Возмущения Циркулирующие микроРНК при синдроме раздраженного кишечника Обнаружен Использование Multiplexed высокой пропускной способностью экспрессии генов платформы
Summary
We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.
Abstract
Платформа анализа экспрессии генов позволяет надежной и высоко воспроизводимой количественной оценки экспрессии до 800 транскриптов (мРНК или микроРНК) в одной реакции. Анализ микроРНК подсчитывает транскриптов путем непосредственного формирования изображения и в цифровой форме подсчета молекул микроРНК, маркированные с цветными флуоресцентными наборов зондов со штрих (репортер зонда и захват зонда). Штрихкоды гибридизуют непосредственно созревать микроРНК, которые были удлиненные лигированием уникальный олигонуклеотидный тег (miRtag) к 3'-концу. Обратную транскрипцию и амплификацию транскриптов не требуются. Reporter зонды содержат последовательность из шести цветовых позиций заселенных с использованием комбинации из четырех флуоресцентных цветов. Четыре цвета более шести позиций используются для построения ген-специфической последовательности цвет штрих-кода. Постобработка-гибридизация автоматизирован на роботизированной подготовительную станцию. После гибридизации избыточные зонды смыло, и трехсторонними структурами (Capture Proбыть-микроРНК-репортер зонда) закреплены на покрытых стрептавидином ползуна через меченных биотином захвата зонда. Обработки изображений и штрих-код счета осуществляется с помощью цифрового анализатора. Иммобилизованные Barcoded микроРНК визуализируются и визуализируют с помощью микроскопа и камеры, а также уникальные штрих-коды декодируются и подсчитываются. Контроль качества данных (QC), нормализацию и анализ облегчается с помощью программного обеспечения для обработки и анализа пользовательских разработанных данных, сопровождающий программное обеспечение для анализа. Анализ показывает высокую линейность в широком диапазоне экспрессии, а также высокую чувствительность. Образец и подготовка анализа не включает ферментативные реакции, обратной транскрипции или амплификации; имеет несколько шагов; и в значительной степени автоматизирован, что снижает следователь эффекты и приводит к высокой согласованности и технической воспроизводимости. Здесь мы опишем применение этой технологии для выявления циркулирующие возмущения микроРНК при синдроме раздраженного кишечника.
Introduction
Синдром раздраженного кишечника (СРК) является наиболее распространенной амбулаторной диагностики в гастроэнтерологии, поражающих 10 – 15% от общей численности населения и представляющих значительную нагрузку на службы здравоохранения. В настоящее время, к сожалению, нет общепринятых диагностических биомаркеров для IBS (т.е. диагноз на основе клинических симптомов и исключает другие органические расстройства, такие как GI злокачественности, воспалительные заболевания кишечника и желудочно – кишечного тракта (GI) инфекции). При изучении профилей экспрессии генов в общих условиях с субклиническим гистопатологией, таких как IBS, высокая чувствительность и точность (воспроизводимость) необходимы, так как возмущения в профилях экспрессии генов часто являются тонкими 1-3. микроРНК были идентифицированы как диагностические и функциональные цели в IBS 4,5, и мы особенно заинтересованы в оценке их использование в качестве циркулирующих биомаркеров IBS-ассоциированных биологических возмущений 3,4,6,7. Клиническое использование циркуляциейтин биомаркеры представляет интерес в настоящее время из – за легкости и минимально инвазивной характер коллекции источника биомаркеров "(например, периферической крови) у пациентов.
Генные анализы экспрессии платформы, из-за их уникальной химии и обтекаемый, в основном автоматизированный рабочий процесс, обеспечить платформу микрочипов, которая обеспечивает широкий охват и настраиваемый (800 мишеней в одной реакции) транскриптома для целенаправленного обнаружения. Кроме того, они дают высокую точность и линейность в широком спектре уровней экспрессии в квантификации транскриптомных целей. Анализ не требует обратной транскрипции РНК, амплификации в результате кДНК, или любые другие ферментативные реакции. Таким образом, потенциальные ошибки, вносимые большим числом циклов амплификации из видов РНК с низким изобилием или редкими сплайс уменьшаются в процессе цифрового подсчета. Это означает, что большое разнообразие типов образцов, например, очищенную общей сложностиРНК (т.е., мРНК + микроРНК), РНК из фиксированных формалином погруженных в парафин (FFPE) образцов, а также сырой ткани и клеточных лизатов, могут быть использованы с анализами.
