Verstoringen van circulerende miRNAs in het prikkelbare darm syndroom gedetecteerd met een multiplexverzending High-throughput genexpressie Platform
Summary
We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.
Abstract
Genexpressie platform test maakt robuuste en zeer reproduceerbare kwantificering van de expressie van maximaal 800 transcripten (mRNA of miRNAs) in een enkele reactie. De miRNA test telt transcripten door direct beeldvorming en digitaal tellen miRNA moleculen die gelabeld zijn met een kleurcode fluorescerende barcode probe sets (een verslaggever sonde en een capture probe). Barcodes direct gehybridiseerd miRNAs die zijn verlengd door het ligeren van een unieke oligonucleotide tag (miRtag) naar het 3 'uiteinde rijpen. Reverse transcriptie en amplificatie van de transcripten zijn niet vereist. Reporter probes bevatten een sequentie van zes kleuren posities wordt gevuld door een combinatie van vier fluorescerende kleuren. De vier kleuren over zes posities worden gebruikt om een gen-specifieke kleur barcode sequentie te construeren. Post-hybridisatie verwerking geautomatiseerd op een robot prep station. Na hybridisatie, de overtollige sondes worden weggespoeld, en de tripartiete structuren (capture probe-miRNA-reporter probe) zijn bevestigd aan een met streptavidine beklede slide via de biotine-gelabelde vangprobe. Beeldvorming en barcode telling wordt gedaan met behulp van een digitale analyser. Het geïmmobiliseerde barcode miRNAs worden gevisualiseerd en afgebeeld met behulp van een microscoop en camera, en de unieke barcodes worden gedecodeerd en geteld. kwaliteit van de gegevens (QC), normalisatie, en de analyse worden gefaciliteerd door een speciaal ontworpen data verwerking en analyse software die de test software begeleidt. Het onderzoek toont hoge lineariteit over een groot bereik van expressie, evenals hoge gevoeligheid. Monster en test voorbereiding niet enzymatische reacties, reverse transcriptie, of versterking te betrekken; heeft enkele stappen; en is grotendeels geautomatiseerd, waardoor de onderzoeker effecten en resulteert in een hoge consistentie en technische reproduceerbaarheid. Hier beschrijven we de toepassing van deze technologie voor het identificeren circulerende miRNA verstoringen in prikkelbare darmsyndroom.
Introduction
Irritable Bowel Syndrome (IBS) is de meest voorkomende ambulante diagnostiek in Gastroenterology, treft 10 – 15% van de algemene bevolking en die een zware last op de gezondheidszorg. Op dit moment zijn er geen algemeen aanvaarde diagnostische biomarkers voor IBS (dat wil zeggen, is de diagnose op basis van klinische symptomen en het uitsluiten van andere organische aandoeningen, zoals GI maligniteit, inflammatoire darmziekten, en gastro-intestinale (GI) infecties). Bij het bestuderen van genexpressie profielen in normale met subklinische histopathologie, zoals IBS, een hoge gevoeligheid en precisie (reproduceerbaarheid) nodig zijn, zoals verstoringen in genexpressie profielen zijn vaak subtiel 1-3. miRNAs zijn geïdentificeerd als zowel diagnostische en functionele doelen in IBS 4,5, en we zijn vooral geïnteresseerd in de beoordeling van het gebruik ervan als circulerende biomarkers van IBS-geassocieerde biologische verstoringen 3,4,6,7. Het klinische gebruik van circulatieTing biomarkers is van lopende rente als gevolg van het gemak en de minimaal invasieve karakter van de collectie van de bron van de biomarkers '(bijvoorbeeld, perifere bloed) van patiënten.
