Störeinflüsse von Zirkulierende miRNAs in Irritable Bowel Syndrome erkannt einen Multiplexed Hochdurchsatz-Gene Expression-Plattform
Summary
We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.
Abstract
Die Genexpressions Plattform Assay ermöglicht robust und hoch reproduzierbare Quantifizierung der Expression von bis zu 800 Transkripte (mRNA oder miRNAs) in einer einzigen Reaktion. Die miRNA-Test zählt Transkripte durch direktes Abbilden und miRNA-Moleküle digital zu zählen, die mit farbcodierten fluoreszierenden barcodierte Sondensätze (eine Reportersonde und eine Fangsonde) markiert sind. Barcodes sind hybridisierte direkt miRNAs zu reifen, die durch Ligieren eines einzigartigen Oligonukleotid-Markierung (miRtag) an das 3'-Ende verlängert worden sind. Reverse Transkription und Amplifizierung der Transkripte sind nicht erforderlich. Reportersonden enthalten eine Sequenz von sechs Farbpositionen unter Verwendung einer Kombination von vier fluoreszierenden Farben gefüllt. Die vier Farben über sechs Positionen werden verwendet, um ein Gen-spezifischen Farb Barcode-Sequenz zu konstruieren. Post-Hybridisierung Verarbeitung an einem Roboter-Vorbereitungsstation automatisiert. Nach der Hybridisierung werden die überschüssigen Sonden weggewaschen, und die dreigliedrigen Strukturen (Capture Probe-miRNA-Reportersonde) sind an einer mit Streptavidin beschichteten Objektträger über das Biotin-markierte Einfangsonde. Imaging und Barcode-Zählung erfolgt mit einem digitalen Analysator verwenden. Die immobilisierten barcodierte miRNAs werden visualisiert und bebildert, ein Mikroskop und Kamera, und die einzigartigen Barcodes dekodiert und gezählt. Datenqualitätskontrolle (QC), Normalisierung und Auswertung werden von einem speziell entwickelten Datenverarbeitung und Analyse-Software erleichtert, dass der Test-Software begleitet. Der Test zeigt eine hohe Linearität über einen breiten Bereich des Ausdrucks, sowie eine hohe Empfindlichkeit. Proben- und Testvorbereitung beinhaltet keine enzymatische Reaktionen, die reverse Transkription oder Verstärkung; hat wenige Schritte; und ist weitgehend automatisiert, Ermittler Effekte und was zu einer hohen Konsistenz und technischen Reproduzierbarkeit zu reduzieren. Hier beschreiben wir die Anwendung dieser Technologie zu identifizieren zirkulierenden miRNA Störungen in Reizdarmsyndrom.
Introduction
Reizdarmsyndrom (IBS) ist die häufigste ambulante Diagnose in Gastroenterology, befällt 10 bis 15% der Bevölkerung und die eine erhebliche Belastung für das Gesundheitswesen. Derzeit gibt es keine allgemein anerkannte diagnostische Biomarker für IBS (dh wird die Diagnose anhand von klinischen Symptomen und anderen organischen Störungen auszuschließen, wie GI Krebserkrankung, chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und Magen – Darm (GI) Infektionen). Wenn Gen studieren Expressionsprofile gemeinsam Bedingungen mit subklinischer Histopathologie, wie IBS, hohe Empfindlichkeit und Genauigkeit (Reproduzierbarkeit) benötigt werden , wie Störungen in der Genexpression Profile 1-3 oft subtil sind. miRNAs wurden als sowohl diagnostische und funktionale Ziele in IBS 4,5, identifiziert und wir sind besonders daran interessiert , bei der Beurteilung ihrer Verwendung als Biomarker der IBS-assoziierten biologischen Störungen 3,4,6,7 zirkulieren. Die klinische Verwendung von circulating Biomarkern ist von aktuellem Interesse wegen der Leichtigkeit und minimal – invasive Art der Sammlung der Quelle 'Biomarker (zB peripheren Blut) von Patienten.