РНК интересов обнаруживаются с помощью пары зондов (захват и репортер зондов), каждая из которых содержит последовательность специфичных для мишени, распознающий соответствующую область на РНК-мишени. Для того , чтобы обеспечить обнаружение коротких РНК (т.е., микроРНК), зрелой последовательности микроРНК удлиняется путем отжига уникальный олигонуклеотидный метки (miRtag) к 3' – концу молекулы. Мостиковую олигонуклеотид, который комплементарен части как зрелый целевой микроРНК и микроРНК-специфической miRtag, используется для обеспечения последовательности специфичности. Захват и репортер зондов лигировать к 3 'и 5' концы зрелого комплекса микроРНК-miRtag соответственно. Зонды захвата имеют метку биотин на 3'-конце, которые позволяют им прикрепляться к поверхности покрытых стрептавидином предметное стекло, FIXIнг улавливающей зонд-микроРНК-miRtag-репортер зонда комплекса на слайде. Электрический ток затем используется для ориентации комплекса на поверхности скольжения, позволяя флуоресцентные штрих-коды, переносимые репортер зонда на 5 'конце, чтобы быть визуализированы с помощью микроскопа и прибор с зарядовой связью (CCD) камеры. Штрихкоды подсчитываются и декодированию, что дает подсчет конкретных целевых микроРНК. Флуоресцентные штрих-кода состоит из шести позиций, которые могут быть заняты одним из четырех флуоресцентных цветов, которые могут быть использованы для построения более 4000 комбинаций цветовой штрих-кодов, каждый кодирующий специфической РНК.
Подготовка образца (т.е., очистка РНК или клеток / ткани препарат лизата), а также гибридизация захвата и репортер зондов, сделаны на скамейке запасных. Двенадцать образцов могут быть мультиплексированы на одном слайде. После гибридизации в течение ночи, вся дальнейшая подготовка образца осуществляется роботизированной подготовительную станцию. Загруженные слайды, которые затем передаются на объявлениеigital анализатор для работы с изображениями, подсчета голосов, декодирования и обработки данных. Полученные данные импортируются в сопроводительного программного обеспечения, где они дополнительно обрабатываются с высокой степенью контроля пользователя. Уникальная химия, простая подготовка, автоматизированная природа, простой тип данных (счетчики), и в целом упорядоченный документооборот данного анализа облегчают высокоточной экспрессии генов количественной оценки, что делает его полезным инструментом при изучении циркулирующие профилей экспрессии микроРНК и подписи в функциональных состояниях, таких как IBS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги в рамках Протокола
Для анализа микроРНК, в частности, важно, чтобы не использовать неочищенную лизатов (они могут быть использованы в мРНК и белкового анализа), так как реагенты не были оптимизированы для использования с лизатов, и реакции подготовки образца могут быть подавлена. Кроме того, загрязняющие вещества , перенесенных с стадий очистки лизис и РНК (например, гуанидиния соединений, этанол и фенолов) могут ингибировать лигирования и очистки образца реакции. Хорошее качество РНК Поэтому крайне важно, чтобы чувствительность и точность анализа микроРНК.
Использование Термоциклер с подогревом крышкой имеет решающее значение для обеспечения надлежащего контроля температуры, чтобы оптимизировать производительность всех стадий реакции. Во время этапа 3.5.1, важно, чтобы не удалить полоски из амплификатора для того, чтобы поддерживать температуру во время добавления лигазы. Удаление полоски для добавления лигазыухудшала реакцию. При проведении операций гибридизации, важно, чтобы избежать интенсивного встряхивания, пипетирования или щелкать при смешивании реагентов в трубах, так как это может сдвигать репортер зондов. Для обеспечения оптимальной производительности и последовательности, важно тщательно перемешать реагенты в трубках путем осторожного стряхивая. Всегда со спином вниз реакции после смешивания, и использовать новый наконечник пипетки каждый раз, когда реагент дозируется для обеспечения точного пипетирования и во избежание случайного перекрестного загрязнения.
Модификации и устранение неисправностей
Эти кодовые наборы могут быть настроены для включения только цели, представляющие интерес. Таким образом, расходы могут быть сбалансированы, чтобы позволить проводить тестирование больших наборов образцов при дальнейшем исследовании или проверки био-подпись. Пользовательские зонды могут быть сконструированы для генов или нет целей , доступных в меню а ля карт. Чувствительность для менее распространенных целей или низкой концентрации РНК может бытьманипулировали, позволяя в течение более длительного времени, гибридизация и / или с помощью более высокого разрешения цифрового подсчета.