Genexpressie platform assays, vanwege hun unieke chemische en gestroomlijnde, grotendeels geautomatiseerd workflow te microarray platform die breed en aanpasbare bereik (800 doelen in een enkele reactie) van de transcriptoom voor gerichte ontdekking biedt. Ze geven ook een hoge nauwkeurigheid en lineariteit over een breed spectrum van expressieniveaus in de kwantificering van transcriptoom doelen. De assay niet de reverse transcriptie van RNA, de amplificatie van cDNA verkregen, of andere enzymatische reacties vereisen. Aldus mogelijke fouten geïntroduceerd door de hoge cyclus aantal amplificatie van RNA species met lage abundantie of zeldzame splice varianten worden verminderd door de werkwijze van digitale tellen. Dit betekent dat diverse soorten monsters, zoals gezuiverd totaleRNA (mRNA miRNA +) RNA uit formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) specimens, evenals ruwe weefsels en cellysaten, kan worden gebruikt bij de assays.
RNA's van belang worden gedetecteerd met een paar proben (capture en reporter probes), die elk een doelwitspecifieke sequentie die een overeenkomstig gebied laat zien van het doel-RNA. Om de detectie van korte RNA's (dat wil zeggen miRNAs) waarborgen, is de rijpe miRNA sequentie verlengd door hybridiseren van een unieke oligonucleotide tag (miRtag) aan het 3'-uiteinde van het molecuul. Een overbruggen oligonucleotide, dat complementair aan een gedeelte van zowel de rijpe miRNA doelwit en het miRNA-specifieke miRtag wordt gebruikt om sequentiespecificiteit waarborgen. Vangen en reporter probes ligeren aan de 3 'en 5' uiteinden van het rijpe miRNA-miRtag complex, respectievelijk. De capture probes hebben een biotine label aan het 3 'uiteinde, waardoor zij hechten aan het oppervlak van een met streptavidine beklede glasplaatje, Fixing de capture probe-miRNA-miRtag-reporter probe complex aan de dia. Een elektrische stroom wordt dan gebruikt om het complex op het glijoppervlak oriënteren, zodat fluorescent barcodes door de reporter probe aan het 5 'uiteinde uitgevoerd worden gevisualiseerd met behulp van een microscoop en ladingsgekoppelde inrichting (CCD) camera. Barcodes worden geteld en gedecodeerd, waardoor een telling van het specifieke doel miRNAs. De fluorescerende barcode bestaat uit zes posities die worden ingenomen door een van de vier fluorescerende kleuren, die kan worden gebruikt om meer dan 4000 kleuren-barcode combinaties, elk codeert voor een specifiek RNA construct.
Monstervoorbereiding (dwz RNA zuivering of cel / weefsel lysaat preparaat), en hybridisatie van het vangen en reporter probes worden gedaan bij de bank. Twaalf monsters kunnen worden gemultiplexed op één dia. Na de overnachting hybridisatie, wordt alle verdere prepareren uitgevoerd door een robot prep station. De geladen objectglaasjes worden vervolgens overgebracht naar advertentieigitale analysator voor imaging, tellen, decoderen, en dataverwerking. De verkregen data worden ingevoerd naar de bijgaande software, waar ze verder worden verwerkt met een hoge gebruiksvriendelijkheid controle. De unieke chemie, eenvoudige bewerkingen, geautomatiseerde natuur, eenvoudig data type (tellingen), en de algehele gestroomlijnde workflow van de test te vergemakkelijken high-precision genexpressie kwantificeren, waardoor het een handig hulpmiddel bij het bestuderen van circulerende miRNA expressie profielen en handtekeningen in functionele aandoeningen zoals IBS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische stappen in het protocol
Voor het miRNA assay bijzonder kritisch gezuiverde lysaten (deze kunnen worden gebruikt in mRNA en eiwit assays) niet te gebruiken, omdat de reagentia niet geoptimaliseerd voor gebruik met lysaten en monstervoorbereiding reacties waarschijnlijk worden geremd. Bovendien verontreinigingen overgedragen van lysis en RNA zuiveringsstappen (bijvoorbeeld guanidinium verbindingen ethanol en fenolen) kunnen ligatie en voorbeeld zuiveringsreacties remmen. Goede kwaliteit RNA is derhalve kritisch voor de gevoeligheid en de nauwkeurigheid van de assay miRNA.
