過敏性腸症候群におけるmiRNA循環の摂動は多重化ハイスループット遺伝子発現プラットフォームを使用して検出します

ここで説明する研究は、国立衛生研究所の施設内倫理委員会（Clinicaltrial.gov＃NCT00824941）によって承認されました。 全血サンプルの1コレクション （長期保存を可能にする）、RNA安定化溶液を含む採血管中に静脈穿刺を介して、研究参加者から全血サンプル（2.5 ml）を採取し、RNA精製まで-80℃で保存します。 2.トータルRNA精製解凍し、2時間の血液チューブをインキュベートし、その後5000のx gで10分間、スイングアウトローターを使用してそれらを遠心分離します。ペレットを乱さないように注意しながら、慎重に廃液チューブに注ぐか、またはそれをピペットで上清を取り除きます。 ペレットは目に見えて溶解するまで、RNaseフリー水4mlを添加することにより、ペレットを洗浄し、しっかりとキャップを交換し、渦。 10分、再ために5000×gで、スイングバケットローターを用いて、遠心分離ステップ2.1で説明したように、上清を移動します。 ペレットにBM1バッファ（提供）の350μlのを追加します。それは目に見えて溶解するまで、ペレットをボルテックスし、自動化された全RNA抽出のための2-mlの処理チューブに移します。 ロボットRNA抽出システムで自動化することができる市販のRNA抽出キットを用いて全血から、miRNAを含む細胞内RNAの自動化精製を行います。 注：私たちは一度に12サンプルを処理することができます使用され、それが完了するのRNA精製プロトコルの3時間を要し、自動化ロボットシステム。 ロボットRNA抽出システムにRNA精製キットに付属事前ロードされたピペットチップ、遠心分離管、緩衝液、および試薬をロードします。 プロトコルの選択メニューから「血液のmiRNAパートA」プロトコルを選択し、実行を開始します。 注：自動化された手順の説明については、補足資料を参照してください。 ロボットが共存していたら、自動化されたmiRNA精製プロトコルのmpletedパートA、廃棄物の容器を空にし、ロボットシステムから使用されるプラスチックおよび試薬容器を削除します。 溶出したRNAを含む全てのマイクロ遠心管に蓋を閉じ、シェーカーアダプタに配置します。 5分間65°Cの時のサンプルをインキュベートするプロトコル選択メニューから「血液のmiRNAパートB」を選択します。 ロボットがmiRNA精製プロトコールのパートBの実行が完了したら、すぐにサンプルを除去し、氷の上に冷やします。 定量および分光光度計を用いて精製されたRNAの品質を評価します。 注：miRNAのアッセイのためのプロトコルの推奨事項を1として、33 ngの/μlでの最小濃度が必要とされ、全てのサンプルが存在しないことを確実にするために1.9の280/260比1.8の最小260/230比を満たしているか、超えなければなりません重要な有機汚染の、​​アッセイ性能に影響を与える可能性がある（17リファレンスを参照してください）。 C. O -80でサンプルを保管してください 3. miRNAのサンプル調製 33 ngの/ヌクレアーゼを含まない水を使用してμlに12 RNAサンプルを正規化します。 ヌクレアーゼフリー水を用いたアッセイキットに付属のmiRNAコントロールの1：500希釈を準備します。氷の上に保管してください。 アニーリングマスターミックスを調製する：10-、20-μlのピペットを使用して（ステップ3.2で調製した）アニーリングバッファー（提供）の13μlを、miRtag試薬（提供）の26μlを、およびmiRNAコントロールの6.5μLを兼ね備えています。 10μlのピペットを用いて、12 0.2-mlのストリップチューブのそれぞれにアニールマスターミックスの3.5μlのとRNAサンプル（ すなわち 、100 ngの）の3μlを添加します。 