اضطرابات في الدورة الدموية miRNAs في متلازمة القولون العصبي التي تم اكتشافها باستخدام تعدد الإنتاجية العالية منصة التعبير الجيني
Summary
We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.
Abstract
منصة فحص التعبير الجيني يسمح لتقدير قوة وتكرار للغاية للتعبير عن ما يصل الى 800 محاضر (مرنا أو miRNAs) في رد فعل واحد. فحص ميرنا بحساب النصوص عن طريق التصوير مباشرة والعد رقميا جزيئات ميرنا التي وصفت مع الفلورسنت مجموعات التحقيق barcoded مرمزة (التحقيق الصحفي والتحقيق القبض). وتهجين الباركود مباشرة إلى أن تنضج miRNAs التي تم ممدود من ligating علامة النوكليوتيد فريدة (miRtag) إلى نهاية 3 '. ليس مطلوبا من النسخ العكسي والتضخيم من النصوص. تحقيقات مراسل تحتوي على سلسلة من ستة مواقع اللون بالسكان باستخدام مزيج من أربعة ألوان الفلورسنت. وتستخدم أربعة ألوان أكثر من ستة مواقع لبناء تسلسل اللون الباركود جين معين. هو الآلي معالجة ما بعد التهجين على محطة الإعدادية الروبوتية. بعد التهجين، يتم غسل تحقيقات الزائدة بعيدا، والهياكل الثلاثية (التقاط المواليةيكون ميرنا-مراسل يتم إصلاحها التحقيق) إلى شريحة streptavidin المغلفة عبر التقاط التحقيق المسمى البيوتين. ويتم التصوير والباركود العد باستخدام محلل رقمي. وتصور لmiRNAs barcoded يجمد والتقط باستخدام المجهر والكاميرا، ويتم فك الباركود فريدة من نوعها وعدها. ومما يسهل مراقبة الجودة البيانات (QC)، وتطبيع العلاقات، وتحليل من قبل معالجة البيانات مصمم خصيصا وبرامج التحليل الذي يصاحب برنامج الفحص. يوضح الفحص الخطي عالية على طائفة واسعة من التعبير، فضلا عن حساسية عالية. لا تنطوي على عينة وإعداد مقايسة التفاعلات الأنزيمية، النسخ العكسي، أو التضخيم. لديها خطوات قليلة. والآلي إلى حد كبير، والحد من الآثار المحقق ومما أدى إلى درجة عالية واستنساخ التقني. هنا، نحن تصف تطبيق هذه التكنولوجيا لتحديد تعميم الاضطرابات ميرنا في متلازمة القولون العصبي.
Introduction
متلازمة القولون العصبي (IBS) هو التشخيص للمرضى الخارجيين الأكثر شيوعا في الجهاز الهضمي، التي يعاني 10-15٪ من عامة السكان ويمثلون عبئا كبيرا على الخدمات الصحية. المؤشرات الحيوية التشخيصية حاليا، هناك مقبول عموما لIBS (أي، يستند التشخيص على الأعراض السريرية واستبعاد الاضطرابات العضوية الأخرى، مثل الورم الخبيث معهد جوته، والأمراض التهابية معي، والجهاز الهضمي (GI) العدوى). عند دراسة ملامح التعبير الجيني في ظروف مشتركة مع التشريح المرضي سريرية، مثل القولون العصبي، وحساسية عالية ودقة (استنساخ) هناك حاجة، واضطرابات في ملامح التعبير الجيني غالبا ما تكون خفية 1-3. وقد تم تحديد miRNAs كأهداف التشخيصية والوظيفية على حد سواء في IBS 4،5، ونحن مهتمون بشكل خاص في تقييم استخدامهم تعميم المؤشرات الحيوية للالمرتبطة IBS-الاضطرابات البيولوجية 3،4،6،7. استخدام السريري للcirculaالمؤشرات الحيوية تينغ هي من الفائدة الحالية نظرا لسهولة وطبيعة الغازية الحد الأدنى من مجموعة من مصدر المؤشرات الحيوية "(على سبيل المثال، الدم المحيطي) من المرضى.
