JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

ויזואליזציה של Assay Resazurin פחם אגר עבור וכמותיות, ספירת בינוני תפוקה של Mycobacteria

Published: December 14, 2016
doi:
10.3791/54690
, , , , , , , ,
1Departments of Microbiology & Immunology,Weill Cornell Medical College, 2Medicine,Weill Cornell Medical College

Summary

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

Abstract

קיים צורך דחוף לגלות להתקדם נוגדי זיהום כי לקצר את משך שחפת (TB) טיפול. שחפת Mycobacterium, הסוכן אטיולוגי של TB, הוא עקשן לכימותרפיה מהירה ומתמשכת בשל נוכחותם של חיידקים המפגינים עמידות לתרופות פנוטיפי. ג harcoal גאר r esazurin ssay (CARA) פותח ככלי לאפיין מולקולות פעילות התגלו על ידי קמפייני הקרנת תפוקה גבוהה נגד משכפלים ולא משכפל מ שחפת. הכללה של פחם פעיל במדיום אגר bacteriologic עוזר למתן את השפעתה של תרכובת ה- carry-over, ומבטל את הדרישה מראש לדלל תאים לפני תצפית על CARA microplates. לאחר תקופת דגירה 7-10 יום ב 37 מעלות צלזיוס, צמצום resazurin ידי microcolonies mycobacterial גדל על פני השטח של בארות microplate CARA מתיר asse וכמותיותssment של מספרי חיידקים באמצעות fluorometry. CARA מזהה כ הבדל 2-3 יומן 10 במספרים חיידקים צופה ריכוז bactericidal מינימלי המוביל ≥99% להרוג חיידקים (MBC ≥99). CARA עוזר לקבוע אם מולקולה פעילה על חיידקים כי הם משכפלים, שאינם לשכפל, או שניהם. ניסויי פיילוט באמצעות CARA להקל על זיהוי אשר ריכוז של סוכן בדיקה וזמן חשיפה מתחמת דורש הערכה נוספת על ידי מבחני מושבה להרכיב יחידה (CFU). בנוסף, CARA יכול לחזות אם פעילים משכפלים הם בקטריות או בקטריו.

Introduction

שחפת Mycobacterium, הסוכן אטיולוגי של שחפת, יכול לשרוד שורה במצב רדום כי הוא עקשן כדי מיגור אנטיביוטי. פנוטיפי (שאינם גנטיים) התנגדות של שחפת במהלך ההדבקה היא ככל הנראה נובע, בין השאר, לאוכלוסיות של החיידקים הלא משכפלים 1,2. Persisters Class I מוצג עמידות לתרופות פנוטיפי להתעורר באמצעות מנגנונים סטוכסטיים נדירים בקרב אוכלוסיות גדולות של תאים רגישים סמים 3,4. Class II persisters ניתנים-מעתיק הלא מגורמים החסינות המארח, כולל חיצוני מדגיש במיקרו-סביבות נתקלו במהלך ההדבקה. אנחנו לאחרונה פיתח מודל במבחנה של Class II שאינם משכפלים התמדה לחקות את התנאים מול מ שחפת ב מקרופאגים מופעל גרנולומות. המודל רב-לחץ של התמדת Class II הכולל תנאים כי צמיחה איטית, כגון מקור פחמן חומצות שומן, ובאופן מוחלט אלt צמיחה, כגון חומציות קלה (pH 5.0), היפוקסיה (1% O 2), ותחמוצת חנקן ביניים חנקן תגובתי אחר 5-9. הקרנה בקנה מידה גדולה העסקה מודל רב-לחץ הזה של שכפול עישון, ו- II המחלקה אחרים דגמים שאינם לשכפל, ניב מולקולות מגוונות שפעילותם מכוונת נגד מדינת המשכפלות הלא 5-7,9-18. אותו אי-משכפל מסכי חשף גם לקטגוריה של מולקולות בעלי פעילות כנגד השני מעתיק ולא משכפל חיידקים, כינה "פעילים כפולים" 7,10,12,19,20.

גילוי תרופות אנטיבקטריאלי בשלב להיט-to-Lead כרוך אפיון נרחב של מולקולות מועמד לבחור מובילים להרחבת להיט, אפיון תרופתי ראשוני, זיהוי מטרות, ומחקרים יעילים vivo ראשוניים. כצעד מוקדם, נוגדי זיהום והם מסווגים על פי המנגנון בקטריו או בקטריות הפעולה שלהם, אם בקטריות, wלהרוג חיידקי קביעה האם הוא הזמן- ו / או ריכוז תלוי. יחידת מושבה להרכיב (CFU) assay היא השיטה הסטנדרטית הקלסית, זהב במטרה לענות על שאלות אלה. ב assay CFU, חיידקים נחשפים סוכן בדיקה, שלאחריו aliquots יוסר, בדילול סדרתי, ו aliquots של דילולים פרושים על מדיום bacteriologic מוצק וטופח להתיר צמיחה של תאים ששרדו. לבסוף, מושבות חיידקים הם מנויים. את assay CFU דורש מספר גדול של צלחות microtiter לדלל תאים אגר המכיל פטרי צלחות למנות המושבות ששרדו. את assay CFU עבור mycobacteria ההולכת וגואה הקשה על ידי הזמן ההדור האיטי שלהם (18-24 שעות), המחייב כ 3 שבועות עבור מושבות להופיע על צלחות. יתר על כן, שטח חממה מוגבל לעתים קרובות במתקנים מיוחדים בטיחות ביולוגית ברמה-3.