、ミックス卓上ミニマイクロ遠心（2000×gで）を使用してスピンダウンし、場所サーモサイクラーにするフリック（10分間94°Cの 1分間、65°Cのを2分間、および45°Cの 、48°Cの時に保持） 。 3μを組み合わせることにより、ライゲーションマスターミックスを調製します20μlのピペットを用いて、連結緩衝液（提供）とポリエチレングリコール（PEG提供）の19.5マイクロリットルのリットル。 10μlのピペットを用いて、ステップ3.4からストリップチューブのそれぞれにライゲーションマスターミックスの2.5μLを加えます。 、穏やかに混合する卓上型ミニ微量（2000 XG）を使用してスピンダウンし、5分間48°Cのでサーモに戻ります。 O 5分後、10μlのピペットを用いて、3分間サーマルサイクラーに各チューブに直接リガーゼの1μlを添加し、3分間48°Cのでそれらをインキュベート、47°Cの 、46°Cの 3分間、45 5分間のC、および65°Cの 10分。 4 O℃で保持 （提供）サーモサイクラーからチューブを外し、静かにそれらを混ぜ、卓上ミニマイクロ遠心（2000×gで）を使用して、それらをスピンダウン、および連結クリーンアップ酵素の1μlを添加します。サーモサイクラーにチューブをインキュベート（37°Cの 10分間、1時間および70°Cのために、4 Oで開催</s> C）まで。 10μlのピペットを使用してください。 チューブを外し、、100μlのピペットを用いて、ヌクレアーゼフリー水40μlを添加、混合し、卓上ミニマイクロ遠心（2000×gで）を使用してスピンダウン。 4. miRNAのハイブリダイゼーション氷上で記者と（提供）キャプチャープローブセットを解凍し、卓上ミニマイクロ遠心（2000×gで）を使用して、それらをスピンダウン。 200μlのピペットを用いて、ハイブリダイゼーションマスターミックスを作成するために、レポーターコードセットチューブ（130μL）にハイブリダイゼーション緩衝液130μlを添加します。混合し、卓上ミニマイクロ遠心（2000×gで）を使用してスピンダウン。 注：Reporterと捉えプローブがパネルに含まれる各miRNAのための具体的かつ標準的なものです。カスタムパネルとユーザ設計捕捉およびプローブセットを設計することができます。 12新しい0.2 mlのストリップチューブでは、20μlのピペットを用いてハイブリダイゼーションマスターミックス20μlを添加します。 85°Cの FOでステップ3.7からのmiRNAサンプルを変性R 5分間、氷上にそれらを冷却します。 10μlのピペットを用いて、ステップ4.3から管のそれぞれに5μLを加えます。 プログラム永遠時30μlのボリューム算出された温度と加熱蓋で65°Cのにサーモサイクラーは、（実行の終了時に4°Cのにランプダウンするためにそれをプログラムしません）を設定します。 10μlのピペットを用いて、各チューブにセット捕捉プローブの5μlを添加、混合し、卓上ミニマイクロ遠心（2000×gで）を使用してスピンダウンし、すぐに65℃。でサーモに置きます無未満12時間とせいぜい30時間インキュベートします。 5.準備駅、デジタル・アナライザプレップステーションをロードします。 ステーションのドアを開け、試薬プレートをロードする（提供）、カートリッジ（提供）、ピペットチップ（提供）12 0.2-mlのストリップチューブ、および12空の0.2 mlのストリップチューブ中（提供）、調製されたサンプル。ストリップチューブキャップと試薬プレートカバーを取り外します。プレップステーションを閉じますドアとは、コントロールパネルから適切なアッセイを実行します。 注：ハイブリダイゼーション後の処理にかかわらず、アッセイされるランの、同じです。すべての試薬およびプラスチック用品は、あらかじめパッケージ化され、室温にそれらをもたらす、2分間2000×gで試薬を含む96ウェルプレートをスピンダウン以外の調製を必要としません。すべてのコンポーネントは、準備ステーションで明確に定義された位置にロードされます。自動化された手順の説明については、補足資料を参照してください。 