الجينات منصة التعبير المقايسات، بسبب الكيمياء وفريدة من نوعها ومبسطة، وسير العمل الآلي في الغالب، وتوفير منصة ميكروأري أن يوفر تغطية واسعة وقابلة للتخصيص (800 أهداف في رد فعل واحد) من Transcriptome على لاكتشاف المستهدفة. كما أنها تعطي دقة عالية والخطي تغطي نطاقا واسعا من مستويات التعبير في القياس الكمي للأهداف transcriptomic. لا تتطلب الفحص والنسخ العكسي من الحمض النووي الريبي، والتضخيم من الناتج كدنا]، أو أي التفاعلات الأنزيمية الأخرى. وبالتالي، يتم تخفيض الأخطاء المحتملة التي أدخلها الأرقام دورة عالية من التضخيم من الأنواع RNA مع وفرة منخفضة أو المتغيرات لصق نادرة من عملية العد الرقمي. وهذا يعني أن مجموعة واسعة من أنواع العينات، مثل مجموع تنقيتهRNA (أي مرنا + ميرنا)، من الحمض النووي الريبي (FFPE) العينات الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين، وكذلك الأنسجة الخام والخلية لست]، ويمكن استخدامها مع المقايسات.
تم الكشف عن الرنا ذات الاهتمام باستخدام زوج من المسابير (القبض والتحقيقات مراسل)، كل منها يحتوي على سلسلة محددة الهدف الذي يعترف المنطقة المقابلة على الحمض النووي الريبي الهدف. من أجل ضمان الكشف عن الرنا قصيرة (أي miRNAs)، هو ممدود تسلسل ميرنا ناضجة من قبل والصلب علامة النوكليوتيد فريدة (miRtag) إلى نهاية 3 'من الجزيء. والنوكليوتيد سد كخدمة مجانية لجزء من كل من الهدف ناضجة ميرنا وmiRtag ميرنا محددة، ويستخدم لضمان تسلسل خصوصية. القبض على ومراسل تحقيقات ligate إلى 3 'و 5' تنتهي من مجمع ميرنا miRtag ناضجة، على التوالي. تحقيقات التقاط لديها التسمية البيوتين في نهاية 3 '، والتي تسمح لهم أن نعلق على سطح شريحة زجاجية streptavidin المغلفة، fixiنانوغرام القبض التحقيق ميرنا-miRtag-مراسل مجمع التحقيق إلى الشريحة. ثم يتم استخدام التيار الكهربائي لتوجيه المجمع على سطح الشريحة، مما يسمح الباركود الفلورسنت نقلته والتحقيق الصحفي على نهاية 5 'أن تصور باستخدام المجهر وجهاز اقتران الشحنة (CCD) الكاميرا. تحسب الباركود وفك، مما أسفر عن عدد من miRNAs مستهدفة محددة. يتكون الباركود الفلورسنت من ست المواقف التي يمكن أن يشغلها واحد من أربعة ألوان الفلورسنت، والتي يمكن استخدامها لبناء أكثر من 4000 تركيبات الألوان الباركود، كل الترميز لRNA محددة.
إعداد نموذج (أي تنقية RNA أو خلية / الأنسجة إعداد المحللة)، وكذلك التهجين من القبض على ومراسل تحقيقات، تتم على مقاعد البدلاء. اثنا عشر عينات يمكن المضاعفة على شريحة واحدة. بعد التهجين بين عشية وضحاها، وتنفيذ كافة تحضير عينة أخرى من قبل محطة الإعدادية الروبوتية. ثم يتم نقل الشرائح تحميل الإعلانمحلل igital للتصوير، والفرز، فك، ومعالجة البيانات. يتم استيراد البيانات الناتجة إلى البرامج المصاحبة لها، حيث يتم معالجتها مع مزيد من درجة عالية من التحكم المستخدم. كيمياء فريدة من نوعها، وإعداد بسيط، والطبيعة الآلي، نوع بيانات بسيطة (التهم)، وتبسيط العمل الشامل للفحص تسهيل عالية الدقة التعبير الجيني الكمي، مما يجعله أداة مفيدة في دراسة تعميم ميرنا ملامح التعبير والتوقيعات في ظروف وظيفية مثل القولون العصبي.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوات حاسمة في إطار بروتوكول
لفحص ميرنا على وجه الخصوص، فمن الأهمية بمكان عدم استخدام لست] غير المكرر (وهذه يمكن استخدامها في مرنا والمقايسات بروتين)، كما لم يتم الأمثل الكواشف لاستخدامها مع لست]، ومن المرجح أن تحول دون ردود فعل إعداد العينات. بالإضافة إلى ذلك، قامت الملوثات على من الخطوات تحلل والحمض النووي الريبي تنقية (على سبيل المثال، مركبات guanidinium، والإيثانول، والفينول) يمكن أن تحول دون ربط وتنقية العينة ردود الفعل. ذات نوعية جيدة RNA ولذلك بالغ الأهمية لحساسية ودقة الفحص ميرنا.
