İrritabl Bağırsak Sendromu içinde miRNA'lar Sirkülasyon tedirginlikler bir Çoklanmış Yüksek verim Gen İfadesi Platformu Kullanma Algılanan
Summary
We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.
Abstract
gen ekspresyon platformu deney, tek bir reaksiyonda fazla 800 transkript (mRNA veya miRNA'ların) ekspresyonunun sağlam ve yüksek oranda çoğaltılabilir ölçümü sağlar. miRNA tahlil doğrudan görüntüleme ve dijital renk kodlu floresan barkodlu prob setleri (bir haberci prob ve bir yakalama probu) ile etiketli miRNA moleküllerini sayarak transkript sayar. Barkodlar 3 'ucuna özel bir oligonükleotid etiketi (miRtag) bağlanması ile uzatılmış olan miRNA'lar olgun doğrudan hibridize edilir. Ters kopyalama ve transkript amplifikasyonu gerekli değildir. Raporcu sondalar dört flüoresan renk bir kombinasyonu kullanılarak doldurulur altı renkli pozisyonların bir diziyi ihtiva etmektedir. altı pozisyonun üzerindeki dört renk gen spesifik bir renk barkod sekansı oluşturmak için kullanılır. Post-hibridizasyon işleme bir robot hazırlık istasyonunda otomatiktir. melezleme, aşırı sondalar, uzak yıkanır ve üçlü yapılar (yakalama yanlısı sonrabe-miRNA haberci prob) biyotin etiketli yakalama sondası ile bir streptavidin kaplı slayt sabitlenir. Görüntüleme ve barkod sayma dijital analizörü kullanılarak yapılır. hareketsiz barkodlu miRNA'lar görüntülendi ve bir mikroskop ve kamera kullanarak görüntülü ve benzersiz barkod deşifre ve sayılır vardır. Veri Kalite Kontrol (QC), normalleştirme ve analiz tahlil yazılımla birlikte özel tasarlanmış veri işleme ve analiz yazılımı tarafından kolaylaştırılır. Deney ifade geniş bir aralığı üzerinde, yüksek doğrusallığı, hem de yüksek hassasiyet gösterir. Örnek ve deney hazırlanması enzimatik reaksiyonlar, ters transkripsiyon ya da amplifikasyon içermez; birkaç adım vardır; ve büyük ölçüde Araştırmacı etkilerinin azaltılması ve yüksek tutarlılık ve teknik bir yeniden üretilebilirlik ile sonuçlanır otomatiktir. Burada, irritabl bağırsak sendromu dolaşan miRNA tedirginlikler tanımlamak için bu teknolojinin uygulanmasını açıklar.
Introduction
genel nüfusun% 15 ve sağlık hizmetleri üzerinde önemli bir yük temsil – İrritabl Bağırsak Sendromu (IBS) 10 afflicting, Gastroenteroloji en yaygın ayakta tanıdır. IBS için Şu anda, hiçbir genel kabul gören tanı biyomarkırlar (yani, tanı klinik semptomlara göre ve GI malignite, İltihabi Bağırsak Hastalıkları ve gastrointestinal (Gİ) enfeksiyonları gibi diğer organik bozukluklar, iktidar olduğu). Böyle IBS, yüksek hassasiyet ve doğruluk (tekrarlanabilirliği) olarak subklinik histopatoloji ile ortak koşullarda gen ekspresyon profillerini incelerken gen ekspresyon profilleri tedirginlikler genellikle 1-3 ince olarak ihtiyaç vardır. miRNA'lar IBS 4,5 hem tanı ve fonksiyonel hedefler olarak tespit edilmiştir ve biz IBS-ilişkili biyolojik tedirginlikler 3,4,6,7 ve biyomarkırları dolaşan olarak kullanımını değerlendirmede özellikle ilgilendi. dolafl klinik kullanımıting biyomarkerlar nedeniyle kolaylığı ve hastaların biyomarkerların 'kaynak (örneğin, periferik kan) toplanması minimal invaziv doğası güncel ilgi çekicidir.