Die Genexpression Plattform-Tests, die aufgrund ihrer einzigartigen chemischen und schlanke, meist automatisierten Workflow, bieten eine Microarray-Plattform, die für die gezielte Entdeckung breit und anpassbare Abdeckung (800 Ziele in einer einzigen Reaktion) des Transkriptom zur Verfügung stellt. Sie ergeben auch eine hohe Präzision und Linearität in einem breiten Spektrum von Expressionsniveaus in der Quantifizierung von transkriptomischen Zielen. Der Test erfordert nicht die reverse Transkription von RNA, die Amplifikation resultierenden cDNA oder andere enzymatische Reaktionen. Somit werden durch das Verfahren der digitalen Zähl- reduziert mögliche Fehler durch die hohen Taktzahlen der Amplifikation von RNA-Spezies mit geringer Häufigkeit oder seltene Spleißvarianten eingeführt. Dies bedeutet, dass eine Vielzahl von Probentypen, wie gereinigtes GesamtRNA (dh mRNA + miRNA), RNA aus Formalin fixierten Paraffin eingebettetem (FFPE) Proben sowie grobe Gewebe und Zell – Lysate können mit den Assays verwendet werden.
RNAs von Interesse sind, unter Verwendung eines Paars von Sonden (capture und Reportersonden) erfasst, die jeweils eine zielspezifische Sequenz enthält, die einen entsprechenden Bereich auf der Ziel-RNA erkennt. Um zu gewährleisten , ist die Detektion von kurzen RNAs (dh miRNAs), die reife miRNA – Sequenz durch Tempern eines einzigartigen Oligonukleotid – Markierung (miRtag) an das 3' – Ende des Moleküls verlängert. Ein Überbrückungs Oligonukleotid, das sowohl mit einem Teil des reifen Ziel-miRNA und der miRNA-spezifische miRtag kostenlos ist, wird verwendet, Sequenzspezifität sicherzustellen. Erfassung und Reportersonden abzubinden zum 3 'und 5'-Ende der reifen miRNA-miRtag komplex sind. Die Einfangsonden eine Biotin-Markierung am 3'-Ende aufweisen, die es ihnen ermöglichen, auf die Oberfläche einer mit Streptavidin beschichteten Glasobjektträger zu befestigen, fixing der Fänger-Sonde-miRNA-miRtag-Reportersonde Komplex mit dem Schlitten. Ein elektrischer Strom wird dann verwendet, um den Komplex auf der Gleitfläche zu orientieren, so dass Fluoreszenz Barcodes durch die Reportersonde an dem Ende eines Mikroskops und ladungsgekoppelte Vorrichtung (CCD) -Kamera zu '5 durch visualisiert werden. Barcodes werden gezählt und dekodiert wird, eine Zählung der spezifischen Ziel miRNAs ergibt. Die fluoreszierende Strichcode besteht aus sechs Positionen, die durch eine von vier fluoreszierenden Farben belegt werden kann, die verwendet werden können, mehr als 4.000 Farbbarcode Kombinationen, wobei jede Codierung für eine bestimmte RNA zu konstruieren.
Probenvorbereitung (dh RNA Reinigung oder Zell- / Gewebe Lysat – Zubereitung) sowie die Hybridisierung der Fänger und Reporter – Sonden werden an der Bank durchgeführt. Zwölf Proben können auf einem einzigen Schlitten gemultiplext werden. Nach der Hybridisierung über Nacht, alle weiteren Probenvorbereitung wird von einem Roboter-Vorbereitungsstation durchgeführt. Die geladenen Objektträger werden dann auf Anzeige übertragenigital Analysator für die Abbildung, Zählen, Decodierung und Datenverarbeitung. Die resultierenden Daten werden auf die beiliegende Software importiert, wo sie weiter mit einem hohen Grad an Benutzersteuerung verarbeitet. Die einzigartige Chemie, einfache Zubereitung, automatisierte Natur, einfacher Datentyp (Counts) und insgesamt optimierten Workflow des Assays ermöglichen hochpräzise Genexpression Quantifizierung, es ein nützliches Werkzeug zu machen bei der Untersuchung zirkulierender miRNA-Expressionsprofile und Signaturen in der funktionellen Bedingungen wie IBS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls
Für den Assay miRNA Insbesondere ist es wichtig, nicht ungereinigt Lysate verwenden (diese können in mRNA und Protein-Assays verwendet werden), da die Reagenzien nicht für die Verwendung mit Lysaten optimiert und Probenvorbereitungsreaktionen wahrscheinlich gehemmt werden. Zusätzlich durch Verunreinigungen aus Lyse und RNA Reinigungsschritte über (zB Guanidinium – Verbindungen, Ethanol und Phenolen) können Ligation und Probenreinigung Reaktionen hemmen. Gute Qualität RNA ist daher von entscheidender Bedeutung, um die Empfindlichkeit und Genauigkeit des miRNA-Assays.