باستخدام thermocycler بغطاء ساخنة أمر بالغ الأهمية لضمان التحكم في درجة الحرارة المناسبة لتحسين أداء جميع خطوات التفاعل. خلال خطوة 3.5.1، فمن المهم عدم إزالة شرائح من thermocycler من أجل الحفاظ على درجة الحرارة خلال إضافة يغاز. إزالة شرائط لإضافة يغازلن نساوم على رد الفعل. عند تنفيذ الخطوات التهجين، فمن الأهمية بمكان لتجنب اهتزاز قوية، pipetting ل، أو عبها عند خلط المواد الكيميائية في الأنابيب، لأن هذا قد القص تحقيقات المراسل. لضمان الأداء الأمثل والاتساق، من المهم أن تخلط جيدا الكواشف في أنابيب من قبل عبها لطيف. تدور دائما إلى أسفل ردود الفعل بعد الاختلاط، واستخدام ماصة جديدة تنقلب كل مرة يتم فيها الاستغناء كاشف لضمان pipetting لدقيقة وتجنب عرضي انتقال التلوث.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
مجموعات رمز يمكن أن تكون مخصصة لتشمل أهدافا الوحيدة المثيرة للاهتمام. وبهذه الطريقة، والتكاليف يمكن أن تكون متوازنة للسماح لاختبار مجموعات عينة كبيرة عند مواصلة التحقيق أو التحقق من صحة التوقيع الحيوي. ويمكن تصميم تحقيقات مخصصة للجينات أو أهداف غير متوفرة من والانتقائي القائمة. حساسية للأهداف أقل وفرة أو الحمض النووي الريبي تركيز منخفض يمكن أن يكونالتلاعب من خلال السماح لفترة أطول التهجين و / أو باستخدام دقة عالية العد الرقمي.
في دراستنا استخدمنا 800 هدفا لوحة ميرنا محددة مسبقا مع الحمض النووي الريبي مجموع من الدم الكامل. ومع ذلك، يمكن أن تكون مخصصة لفحوصات لتشمل عددا أقل من miRNAs إذا كانت هناك حاجة إلى نهج أكثر استهدافا. ما مجموعه 24 عينة يمكن أن تكون على استعداد في يوم واحد، متداخلة في مجموعتين من 12، لأن اثنين من خراطيش يمكن بسهولة أن تنتقل من خلال معالجة ما بعد التهجين في المحطة الإعدادية الروبوتية وتصوير على تحليل رقمي في اليوم التالي. معالجة متداخلة من العينات على دفعات من 12 مهم لتوحيد وقت التهجين. الخراطيش التي تم تصويرها يمكن حفظ وتخزين عند 4 درجة مئوية لإعادة فحص إذا تشير تحليلات البيانات إلى أن قرار مسح العالي قد يحسن من الكشف عن miRNAs نادرة. ويمكن أيضا تحسين الكشف عن جزيئات أكثر ندرة من التهجين عينات لفترة أطول. ومع ذلك، قد بالنتيجه التهجين لفترات طويلةتي في oversaturation وقد يحسن نتائج إلا إذا كان تركيز الحمض النووي الريبي ابتداء منخفضة (كما هو الحال في خارج الخلية RNA المستمدة من حويصلة). حساسية للمنبر والدقة تسمح نسبيا miRNAs-وفرة منخفضة لتحسب بشكل موثوق.
القيود المفروضة على تقنية
التعبير الجيني منصة فحص وصفه يستوعب فقط ما يصل الى 800 اهداف لكل صفيف. ولذلك لا مناسبة لمدة كله ميرنا Transcriptome على / دراسات Transcriptome على كلها. يعرف فقط، وصفها، ويمكن الكشف عن أهداف محددة باستخدام منصة، لذلك ليست مناسبة لاكتشاف الأنواع الجزيئية الجديدة. أساليب أخرى، مثل RNASeq أو غيرها من وسائل ميكروأري التقليدية، هي أكثر ملاءمة للدراسات استكشافية Transcriptome على كله.