Gen ifadesi platformu deneyleri, çünkü kendilerine özgü kimyası ve akıcı, çoğunlukla otomatik iş akışı, hedeflenen keşif için transcriptome geniş ve özelleştirilebilir kapsama (tek bir reaksiyonda 800 hedef) sağlayan bir mikroarray platform sağlar. Onlar da transkriptomik hedeflerinin nicelleştirmesinde ekspresyon düzeylerinin geniş bir yelpazede üzerinde yüksek hassasiyet ve doğrusallık verim. Deney RNA'nın ters transkripsiyonu, cDNA, veya başka herhangi bir enzimatik reaksiyonları elde edilen amplifikasyon gerektirmez. Bu nedenle, düşük yoğunlukta veya nadir ek yeri varyantları olan RNA türünün amplifikasyonun yüksek devir sayıları ile getirilen potansiyel hatalar dijital sayım işlemiyle azaltılır. Bu, saflaştırılmış toplamı olarak örnek türleri, bu geniş bir yelpazede gelir(Örneğin, mRNA + MiRNA) RNA, RNA, formalinle sabitlenmiş parafine gömülmüş (FFPE) örnekte, hem de ham bir doku ve hücre lizatları, tahlillerde kullanılabilir.
Çevrede RNA'lar her bir hedef RNA üzerinde karşılık gelen bir bölgesini tanıyan bir hedef-özgül sekansı içeren, prob (yakalama ve raportör probları) içindeki bir çifti kullanılarak tespit edilir. Kısa RNA (örn, miRNA'ların) saptanmasını sağlamak için, olgun MiRNA dizisi molekülün 3 'ucuna özel bir oligonükleotid etiketi (miRtag) tavlanmasıyla uzatılır. Olgun hedef miRNA ve miRNA spesifik miRtag her ikisinin bir kısmına tamamlayıcı bir köprü oligonükleotid, özgüllüğünün sekansı sağlamak için kullanılır. Yakalama ve raportör Probes sırasıyla olgun miRNA miRtag kompleksinin uçları 3 've 5' ligate. yakalama sondaları, bunları bir streptavidin kaplı cam slayt yüzeyine takmak için izin 3 'ucunda bir biyotin etiketi, bir, Fixislayt yakalama prob miRNA miRtag-haberci prob kompleksi ng. Elektrik akımı, daha sonra, 5 'ucunda raportör prob tarafından taşınan, floresan barkod bir mikroskop ve şarj akuplaj düzenli (CCD) kamera kullanılarak görüntülendi sağlayan, slayt, yüzey üzerindeki karmaşık yönlendirmek için kullanılır. Barkodlar belirli hedef miRNA'lar sayısını veren, sayılır ve çözülür. Floresan barkod fazla 4.000 renk barkod kombinasyonu, özel bir RNA için, her bir kodlama oluşturmak için kullanılabilecek dört flüoresan renk biri tarafından işgal edilebilir altı pozisyondan oluşur.
Örnek hazırlanması (örneğin, RNA saflaştırma veya hücre / doku lizatı hazırlama), hem de yakalama ve raportör probların hibridleşmesi, tezgah yapılır. On iki örneği tek bir slayt üzerinde multiplekslenebilmektedir. gece boyunca hibridizasyon sonra diğer tüm numune hazırlama bir robot preparatif istasyonu tarafından gerçekleştirilmektedir. Yüklenen slaytlar sonra reklama aktarılırgörüntüleme, sayma, kod çözme ve veri işleme için igital analizörü. Ortaya çıkan veriler, daha kullanıcı kontrolü yüksek derecede işlenmiş eşlik eden yazılım alınır. eşsiz kimyası, basit hazırlık, otomatik doğa, basit veri türü (sayar) ve testin genel aerodinamik iş akışı, yüksek hassasiyetli gen ifadesi miktarının kolaylaştırmak gibi fonksiyonel koşullarda dolaşan miRNA ifade profilleri ve imzalar okuyan o yararlı bir araç yapma IBS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol çerçevesinde kritik adımlar
Özellikle MiRNA deneyi için, reaktifler lizatları ile kullanım için optimize edilmemiş gibi, (bu mRNA ve protein deneylerinde kullanılabilir) saflaştırılmamış lizatları kullanımı kritik değildir, ve numune hazırlama reaksiyonları inhibe olması muhtemeldir. Buna ek olarak, kirletici maddeler ligasyon ve örnek saflaştırma reaksiyonları inhibe edilebilir (örneğin, guanidinyum bileşikleri, etanol ve fenoller) liziz ve RNA saflaştırma adımları taşınan. İyi kalitede RNA miRNA testinin duyarlılık ve doğruluk için kritik öneme sahiptir.