Met behulp van een thermocycler met een verwarmd deksel is essentieel voor een goede temperatuurregeling om de prestaties van alle reactiestappen optimaliseren waarborgen. Tijdens stap 3.5.1, is het belangrijk de strips uit de thermocycler om de temperatuur te handhaven gedurende de toevoeging van het ligase te verwijderen. Verwijderen van de stroken aan de ligase toevoegende reactie compromitteren. Bij het uitvoeren van de hybridisatie stappen, is het essentieel om krachtig schudden, pipetteren of tikken vermijden bij het mengen reagentia in de buizen, omdat dit de reporter probes scheren. Om optimale prestaties en consistentie te waarborgen, is het belangrijk om de reagentia in de buizen goed te mengen door voorzichtig te vegen. draaien altijd naar beneden reacties na het mengen, en het gebruik van een nieuwe pipet tip elke keer dat een reagens wordt afgegeven om nauwkeurige pipetteren te waarborgen en toevallige kruisbesmetting te voorkomen.
Wijzigingen en problemen oplossen
De code sets kunnen worden aangepast om alleen doelstellingen van belang zijn. Op deze manier kunnen de kosten worden afgewogen mogelijk te maken voor het testen van grote sample sets wanneer nader onderzoeken of valideren van een bio-handtekening. Custom sondes kunnen worden ontworpen voor genen of doelen niet beschikbaar zijn van het à la carte menu. Gevoeligheid voor minder-overvloedige targets of lage concentratie RNA kan zijngemanipuleerd doordat langere tijd hybridisatie en / of met hogere resolutie digitale tellen.
In onze studie gebruikten we de vooropgestelde 800 doelgroep miRNA paneel met totaal RNA uit volbloed; echter, kan de testen worden aangepast om minder miRNAs onder meer als een meer gerichte aanpak nodig. Een totaal van 24 monsters kunnen worden bereid op één dag, versprongen twee sets van 12, omdat twee patronen kunnen gemakkelijk worden door post-hybridisatie behandelingen op de robot prep station doorgegeven en afgebeeld op de digitale analyser de volgende dag. Gefaseerde van de monsters in batches van 12 is belangrijk voor de hybridisatietijd standaardiseren. Cartridges die zijn afgebeeld kunnen worden opgeslagen en bewaard bij 4 ° C te worden gescand als data analyses suggereren dat een hogere resolutie scan het opsporen van zeldzamere miRNAs kunnen verbeteren. Detectie van zeldzamer moleculen kunnen ook worden verbeterd door het hybridiseren monsters langer; kan echter langdurige hybridisatie Result in oververzadiging en kunnen alleen maar beter de resultaten als de startende RNA concentraties zijn laag (zoals in extracellulaire blaasjes afgeleid RNA). gevoeligheid en precisie van het platform mogelijk te maken relatief lage-overvloed miRNAs betrouwbaar te tellen.
Beperkingen van de Techniek
De beschreven genexpressie test platform is geschikt voor slechts tot 800 doelen per array. Het is dan ook niet geschikt voor het hele miRNA-transcriptoom / hele transcriptoom studies. Enige bekende, beschreven en specifieke doelstellingen kunnen worden gedetecteerd met behulp van het platform, dus het is niet geschikt voor de ontdekking van nieuwe moleculaire species. Andere methoden, zoals RNASeq of andere traditionele methoden microarray, zijn meer geschikt voor hele transcriptoom experimentele studies.
Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / Alternative Methods
IBS wordt gekenmerkt door een combinatie van symptomen, principally waaronder buikpijn; viscerale overgevoeligheid; en veranderingen in de darm, zoals vaak diarree, constipatie, of een combinatie van beide 9,10. IBS-symptomen hebben geen bekende organische oorzaak, en patiënten niet presenteren met klinisch significante ontsteking, histopathologische verstoringen van gastro-intestinale weefsels, of systemische markers 9-12. Uit onderzoek blijkt dat biologische ontregeling in IBS is subtiel, subklinische en heterogeen, met gemeenschappelijke thema's in opkomst rond de ontsteking en het immuunsysteem 10. Daarom moesten we-onderzoeker geïntroduceerd variatie controle en gebruik van een platform dat in staat is op betrouwbare wijze te detecteren subtiele verstoringen in genexpressie was. De unieke eigenschappen van de test en het systeem te standaardiseren monster verwerking en vermindering van experimentator hanteren door middel van automatisering, waardoor de technische variantie tot zeer reproduceerbare data te produceren. Deze kenmerken zorgen voor gerichte onderzoeken en produceren van zeer nauwkeurige en replicable data. Dit maakt de detectie van subtiele verstoringen en verstoringen onder lage expressie doelen die kunnen worden genegeerd of overspoeld door de signalen van overvloediger doelwitten bij gebruik intensity- of amplificatie gebaseerde werkwijzen. PCR-gebaseerde methoden microarrays en RNAseq levensvatbare alternatieven voor het gebruik van de beschreven platform en kunnen aantrekkelijk alternatief zijn wanneer hogere verwerkingscapaciteit vereist of wanneer het doel is om de hele transcriptoom te karakteriseren of om te zoeken naar nieuwe moleculen. Echter, alternatieven niet zo goed presteren in nauwkeurig en gevoelig detecteren en kwantificeren van zeldzame targets en subtiele verstoringen.
Toekomstige toepassingen of richtingen na beheersen van deze techniek
Circulerende miRNA meningsuiting in IBS deelnemers toonden een aantal storingen die werden gevonden zowel significant en consequent binnen categorieën. De geïdentificeerde miRNAs werden geassocieerd met relevante pathways en pathologische omstandigheden, met inbegrip van een functionele pijn voorwaarde (miR-342-3p: chronische pijn in de blaas) 8 en ontsteking (miR-150) 13. Het voorbeeld studie was gebaseerd op een verkennende cohort gebruikt om targets en systemen van belang te definiëren. Een meer gerichte kleinere miRNA matrix werd vervolgens geconstrueerd, verlagen van de kosten per monster en waardoor veel grotere cohorten op een kosteneffectieve wijze worden geanalyseerd om te valideren en te verfijnen handtekeningen en biomarkers. De genexpressie platform testsysteem een evenwicht tussen de traditionele verkennende aard van de microarray en meer gerichte, hypothese-gedreven het verzamelen van gegevens te verfijnen en te testen moleculaire handtekeningen en biomarkers 14-16. De werkwijze wordt gebruikt om moleculaire en eiwit verstoringen onderzoeken in vivo en in vitro modellen waarbij het beschreven doel miRNAs zijn experimenteel overexpressie gebrachte of geremd. Nieuwe testen zorgen voor de gelijktijdige kwantificering van mRNA en proteins direct van cellen en weefsels lysaten. Verder kan door het optimaliseren van de zuivering van specifieke fracties van perifeer bloed en excreta (bijvoorbeeld, urine) en door het aanpassen en optimaliseren bepaalde assay parameters, moleculaire profielen en handtekeningen laagmoleculair concentratie fracties (bijvoorbeeld exosomaal fracties) worden onderzocht.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the U.S. Department of Health and Human Services, the National Institutes of Health, the National Institute of Nursing Research, and the Division of Intramural Research to Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06; the Intramural Research Training Awards to Nicolaas H. Fourie, Ralph M. Peace, Sarah K. Abey, and Leeanne B. Sherwin; and special support from the Burroughs Wellcome Fund to Howard Hughes-NIH Research Scholar Ralph M. Peace.