أهمية تقنية مع الاحترام لالحالية / الطرق البديلة
تتميز الرابطة من قبل مجموعة من الأعراض، طابعاتبما في ذلك cipally آلام في البطن. فرط الحساسية الحشوية. والتغيرات في عادات الأمعاء مثل الإسهال المتكرر، والإمساك، أو مزيج من الاثنين معا 9،10. أعراض القولون العصبي ليس لها سبب عضوي معروف، والمرضى لا تقدم مع التهاب هامة سريريا، الاضطرابات المرضية في أنسجة الجهاز الهضمي، أو علامات النظامية 9-12. وتشير البحوث إلى أن التقلبات البيولوجي في IBS هو خفية، تحت الإكلينيكي، وغير متجانسة، مع المواضيع المشتركة الناشئة حول الالتهاب والمناعة 10 وظيفة. لذلك، نحن بحاجة للسيطرة على الاختلاف، قدم مجرب واستخدام منصة التي كانت قادرة على الكشف بشكل موثوق الاضطرابات الطفيفة في التعبير الجيني. السمات الفريدة للفحص ونظام توحيد أسلوب تجهيز العينات وتقلل مجرب التعامل مع من خلال المكننة، وتقليل التباين الفني لإنتاج بيانات استنساخه للغاية. وتسمح هذه المزايا للتحقيقات مركزة وإنتاج عالية الدقة وRالبيانات eplicable. وهذا يسمح للكشف عن الاضطرابات واضطرابات خفية بين أهداف التعبير المنخفض التي يمكن التغاضي عنها أو اغراق إشارات من الأهداف أكثر وفرة عند استخدام intensity- أو القائم على التضخيم الأساليب. ميكروأرس PCR القائم وأساليب RNAseq هي بدائل قابلة للتطبيق لاستخدام منصة وصفها ويمكن أن تكون جذابة كبديل عندما يطلب الانتاجية العالية أو عندما يكون الهدف هو تميز Transcriptome على كامل أو للبحث عن جزيئات جديدة. ومع ذلك، بدائل قد لا تؤدي وكذلك في دقة وحساسية كشف وquantitating أهداف النادرة والاضطرابات الطفيفة.
التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات بعد اتقان هذه التقنية
أظهر تعميم التعبير ميرنا في المشاركين IBS عدد من الاضطرابات التي تم العثور عليها على حد سواء كبيرة ومتناسقة ضمن فئات. ترافقت miRNAs التي تم تحديدها مع pathwa ذات صلةيس والحالات المرضية، بما في ذلك حالة وظيفية الألم (مير 342-3p: ألم المثانة المزمن) (8) والتهاب (مير-150) (13). واستندت الدراسة مثال على الفوج الاستكشافية تستخدم لتحديد الأهداف ونظم الفائدة. ثم شيد أكثر استهدافا، أصغر مجموعة ميرنا، وتخفيض في تكلفة العينة والسماح للأفواج أكبر من ذلك بكثير ليتم تحليلها بطريقة فعالة من حيث التكلفة من أجل التحقق من صحة وصقل التوقيعات والمؤشرات الحيوية. نظام منصة فحص التعبير الجيني توازنا بين طبيعة استكشافية التقليدية من ميكروأري وأكثر استهدافا، يحركها فرضية جمع البيانات لصقل واختبار التوقيعات الجزيئية والمؤشرات الحيوية 14-16. وسوف تستخدم هذه الطريقة لفحص اضطرابات الجزيئية والبروتين في الجسم الحي في ونماذج في المختبر حيث miRNAs الهدف وصفها هي تجريبيا الإفراط في التعبير عن أو مستعمل. فحوصات جديدة تسمح لتقدير وقت واحد من mRNAs وصroteins مباشرة من الخلية والأنسجة لست]. وعلاوة على ذلك، عن طريق تحسين تنقية الكسور محددة من الدم المحيطي والفضلات (على سبيل المثال، البول) وتخصيص وتحسين معايير معينة الفحص، وملامح الجزيئية وتواقيع منخفضة كسور التركيز الجزيئي (على سبيل المثال، والكسور exosomal) سيتم فحصها.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the U.S. Department of Health and Human Services, the National Institutes of Health, the National Institute of Nursing Research, and the Division of Intramural Research to Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06; the Intramural Research Training Awards to Nicolaas H. Fourie, Ralph M. Peace, Sarah K. Abey, and Leeanne B. Sherwin; and special support from the Burroughs Wellcome Fund to Howard Hughes-NIH Research Scholar Ralph M. Peace.