В нашем исследовании мы использовали предопределенную 800 целевой микроРНК панель с тотальной РНК из цельной крови; Однако, анализы могут быть настроены, чтобы включать в себя меньшее количество микроРНК, если более целенаправленный подход необходим. В общей сложности 24 образцов могут быть приготовлены в один день, в шахматном порядке в два набора из 12, так как два картриджа с комфортом можно пропустить через обработки после гибридизации на роботизированной подготовительную станцию и отображается на цифровом анализаторе на следующий день. Staggered обработка выборок в партиях от 12 важно, чтобы унифицировать время гибридизации. Картриджи , которые были изображаемого могут быть сохранены и храниться при перепроверялись 4 ° С , если анализ данных позволяют предположить , что более высокое разрешение сканирования может улучшить обнаружение более редких микроРНК. Обнаружение более редких молекул также может быть улучшена путем гибридизации образцы дольше; Однако, длительное гибридизация может Ресулт в перенасыщенности и может только улучшить результаты, если исходные концентрации РНК являются низкими (как во внеклеточной везикул производных РНК). Чувствительность и точность Платформе позволяют относительно низкой численности микроРНК быть достоверно подсчитаны.
Ограничения техники
Описанный анализ экспрессии генов только платформа вмещает до 800 целей на массив. Поэтому не подходит для всего микроРНК-транскриптом / целые исследования транскриптом. Только известно, описано, и указанные цели могут быть обнаружены с помощью платформы, поэтому он не подходит для открытия новых видов молекул. Другие методы, такие как Секвенирование РНК или другие традиционные методы микрочипов, больше подходят для целом транскриптом разведочных работ.
Значимость техники в отношении существующих / альтернативных методов
СРК характеризуется сочетанием симптомов, Принв том числе боли образом в трудах брюшной полости; висцеральная гиперчувствительность; и изменения в привычках кишечника, такие как частые диарея, запор, или комбинацией обоих 9,10. Симптомы СРК не имеют никаких известных органических причин, и пациенты не представляют с клинически значимого воспаления, гистологических возмущениям желудочно – кишечных тканей или системных маркеров 9-12. Исследования показывают , что биологическая дисрегуляция в IBS является тонким, субклинический и гетерогенный, с общие темы возникающие вокруг воспаления и иммунной функции 10. Таким образом, нам необходимо контролировать экспериментатора с введенным вариацию и использовать платформу, способную надежно обнаруживать тонкие возмущения в экспрессии генов. Уникальные атрибуты анализа и системы стандартизации обработки проб и уменьшить экспериментатора обработки за счет автоматизации, уменьшая техническую дисперсию для получения высокой воспроизводимости данных. Эти особенности позволяют целенаправленных исследований и производить высокоточную и гeplicable данных. Это позволяет для обнаружения тонких возмущений и возмущений среди низкой экспрессии мишеней, которые могут быть пропущены или завален сигналами более обильными мишеней при использовании по интенсивности или амплификации на основе методов. Основанные на ПЦР-микрочипов и методы Секвенирование РНК являются приемлемой альтернативой с использованием описанного платформы и может быть привлекательным в качестве альтернативы, когда более высокие пропускные способности необходимы или когда цель состоит в том, чтобы охарактеризовать весь транскриптом или искать новых молекул. Тем не менее, альтернативы не может выполнить, а в точно и чутко обнаружения и количественной оценки редкие цели и тонкие возмущения.
Будущие приложения или направления после освоения этой технике
Циркулирующие экспрессия микроРНК у участников IBS показала ряд возмущений, которые были найдены, чтобы быть как значительными и последовательными в рамках категорий. Выявленные микроРНК были связаны с соответствующими pathwaYS и патологические состояния, в том числе функциональное состояние боли (MIR-342-3p: хроническая боль в мочевом пузыре) 8 и воспаления (MIR-150) 13. Пример исследование было основано на разведочной группы, используемой для определения целевых показателей и систем, представляющих интерес. Более целенаправленной, меньший массив микроРНК Затем была построена, опускании на стоимости образца и позволяет значительно больших когорт, которые будут проанализированы в экономически эффективным образом с целью подтверждения и уточнения подписей и биомаркеров. Система платформы анализа экспрессии генов баланс между традиционным поисковым характером микрочипов и более целенаправленной, обусловленного гипотезами сбора данных для уточнения и проверки подписей и молекулярных биомаркеров 14-16. Метод будет использоваться для изучения молекулярных и белковые возмущения в в естественных условиях и в моделях пробирке , где описанные мишени микроРНК экспериментально сверхвыражен или законсервировано. Новые анализы позволяют для одновременного количественного определения мРНК и рroteins непосредственно из клеток и тканей лизатов. Кроме того, за счет оптимизации очистки определенных фракций периферической крови и экскрементов (например, мочи) и путем настройки и оптимизации некоторых параметров анализа, молекулярные профили и подписи низких фракций концентрации молекул (например, exosomal фракции) будут рассмотрены.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the U.S. Department of Health and Human Services, the National Institutes of Health, the National Institute of Nursing Research, and the Division of Intramural Research to Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06; the Intramural Research Training Awards to Nicolaas H. Fourie, Ralph M. Peace, Sarah K. Abey, and Leeanne B. Sherwin; and special support from the Burroughs Wellcome Fund to Howard Hughes-NIH Research Scholar Ralph M. Peace.