ısıtılmış kapak ile, bir PCR kullanılarak bütün reaksiyon adımları performansını optimize etmek için uygun bir sıcaklık kontrolü elde etmek için önemlidir. Aşama 3.5.1 sırasında, ligaz ilave edilmesi sırasında sıcaklık muhafaza edilmesi amacıyla ısıl gelen şeritler kaldırmak için önemlidir. şeritler Çıkarma ligaz eklemek içinreaksiyonu tehlikeye atar. melezleme adımları gerçekleştirirken, tüplerde reaktiflerin bu muhabir probları kesme olabilir, dinç sarsıntı, pipetleme veya iterek önlemek için kritik öneme sahiptir. En iyi performansı ve tutarlılığı sağlamak için, iyice yumuşak titreşmesinde tarafından tüplere reaktifler karıştırmak için önemlidir. Her zaman karıştırıldıktan sonra tepkileri aşağı spin ve yeni bir pipet bir reaktif doğru pipetlenmesini sağlamak ve yanlışlıkla çapraz bulaşmayı önlemek için dağıtılır her zaman ucu kullanın.
Değişiklikler ve Sorun Giderme
kod setleri ilgi sadece hedefleri içerecek şekilde özelleştirilebilir. Bu sayede, maliyetler ayrıca soruşturma veya biyo-imza doğrularken geniş örneklem kümelerinin test etmek için izin vermek için dengeli olabilir. Özel sondalar alakart menüsünde bulunan genler veya hedefler için değil dizayn edilebilir. az-bol hedefler veya düşük konsantrasyon RNA duyarlılık olabilirve / veya daha yüksek çözünürlükte bir dijital sayma kullanarak daha uzun bir melezleştirme süre izin manipüle.
Çalışmamızda tam kandan toplam RNA ile önceden tanımlanmış 800 hedef miRNA paneli kullanılır; Ancak, analizler bir daha hedefli bir yaklaşım gerekiyorsa az miRNA'lar içerecek şekilde özelleştirilebilir. İki kartuş rahatça robotik hazırlık istasyonunda sonrası hibridizasyon işleme geçirilir ve ertesi gün dijital analizör üzerinde görüntülü olabilir çünkü 24 numune toplam 12 iki takım içinde sendeledi, tek bir günde hazırlanabilir. 12 toplu olarak numunelerin Şaşırtmalı işlem melezleştirme süresi standart önemlidir. Görüntülü edilmiş kartuşları kaydedilir ve veri analizleri daha yüksek çözünürlüklü tarama nadir miRNA'ların tespiti geliştirmek olabileceğini düşündürmektedir eğer yeniden taranması gereken 4 o C'de saklanabilir. nadir moleküllerin tespiti de, daha uzun bir süre örnekleri hibritleme ile geliştirilebilir; Bununla birlikte, uzun süreli hibritleme Resul olabiliraşırı doygunluk t ve başlangıç RNA konsantrasyonları (hücre dışı vezikül kaynaklı RNA gibi) düşük ise, yalnızca sonuçları artırabilir. Platformun duyarlılık ve hassasiyet nispeten düşük miktardaki miRNA'lar güvenilir sayılır izin verir.
Tekniğin Sınırlamalar
tarif edilen gen ifadesi tahlil platformu sadece dizi başına 800 hedeflere kapasitelidir. Bu nedenle tüm miRNA transcriptome / tüm transcriptome çalışmaları için uygun değildir. Sadece, bilinen açıklanan ve belirtilen hedefleri platformu kullanılarak tespit edilebilir, bu nedenle yeni bir molekül türü keşfi için uygun değildir. Bu RNASeq veya diğer geleneksel mikrodizi yöntemleri gibi başka yöntemler, tüm transcriptome keşif çalışmaları için daha uygundur.
Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi
IBS semptomlarının bir kombinasyonu ile karakterize edilir principally karın ağrısı dahil olmak üzere; viseral aşırı duyarlılık; ve sık sık diyare, kabızlık, ya da her ikisi 9,10 bir kombinasyonu gibi barsak bölgesi değişir. İBS belirtileri bilinen organik nedeni var, ve hastalar klinik olarak anlamlı iltihabı, mide-bağırsak dokuları ya da sistemik belirteçlerin 9-12 histopatolojik değişimleri ile sunmazlar. Araştırma IBS biyolojik düzensizliği ortak temalar inflamasyon ve bağışıklık fonksiyonu yaklaşık 10 gelişmekte olan, ince subklinik ve heterojen olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, biz deneyci tanıttı değişimini kontrol ve güvenilir gen ifadesinde ince tedirginlikler saptayabilen bir platformu kullanmak gerekiyordu. tahlil ve sistemin benzersiz nitelikleri örnek işleme standardize ve yüksek tekrarlanabilir veri üretmek için teknik varyans azaltarak, otomasyon yoluyla taşıma deneyci azaltır. Bu özellikler odaklı araştırmalar için izin ve son derece hassas ve r üretmekeplicable verileri. intensity- veya amplifikasyon temelli yöntemler kullanılarak bu daha bol hedeflerin sinyalleri tarafından gözden kaçan ya da gömülmek olabilir düşük sentezleme hedefleri arasında ince tedirginlikler ve tedirginlikler tespiti için izin verir. PCR tabanlı mikroarrayler ve RNAseq yöntemleri tarif platformu kullanarak uygulanabilir alternatifler ve daha yüksek verimlerin istenmiş ya da ne zaman alternatif olarak cazip olabilir Amaç tüm transcriptome karakterize etmek veya yeni moleküllerin aramak için zaman. Ancak, alternatif ve doğru hassas tespit ve nadir hedefler ve ince tedirginlikler miktarlarının yanı performans olmayabilir.
Bu Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi
IBS katılımcılar dolaşan miRNA ifade anlamlı ve kategoriler içinde tutarlı hem de olduğu görüldü tedirginlikler bir dizi gösterdi. tespit miRNA'ların ilgili pathwa ile ilişkiliys ve fonksiyonel ağrı durumuna (miR-342-3p: Kronik ağrılı mesane) de dahil olmak üzere patolojik durumlar, 8 ve inflamasyon (miR-150) 13. örnek çalışma hedefleri ve ilgi sistemlerini tanımlamak için kullanılan bir keşif kohort dayanmaktadır. Bir daha hedefli, küçük miRNA dizi numune başına maliyeti düşürmek ve doğrulamak ve imzalar ve Biyobelirteçleri rafine için maliyet-etkin bir şekilde analiz edilmesi çok daha büyük gruplarda izin inşa edilmiştir. Gen ifade platformu tahlil sistemi mikroarray geleneksel keşif doğası ve rafine ve moleküler imzalar ve Biyobelirteçleri 14-16 test etmek daha hedefli, hipotez odaklı veri toplama arasında bir denge. Yöntem, tarif edilen bir hedef miRNA'ların ifade aşırı veya inhibe deneysel olduğu in vivo ve in vitro bir model molekül ve protein pertürbasyonları incelemek için kullanılır. Yeni deneyler mRNA ve p aynı anda ölçülmesi için izindoğrudan hücre ve doku lizatları roteinler. Ayrıca, periferik kan ve dışkı (örneğin, idrar) spesifik fraksiyonları arıtılmasını optimize ederek ve özelleştirme ve bazı tahlil parametrelerini, moleküler profilleri ve düşük molekül konsantrasyon fraksiyonları (örneğin, exosomal fraksiyonlar) imzalarını optimize ederek ele alınacaktır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the U.S. Department of Health and Human Services, the National Institutes of Health, the National Institute of Nursing Research, and the Division of Intramural Research to Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06; the Intramural Research Training Awards to Nicolaas H. Fourie, Ralph M. Peace, Sarah K. Abey, and Leeanne B. Sherwin; and special support from the Burroughs Wellcome Fund to Howard Hughes-NIH Research Scholar Ralph M. Peace.