The opinions expressed herein and the interpretation and reporting of these data are the responsibility of the author(s) and should not be seen as an official recommendation, interpretation, or policy of the National Institutes of Health or the United States Government.
Materials
| nCounter Prep-Station | Nanostring | N/A | Essential |
| nCounter Digital Analyzer | Nanostring | N/A | Essential |
| Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | Can use suitable equivalent |
| Centrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| MiniMicroCentrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Pipettes (1000, 100, 20, 10ul) | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Qiacube | Qiagen | 9001292 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood miRNA Kit | Qiagen | 763134 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood Tubes | VWR | 77776-026 | Can use suitable equivalent |
| nCounter Human miRNA Assay Kit | Nanostring | 150625 | Essential |
| nCounter Master Kit | Nanostring | 100050 | Essential |
| nSolver | Nanostring | N/A | Essential |
References
- Aerssens, J., et al. Alterations in Mucosal Immunity Identified in the Colon of Patients With Irritable Bowel Syndrome. Clin Gastroenterol Hepatol. 6, 194-205 (2008).
- Akbar, A., et al. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57, 923-929 (2008).
- Fourie, N. H., et al. Elevated circulating miR-150 and miR-342-3p in patients with irritable bowel syndrome. Exp Mol Pathol. 96, 422-425 (2014).
- Zhou, Q., Souba, W. W., Croce, C. M., Verne, G. N. MicroRNA-29a Regulates Intestinal Membrane Permeability in Patients with Irritable Bowel Syndrome. Gut. 59, 775-784 (2010).
- Zhou, Q., Verne, G. N. miRNA-based therapies for the Irritable Bowel Syndrome. Expert Opin Biol Ther. 11, 991-995 (2011).
- Orlova, I. A., et al. MicroRNA modulation in complex regional pain syndrome. J Transl Med. 9, 1-11 (2011).
- Park, C. -. K., et al. Extracellular MicroRNAs Activate Nociceptor Neurons to Elicit Pain via TLR7 and TRPA1. Neuron. 82, 47-54 (2014).
- Gheinani, A. H., Burkhard, F. C., Monastyrskaya, K. Deciphering microRNA code in pain and inflammation: lessons from bladder pain syndrome. Cell Mol Life Sci. 70, 3773-3789 (2013).
- Drossman, D. A., et al. . Rome III: The Functional Gastrointestinal Disorders. , (2006).
- Chey, W. D., Kurlander, J., Eswaran, S. Irritable bowel syndrome: A clinical review. JAMA. 313, 949-958 (2015).
- Del Valle-Pinero, A. Y., Sherwin, L. B., Anderson, E. M., Caudle, R. M., Henderson, W. A. Altered vasoactive intestinal peptides expression in irritable bowel syndrome patients and rats with trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. World J Gastroenterol. 21, 155-163 (2015).
- Henderson, W. A., et al. Inverse relationship of interleukin-6 and mast cells in children with inflammatory and non-inflammatory abdominal pain phenotypes. World J Gastrointest Pathophysiol. 3, 102-108 (2012).
- Pekow, J. R., Kwon, J. H. MicroRNAs in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 18, 187-193 (2012).
- Veldman-Jones, M. H., et al. Flexible Molecular Subtyping of Clinical DLBCL Samples Using the NanoString nCounter System. Clin Cancer Res. 21, 2367-2378 (2015).
- Lee, J., et al. Nanostring-Based Multigene Assay to Predict Recurrence for Gastric Cancer Patients after Surgery. PLoS ONE. 9, e90133 (2014).
- Lohavanichbutr, P., et al. A 13-gene signature prognostic of HPV-negative OSCC: discovery and external validation. Clin Cancer Res. 19, 1197-1203 (2013).
- . . nCountermiRNA Expression Assay User Manual (MAN-C0009-05). , (2013).