בעוד מסורבל, מבחני CFU הם תקן הזהב לאפיין את ההשפעה של מולקולות לא-שכפול כפול-אקטיביות על mycobacterIA. מבחני-שכפול ללא כפופים ל חיוביות שגויות גבוהה כמו רבים הם מצמידים את משכפלים מבחני להעריך 6-8 הכדאיות הסלולר. לדוגמא, תרכובת כי יש פעילות חזקה נגד שכפול מ שחפת (א "שכפול פעיל") עלול להיכשל להרוג במהלך assay שאינו משכפל, אך עדיין יכול להרוג מכוח לשאת על מהשלב שאינו משכפל של assay אל שלב ההחלמה של assay, אשר מתנהל בתנאים תומכים שכפול ( "משכפלי תנאים"). מתחם לשאת מעל מסבכת עוד יותר ניתוח של מולקולות כפולות פעילות, ולכן קשה להבחין אם הפעילות הייתה משכפלת, שאינו לשכפל, או כפול.

כדי לטפל בבעיות שתוארו לעיל, פיתחנו את r ג harcoal גאר esazurin ssay (CARA) עבור ספירה מהירה, וכמותיות של מינים mycobacterial כגון מ tuberculOSIS, M. בוביס BCG, ומ 'smegmatis 7 (איורים 1 ו -2). בשנת תמיסות בופר במבחנה, פחם פעיל במהירות sequesters רוב התרופות הסטנדרטיות המשמשות לטיפול בשחפת 7. פחמים פעילים ב CARA microplates נקשר תרכובות שעלולות לשאת מעל מ microplate assay, ו תכונה זו של CARA מבטלים את הדרישה לדלל תוכן היטב assay סדר לפני ספירת 7,21,22. מספר microcolonies mycobacterial על פני השטח אגר של CARA microplates מוערך על ידי תוספת של resazurin, צבע כחול, הקטינה בצורה שאת, resorufin, הוא מולקולה ורוד הקרינה אשר נמדד על ידי spectrophotometry 23. CARA microplates מודגרת במשך 1-2 ימים עבור מ smegmatis ו 7-10 ימים mycobacteria ההולכת וגואה כגון שחפת ו BCG בוביס מ. CARA יש טווח דינמי צר של ~ 2-3 יומן 10 diffeלורנס ב CFU. כאשר נעשה שימוש במקום של assay CFU, microplate CARA יחיד מחליף כחמש 96-גם צלחות המשמשות דילולים סדרו 120 Tri-סגנון צלחות אגרו משמשים ציפוי. פרשנות של נתוני CARA עוזרת להנחות מחקרים מאוחרים יותר על ידי קביעת זמנים אשר הדגיר וריכוזיים מתחם לבחון מבחנים מייגעים יותר מבוססים CFU.