The opinions expressed herein and the interpretation and reporting of these data are the responsibility of the author(s) and should not be seen as an official recommendation, interpretation, or policy of the National Institutes of Health or the United States Government.
Materials
| nCounter Prep-Station | Nanostring | N/A | Essential |
| nCounter Digital Analyzer | Nanostring | N/A | Essential |
| Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | Can use suitable equivalent |
| Centrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| MiniMicroCentrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Pipettes (1000, 100, 20, 10ul) | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Qiacube | Qiagen | 9001292 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood miRNA Kit | Qiagen | 763134 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood Tubes | VWR | 77776-026 | Can use suitable equivalent |
| nCounter Human miRNA Assay Kit | Nanostring | 150625 | Essential |
| nCounter Master Kit | Nanostring | 100050 | Essential |
| nSolver | Nanostring | N/A | Essential |
References
- Aerssens, J., et al. Alterations in Mucosal Immunity Identified in the Colon of Patients With Irritable Bowel Syndrome. Clin Gastroenterol Hepatol. 6, 194-205 (2008).
- Akbar, A., et al. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57, 923-929 (2008).
- Fourie, N. H., et al. Elevated circulating miR-150 and miR-342-3p in patients with irritable bowel syndrome. Exp Mol Pathol. 96, 422-425 (2014).
- Zhou, Q., Souba, W. W., Croce, C. M., Verne, G. N. MicroRNA-29a Regulates Intestinal Membrane Permeability in Patients with Irritable Bowel Syndrome. Gut. 59, 775-784 (2010).
- Zhou, Q., Verne, G. N. miRNA-based therapies for the Irritable Bowel Syndrome. Expert Opin Biol Ther. 11, 991-995 (2011).
- Orlova, I. A., et al. MicroRNA modulation in complex regional pain syndrome. J Transl Med. 9, 1-11 (2011).
- Park, C. -. K., et al. Extracellular MicroRNAs Activate Nociceptor Neurons to Elicit Pain via TLR7 and TRPA1. Neuron. 82, 47-54 (2014).
- Gheinani, A. H., Burkhard, F. C., Monastyrskaya, K. Deciphering microRNA code in pain and inflammation: lessons from bladder pain syndrome. Cell Mol Life Sci. 70, 3773-3789 (2013).
- Drossman, D. A., et al. . Rome III: The Functional Gastrointestinal Disorders. , (2006).
- Chey, W. D., Kurlander, J., Eswaran, S. Irritable bowel syndrome: A clinical review. JAMA. 313, 949-958 (2015).
- Del Valle-Pinero, A. Y., Sherwin, L. B., Anderson, E. M., Caudle, R. M., Henderson, W. A. Altered vasoactive intestinal peptides expression in irritable bowel syndrome patients and rats with trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. World J Gastroenterol. 21, 155-163 (2015).
- Henderson, W. A., et al. Inverse relationship of interleukin-6 and mast cells in children with inflammatory and non-inflammatory abdominal pain phenotypes. World J Gastrointest Pathophysiol. 3, 102-108 (2012).
- Pekow, J. R., Kwon, J. H. MicroRNAs in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 18, 187-193 (2012).
- Veldman-Jones, M. H., et al. Flexible Molecular Subtyping of Clinical DLBCL Samples Using the NanoString nCounter System. Clin Cancer Res. 21, 2367-2378 (2015).
- Lee, J., et al. Nanostring-Based Multigene Assay to Predict Recurrence for Gastric Cancer Patients after Surgery. PLoS ONE. 9, e90133 (2014).
- Lohavanichbutr, P., et al. A 13-gene signature prognostic of HPV-negative OSCC: discovery and external validation. Clin Cancer Res. 19, 1197-1203 (2013).
- . . nCountermiRNA Expression Assay User Manual (MAN-C0009-05). , (2013).