The opinions expressed herein and the interpretation and reporting of these data are the responsibility of the author(s) and should not be seen as an official recommendation, interpretation, or policy of the National Institutes of Health or the United States Government.
Materials
| nCounter Prep-Station | Nanostring | N/A | Essential |
| nCounter Digital Analyzer | Nanostring | N/A | Essential |
| Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | Can use suitable equivalent |
| Centrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| MiniMicroCentrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Pipettes (1000, 100, 20, 10ul) | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Qiacube | Qiagen | 9001292 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood miRNA Kit | Qiagen | 763134 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood Tubes | VWR | 77776-026 | Can use suitable equivalent |
| nCounter Human miRNA Assay Kit | Nanostring | 150625 | Essential |
| nCounter Master Kit | Nanostring | 100050 | Essential |
| nSolver | Nanostring | N/A | Essential |
References
- Aerssens, J., et al. Alterations in Mucosal Immunity Identified in the Colon of Patients With Irritable Bowel Syndrome. Clin Gastroenterol Hepatol. 6, 194-205 (2008).
- Akbar, A., et al. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57, 923-929 (2008).
- Fourie, N. H., et al. Elevated circulating miR-150 and miR-342-3p in patients with irritable bowel syndrome. Exp Mol Pathol. 96, 422-425 (2014).
- Zhou, Q., Souba, W. W., Croce, C. M., Verne, G. N. MicroRNA-29a Regulates Intestinal Membrane Permeability in Patients with Irritable Bowel Syndrome. Gut. 59, 775-784 (2010).
- Zhou, Q., Verne, G. N. miRNA-based therapies for the Irritable Bowel Syndrome. Expert Opin Biol Ther. 11, 991-995 (2011).
- Orlova, I. A., et al. MicroRNA modulation in complex regional pain syndrome. J Transl Med. 9, 1-11 (2011).
- Park, C. -. K., et al. Extracellular MicroRNAs Activate Nociceptor Neurons to Elicit Pain via TLR7 and TRPA1. Neuron. 82, 47-54 (2014).
- Gheinani, A. H., Burkhard, F. C., Monastyrskaya, K. Deciphering microRNA code in pain and inflammation: lessons from bladder pain syndrome. Cell Mol Life Sci. 70, 3773-3789 (2013).
- Drossman, D. A., et al. . Rome III: The Functional Gastrointestinal Disorders. , (2006).
- Chey, W. D., Kurlander, J., Eswaran, S. Irritable bowel syndrome: A clinical review. JAMA. 313, 949-958 (2015).
- Del Valle-Pinero, A. Y., Sherwin, L. B., Anderson, E. M., Caudle, R. M., Henderson, W. A. Altered vasoactive intestinal peptides expression in irritable bowel syndrome patients and rats with trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. World J Gastroenterol. 21, 155-163 (2015).
- Henderson, W. A., et al. Inverse relationship of interleukin-6 and mast cells in children with inflammatory and non-inflammatory abdominal pain phenotypes. World J Gastrointest Pathophysiol. 3, 102-108 (2012).
- Pekow, J. R., Kwon, J. H. MicroRNAs in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 18, 187-193 (2012).
- Veldman-Jones, M. H., et al. Flexible Molecular Subtyping of Clinical DLBCL Samples Using the NanoString nCounter System. Clin Cancer Res. 21, 2367-2378 (2015).
- Lee, J., et al. Nanostring-Based Multigene Assay to Predict Recurrence for Gastric Cancer Patients after Surgery. PLoS ONE. 9, e90133 (2014).
- Lohavanichbutr, P., et al. A 13-gene signature prognostic of HPV-negative OSCC: discovery and external validation. Clin Cancer Res. 19, 1197-1203 (2013).
- . . nCountermiRNA Expression Assay User Manual (MAN-C0009-05). , (2013).