ein Thermocycler mit beheizbarem Deckel zu verwenden ist kritisch richtige Temperaturkontrolle, um sicherzustellen, die Leistung aller Reaktionsschritte zu optimieren. Während Schritt 3.5.1, ist es wichtig, nicht die Streifen aus dem Thermocycler zu entfernen, um die Temperatur während der Zugabe der Ligase zu halten. Das Entfernen der Streifen hinzuzufügen, um die Ligasewird beeinträchtigt die Reaktion. Wenn die Schritte der Hybridisierung durchgeführt wird, ist es entscheidend, kräftiges Schütteln, Pipettieren oder Schnippen zu vermeiden, wenn Reagenzien in den Mischrohre, da dies die Reportersonden abscheren kann. Um eine optimale Leistung und Konsistenz zu gewährleisten, ist es wichtig, in den Rohren durch leichtes Schnippen gründlich Reagenzien mischen. Immer Spin-down-Reaktionen nach dem Mischen und verwenden eine neue Pipette jedes Mal kippen ein Reagens abgegeben wird genaues Pipettieren, um sicherzustellen, und um ein versehentliches Kreuzkontamination zu vermeiden.
Technische Änderungen und Fehlerbehebung
Die Code-Sets können angepasst werden nur Ziele von Interesse sind. Auf diese Weise können die Kosten abgewogen werden für die Prüfung großer Probenmengen zu ermöglichen, wenn eine weitere Untersuchung oder eine Bio-Signatur zu validieren. Benutzerdefinierte Sonden können für Gene oder Ziele nicht zur Verfügung von der a – la – carte – Menü gestaltet werden. Die Empfindlichkeit für weniger reichlich Ziele oder niedriger Konzentration RNA kann seinindem für eine längere Hybridisierungszeit manipuliert und / oder durch höhere auflösenden digitalen Zählen verwendet wird.
In unserer Studie haben wir die vordefinierte 800 Ziel-miRNA-Panel mit Gesamt-RNA aus Vollblut; jedoch können die Assays angepasst werden weniger miRNAs zu schließen, wenn ein gezielter Ansatz erforderlich ist. Insgesamt 24 Proben können an einem einzigen Tag hergestellt werden, in zwei Gruppen von 12 versetzt angeordnet, da zwei Kassetten bequem durch post-Hybridisierungsverarbeitung auf der Roboter-Vorbereitungsstation und abgebildet auf dem digitalen Analysator am nächsten Tag übergeben werden können. Staggered Verarbeitung der Proben in Chargen von 12 ist wichtig, um die Hybridisierungszeit zu standardisieren. Patronen , die abgebildet wurden , können gespeichert und bei 4 ° C gelagert werden erneut abgetastet werden , wenn Daten Analysen legen nahe , dass eine höhere Auflösung scan die Detektion von selteneren miRNAs verbessern. Nachweis von selteneren Moleküle auch durch Hybridisieren Proben für mehr verbessert werden kann; kann jedoch verlängert Hybridisierung Result in Übersättigung und kann nur die Ergebnisse verbessern, wenn die Ausgangs-RNA-Konzentrationen niedrig sind (wie in der extrazellulären Vesikel abgeleitete RNA). Die Plattform der Empfindlichkeit und Präzision ermöglichen relativ niedriger Abundanz miRNAs zuverlässig gezählt werden.
Einschränkungen der Technik
Die beschriebene Gen-Expression Assay-Plattform bietet Platz für nur 800 Ziele pro Array auf. Es ist daher nicht für ganze miRNA-Transkriptom / ganze Transkriptom-Studien geeignet. Nur bekannt, beschrieben und angegebenen Ziele können mit der Plattform erfasst werden, so ist sie nicht auf die Entdeckung neuer molekularer Spezies geeignet. Andere Verfahren, wie beispielsweise RNA-Seq oder anderen herkömmlichen Microarray Methoden eignen sich besser für ganze Transkriptom Sondierungsstudien.
Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / Alternativmethoden
IBS wird durch eine Kombination von Symptomen gekennzeichnet, principally einschließlich Bauchschmerzen; viszerale Überempfindlichkeit; und Veränderungen der Stuhlgewohnheiten, wie häufiges Durchfall, Verstopfung oder eine Kombination aus beidem 9,10. IBS – Symptome haben keine bekannte organische Ursache, und die Patienten präsentieren nicht mit klinisch signifikanten Entzündung, histopathologischen Störungen des Magen – Darm – Gewebe oder systemische Marker 9-12. Forschung deutet darauf hin , dass die biologische Dysregulation in IBS ist subtil, subklinische und heterogen, mit gemeinsamen Themen Schwellen um Entzündungen und Immunfunktion 10. Daher mussten wir Experimentator eingeführte Variation zu steuern, und eine Plattform verwenden, die zuverlässig Erkennung subtile Störungen in der Genexpression fähig war. Die einzigartigen Eigenschaften des Assays und System standardisieren Probenverarbeitung und reduzieren Experimentator durch Automatisierung der Handhabung, die Verringerung technische Varianz hoch reproduzierbare Daten zu erzeugen. Mit diesen Funktionen können für gezielte Untersuchungen und produzieren hochpräzise und replicable Daten. Dies ermöglicht die Erkennung von subtilen Störungen und Störungen unter niedrigem Expression Ziele, die durch die Signale von reichlicher Ziele übersehen oder überschwemmt werden kann, wenn Intensitäts- oder Amplifikation basierenden Verfahren. PCR-basierte Mikroarrays und RNA-Seq Methoden sind brauchbare Alternativen zu den beschriebenen Plattform und als alternative attraktiv sein kann, wenn höhere Durchsätze erforderlich sind, oder wenn es das Ziel ist, die gesamte Transkriptom zu charakterisieren oder zu neuen Molekülen zu suchen. Allerdings Alternativen durchführen kann nicht so gut in genau und sensibel Nachweisen und Quantifizieren von seltenen Ziele und subtile Störungen.
Zukünftige Anwendungen oder Anfahrt nach dieser Technik Mastering
Zirkulierende miRNA-Expression in IBS Teilnehmer zeigten eine Reihe von Störungen, die sowohl signifikant und konsistent zu sein innerhalb der Kategorien gefunden wurden. Die identifizierten miRNAs wurden mit entsprechenden pathwa assoziiertys und pathologischen Bedingungen, einschließlich einer funktionellen Schmerzzustand (miR-342-3p: chronische Blasenschmerzen) 8 und Entzündung (miR-150) 13. Das Beispiel Studie wurde auf einer explorativen Kohorten-basierte verwendet Ziele und Systeme von Interesse zu definieren. Eine gezieltere kleinere miRNA-Array wurde dann konstruiert, die pro Probe Kosten gesenkt werden und damit für viel größere Kohorten in einer kosteneffektiven Art und Weise, um Signaturen und Biomarkern analysiert werden zu validieren und zu verfeinern. Die Genexpression Plattform – Assay – System sorgt für ein Gleichgewicht zwischen der traditionellen explorativen Natur des Mikroarrays und gezieltere, hypothesengeleitete Datenerfassung weiter zu verfeinern und zu testen molekularen Signaturen und Biomarker 14-16. Das Verfahren wird verwendet werden , um molekulare und Protein Störungen in in vivo zu untersuchen und in – vitro – Modellen , bei denen die beschriebenen Ziel miRNAs sind experimentell überexprimiert oder gehemmt. Neue Tests erlauben die gleichzeitige Quantifizierung von mRNAs und proteins direkt von Zell- und Gewebe Lysaten. Darüber hinaus kann durch die Reinigung von bestimmten Fraktionen der peripheren Blut zu optimieren und Exkremente (zB Urin) und durch die Anpassung und bestimmte Testparameter zu optimieren, molekularen Profile und Signaturen mit niedrigem Molekular Konzentration Fraktionen (zB exosomalen Fraktionen) werden geprüft.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the U.S. Department of Health and Human Services, the National Institutes of Health, the National Institute of Nursing Research, and the Division of Intramural Research to Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06; the Intramural Research Training Awards to Nicolaas H. Fourie, Ralph M. Peace, Sarah K. Abey, and Leeanne B. Sherwin; and special support from the Burroughs Wellcome Fund to Howard Hughes-NIH Research Scholar Ralph M. Peace.
The opinions expressed herein and the interpretation and reporting of these data are the responsibility of the author(s) and should not be seen as an official recommendation, interpretation, or policy of the National Institutes of Health or the United States Government.
Materials
| nCounter Prep-Station | Nanostring | N/A | Essential |
| nCounter Digital Analyzer | Nanostring | N/A | Essential |
| Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | Can use suitable equivalent |
| Centrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| MiniMicroCentrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Pipettes (1000, 100, 20, 10ul) | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Qiacube | Qiagen | 9001292 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood miRNA Kit | Qiagen | 763134 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood Tubes | VWR | 77776-026 | Can use suitable equivalent |
| nCounter Human miRNA Assay Kit | Nanostring | 150625 | Essential |
| nCounter Master Kit | Nanostring | 100050 | Essential |
| nSolver | Nanostring | N/A | Essential |
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