視覚化し、固定化された配向三者複合体のバーコードを数えます。 、準備ステーションからカートリッジを取り外して設けられたカバースリップでそれを封印し、カメラの光学上記スロット内のデジタルアナライザに配置します。 アッセイキットに記載されている適切なアッセイ（miRNAのパネルアッセイ）およびアッセイのバージョンを選択して、プログラムを実行します。 注：デジタルアナライザは、各サンプルの位置aのためのビュー画像のフィールドを取ります4励起波長T、蛍光バーコードを読み取り、デコードすることを可能にします。特定のmiRNAに対応する具体的なバーコードは、カウントされます。 インターネットリンクを介してサーバーに直接USBにデータファイルをエクスポートしますか。 6.データ処理・解析 「生データ」タブをクリックし、「インポートRCCファイル」を選択します。 USBからRCCファイル（生データファイル）を含むフォルダを選択します。 「次へ」をクリックして、すべてのQCボックスを選択し、「インポート」をクリックします。 「新研究」タブをクリックします。名前を付けて、研究を記述し、保存します。 新しい研究では、「新実験」タブと名前を選択して新規の実験を説明します。 「次へ」をクリックして、アップロードされた関連する生データファイルが含まれている左側のペインからRLFフォルダを選択します。それが選択されたら、「選択してください」をクリックし、「次へ」をクリックします。 加えます注釈があれば希望すると「次へ」をクリックします。 背景差分法を選択します。ネガティブコントロール、ブランク、レーン減算、またはユーザー定義の減算のいずれかを選択することができます。選択したら、「次へ」をクリックします。 注：技術的なパラメータと研究の生物学的状況に基づいて、最も適切なバックグラウンド補正のアプローチを決定します。 注：カウントは、低存在量の目標にはあまり正確で。ここで説明する研究の目的のために、データは最初QCパラメータを検討すると、技術的複製物間で異なる存在量のmiRNAのための数の変化を検討するために、バックグラウンド補正なしで処理しました。データは、25カウントのバックグラウンド閾値を用いて再処理しました。 「トップ100」の正規化を選択し、「次へ」をクリックします。 、比データを取得比パラメータを選択し、「次へ」をクリックしてください。 「完成」をクリックします。 名前の元をクリックします「生」を含むドロップダウンメニューを明らかにするために、左ペインでperiment、「正規化」、「グループ化」、「比データ」、および「分析データ」。 「生データ」をクリックし、右ペインのQCレポートを観察します。デフォルトのQCのパラメータを渡していないサンプルに次のフラグを確認します。フラグ付きのサンプルを含むと記載されているように再処理していない新たな「研究」を構築し、または単に「QC /正規化フラグによってサンプルを除外する」を選択することにより、データ解析ステップからフラグ付きQCサンプルを除外します。 エクスポート「生」、「正規化」、またはCVSで「グループ化」のデータファイルまたは別の統計またはマイクロアレイソフトウェアでの分析のための別の互換性のあるファイル形式。 左側のペインから「正規化されたデータ」を選択し、右側のペインで、分析の対象となるサンプルを選択します。 「分析」をクリックして、所望の分析の種類（ 例えば、「ヒートマップ＆＃を選択34 ;,「ヴァイオリンのプロット」、「ボックスプロット」、「散布図」、「ヒストグラムプロット」）。希望の除外基準・ボックスを選択します（ 例えば、制御遺伝子を除外し、QCフラグによりサンプルを除外し、異常値サンプルまたは遺伝子を除外、および/またはデータ分析から正規化プローブを除外）。 所望のように分析から除外されるように個々のサンプルを選択します。 希望通りから除外または分析に含まれるべき個々の遺伝子を選択します。 選択した統計やデータの可視化操作のためのパラメータを選択し、「完了」をクリックしてください。