tubes | VWR | 77776-026 | Can use suitable equivalent |
| nCounter Human miRNA Assay Kit | Nanostring | 150625 | Essential |
| nCounter Master Kit | Nanostring | 100050 | Essential |
| nSolver | Nanostring | N/A | Essential |
References
- Aerssens, J., et al. Alterations in Mucosal Immunity Identified in the Colon of Patients With Irritable Bowel Syndrome. Clin Gastroenterol Hepatol. 6, 194-205 (2008).
- Akbar, A., et al. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57, 923-929 (2008).
- Fourie, N. H., et al. Elevated circulating miR-150 and miR-342-3p in patients with irritable bowel syndrome. Exp Mol Pathol. 96, 422-425 (2014).
- Zhou, Q., Souba, W. W., Croce, C. M., Verne, G. N. MicroRNA-29a Regulates Intestinal Membrane Permeability in Patients with Irritable Bowel Syndrome. Gut. 59, 775-784 (2010).
- Zhou, Q., Verne, G. N. miRNA-based therapies for the Irritable Bowel Syndrome. Expert Opin Biol Ther. 11, 991-995 (2011).
- Orlova, I. A., et al. MicroRNA modulation in complex regional pain syndrome. J Transl Med. 9, 1-11 (2011).
- Park, C. -. K., et al. Extracellular MicroRNAs Activate Nociceptor Neurons to Elicit Pain via TLR7 and TRPA1. Neuron. 82, 47-54 (2014).
- Gheinani, A. H., Burkhard, F. C., Monastyrskaya, K. Deciphering microRNA code in pain and inflammation: lessons from bladder pain syndrome. Cell Mol Life Sci. 70, 3773-3789 (2013).
- Drossman, D. A., et al. . Rome III: The Functional Gastrointestinal Disorders. , (2006).
- Chey, W. D., Kurlander, J., Eswaran, S. Irritable bowel syndrome: A clinical review. JAMA. 313, 949-958 (2015).
- Del Valle-Pinero, A. Y., Sherwin, L. B., Anderson, E. M., Caudle, R. M., Henderson, W. A. Altered vasoactive intestinal peptides expression in irritable bowel syndrome patients and rats with trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. World J Gastroenterol. 21, 155-163 (2015).
- Henderson, W. A., et al. Inverse relationship of interleukin-6 and mast cells in children with inflammatory and non-inflammatory abdominal pain phenotypes. World J Gastrointest Pathophysiol. 3, 102-108 (2012).
- Pekow, J. R., Kwon, J. H. MicroRNAs in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 18, 187-193 (2012).
- Veldman-Jones, M. H., et al. Flexible Molecular Subtyping of Clinical DLBCL Samples Using the NanoString nCounter System. Clin Cancer Res. 21, 2367-2378 (2015).
- Lee, J., et al. Nanostring-Based Multigene Assay to Predict Recurrence for Gastric Cancer Patients after Surgery. PLoS ONE. 9, e90133 (2014).
- Lohavanichbutr, P., et al. A 13-gene signature prognostic of HPV-negative OSCC: discovery and external validation. Clin Cancer Res. 19, 1197-1203 (2013).
- . . nCountermiRNA Expression Assay User Manual (MAN-C0009-05). , (2013).