The opinions expressed herein and the interpretation and reporting of these data are the responsibility of the author(s) and should not be seen as an official recommendation, interpretation, or policy of the National Institutes of Health or the United States Government.
Materials
| nCounter Prep-Station | Nanostring | N/A | Essential |
| nCounter Digital Analyzer | Nanostring | N/A | Essential |
| Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | Can use suitable equivalent |
| Centrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| MiniMicroCentrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Pipettes (1000, 100, 20, 10ul) | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Qiacube | Qiagen | 9001292 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood miRNA Kit | Qiagen | 763134 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood Tubes | VWR | 77776-026 | Can use suitable equivalent |
| nCounter Human miRNA Assay Kit | Nanostring | 150625 | Essential |
| nCounter Master Kit | Nanostring | 100050 | Essential |
| nSolver | Nanostring | N/A | Essential |
References
- Aerssens, J., et al. Alterations in Mucosal Immunity Identified in the Colon of Patients With Irritable Bowel Syndrome. Clin Gastroenterol Hepatol. 6, 194-205 (2008).
- Akbar, A., et al. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57, 923-929 (2008).
- Fourie, N. H., et al. Elevated circulating miR-150 and miR-342-3p in patients with irritable bowel syndrome. Exp Mol Pathol. 96, 422-425 (2014).
- Zhou, Q., Souba, W. W., Croce, C. M., Verne, G. N. MicroRNA-29a Regulates Intestinal Membrane Permeability in Patients with Irritable Bowel Syndrome. Gut. 59, 775-784 (2010).
- Zhou, Q., Verne, G. N. miRNA-based therapies for the Irritable Bowel Syndrome. Expert Opin Biol Ther. 11, 991-995 (2011).
- Orlova, I. A., et al. MicroRNA modulation in complex regional pain syndrome. J Transl Med. 9, 1-11 (2011).
- Park, C. -. K., et al. Extracellular MicroRNAs Activate Nociceptor Neurons to Elicit Pain via TLR7 and TRPA1. Neuron. 82, 47-54 (2014).
- Gheinani, A. H., Burkhard, F. C., Monastyrskaya, K. Deciphering microRNA code in pain and inflammation: lessons from bladder pain syndrome. Cell Mol Life Sci. 70, 3773-3789 (2013).
- Drossman, D. A., et al. . Rome III: The Functional Gastrointestinal Disorders. , (2006).
- Chey, W. D., Kurlander, J., Eswaran, S. Irritable bowel syndrome: A clinical review. JAMA. 313, 949-958 (2015).
- Del Valle-Pinero, A. Y., Sherwin, L. B., Anderson, E. M., Caudle, R. M., Henderson, W. A. Altered vasoactive intestinal peptides expression in irritable bowel syndrome patients and rats with trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. World J Gastroenterol. 21, 155-163 (2015).
- Henderson, W. A., et al. Inverse relationship of interleukin-6 and mast cells in children with inflammatory and non-inflammatory abdominal pain phenotypes. World J Gastrointest Pathophysiol. 3, 102-108 (2012).
- Pekow, J. R., Kwon, J. H. MicroRNAs in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 18, 187-193 (2012).
- Veldman-Jones, M. H., et al. Flexible Molecular Subtyping of Clinical DLBCL Samples Using the NanoString nCounter System. Clin Cancer Res. 21, 2367-2378 (2015).
- Lee, J., et al. Nanostring-Based Multigene Assay to Predict Recurrence for Gastric Cancer Patients after Surgery. PLoS ONE. 9, e90133 (2014).
- Lohavanichbutr, P., et al. A 13-gene signature prognostic of HPV-negative OSCC: discovery and external validation. Clin Cancer Res. 19, 1197-1203 (2013).
- . . nCountermiRNA Expression Assay User Manual (MAN-C0009-05). , (2013).