Protocol

1. הכנת CARA microplates 900 מ"ל החיטוי של אגר מידלברוק 7H11 המכיל גליצרול 0.2% ו -0.4% פחם פעיל בבקבוק 2 ליטר Erlenmeyer, או לחילופין, 450 מ"ל בכוס זכוכית 1 ליטר. כלול בר ומערבבים autoclavable גדול בבקבוק או בכוס. מכסה את פתיחת הבקבוק או הכוס עם רדיד האלומיניום לצרף זכוכית עם קלטת חיטוי. מגניב לגעת (כ 55-65 ° C) בצלחת ומערבבים מגנטית להגדיר במהירות נמוכה כדי לשמור על פחם השעיה. ביצוע כל הצעדים הבאים בסביבה נקיה מחיידקים במנדף בטיחות ביולוגי כי יש צלחת ומערבבים מגנטית. הסר רדיד. הוספת 100 מ"ל תוספת OADC (תוספת OADC, כאשר נעשה שימוש ב -10%, ריכוזי התקשורת הסופי תשואות של דקסטרוז 0.2%, אלבומין 0.5%, 0.085% NaCl, 0.0005% חומצה אולאית, ו -0.4 מ"ג / מ"ל ​​catalase) ל -2 הבקבוק L Erlenmeyer , או 50 מ"ל OADC עד 1 כוס L, וממשיכים לערבב. אם באמצעות בקבוק Erlenmeyer, יוצקים כ 25-40 מ"ל של 7H11-OADC-פחם לתוך מאגר מגיב סטרילי. אם באמצעות מבחנה, אין זה הכרחי להשתמש מאגר מגיב. ממלאי microplate 96-היטב עם 200 μl / היטב 7H11-OADC-פחם מהמאגר המגיב או המבחנה. לעבוד במהירות כדי למנוע התמצקות והכנסה אגרה של בועות. הימנע מתיז מחוץ בינוני מוצק של בארות, כפי שיכול להיות מקור לזיהום פטרייתי. בעזרת פיפטה רבת ערוצים, השתמש סט אחד של 12 טיפים מסננים להעברת 7H11-OADC-פחם אל 8 השורות (AH) של הצלחת 96-היטב. הערה: הבינוני מבצר במהירות. כדי למנוע סתימת טיפים פיפטה, לשנות אותם לעתים קרובות. לחלופין, לשפוך CARA microplates באמצעות פיפטה רבה אלקטרונית p1000 עם טיפים מסננים כדי לסייע בהכנת צלחות רבות. הערה: עקב ההיקף הנמוך של בארות microplate, אגר ב CARA microplates מבצרת בתוך דקות של המזיגה. ערימות מקום CARA microplates ב ba פלסטיק הניתנת לאטימה חוזרתGS להימנע מהתייבשות. חנות CARA microplates על 4 מעלות צלזיוס. 2. הגדרה מעתיקה ואי-משכפלי MIC 90 מבחנים לחסן מ שחפת, BCG בוביס מ או מ smegmatis לעבר OD 580 של 0.01-0.1 ולהרחיב לשלב יומן אמצע (OD 580 ~ 0.5) ב מידלברוק 7H9-ADN (מידלברוק 7H9 המכיל גליצרול 0.2%, 0.2% דקסטרוז אלבומין, 0.5%, ו 0.085% NaCl) או 7H9-OADC (מידלברוק 7H9 המכיל גליצרול 0.2% ו -10% תוספת OADC). לגדול מ שחפת ומ בוביס BCG כמו ~ 20 מ"ל עומד תרבויות צלוחיות תרבית תאים ומ 'smegmatis עם רעד ב-תחתית עגולה פוליפרופילן (תרבות 4 מ"ל) או 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטי (10-20 התרבות מ"ל). דגירה mycobacteria פתוגניים על 37 מעלות צלזיוס עם 20% O 2, 5% CO 2, ומ 'smegmatis על 37 מעלות צלזיוס עם 20% O 2. הגדרת מעכבות מינימאליותריכוז (MIC 90) ניסוי -style תחת מעתיק ותנאים שאינם משכפל (איור 2). הערה: סוכנים מבחן בדרך כלל assayed ב כפילויות או quadruplicates להתיר בדיקה 4, או 2 תרכובות, בהתאמה, לכל microplate 96-היטב. לדוגמה, בצלחת 96-היטב, סוכן מבחן אחד יכול להיות assayed בשורות AD ועוד בשורות EH. את DMSO (רכב) הוא בטורים 1, 2, ו -12, ואת סדרת דילול סוכן מבחן שיוצא טור 3 (הריכוז הנמוך ביותר) לעמודה 11 (הריכוז הגבוה ביותר). מבחני MIC 90 -style בדרך כלל להעסיק סדרת דילול פי 2. ישנם שאינם משכפלים רבים דגמים זמינים עבור mycobacteria 14-16,18,24,25 ו לצורכי המחשה, אנו משתמשים במודל רב-לחץ של 6,8,9-שכפול שאינו. עבור assay, לשכפל, להפיץ 200 תאים μl ב 7H9-ADN לעבר OD 580 של 0.01 לתוך כל הבארות של התרבות ברור תחתית, רקמות שטופלו צלחת 96-היטב. <li> עבור assay שאינם משכפלים, לשטוף תאים פעמיים בופר פוספט (PBS) המכיל 0.02% tyloxapol, ותאי resuspend במדיום שאינו משכפלים (0.05% KH 2 4 PO, 0.05% MgSO 4, 0.005% ציטרט אמוניום וברזל 0.0001,% 2 ZnCl, 0.1% NH 4 Cl, 0.5% BSA, 0.085% NaCl, 0.02% tyloxapol, 0.05% בוטיראט; pH מותאם 5.0 עם 2 N NaOH). לדלל תאים ל OD 580 של 0.1 במדיום שאינו משכפל ולהוסיף Nano 2 ממלאים מוכנים טרי 1 M לריכוז סופי של 0.5 מ"מ. הפץ 200 תאים μl לעבר OD 580 של 0.1 לתוך כל הבארות של התרבות ברור תחתית, רקמות שטופלו צלחת 96-היטב. הערה: כן דילולים מתחמים כמו פתרונות מניות של פי 100 ב DMSO. לכן, צלחת MIC טיפוסי בדיקת ההשפעה של מולקולה בריכוז סופי 0.4-100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ידרוש פתרונות המניות של 0.04-10 מ"ג / מ"ל ​​ב DMSO. הוסף 2 μl של dilutions של סוכן מבחן 1 לשורות AE ו -2 μl של דילולים של סוכן מבחן 2 לשורות EH. מערבבים היטב. מוסיפים 2 שליטה ברכב μl (בדרך כלל DMSO) לתוך בארות שליטה, עמודות 1, 2, 12 (שורות AH). מערבבים היטב. עבור כל ניסוי, לכלול לפחות שליטה חיובית כגון ריפמפיצין מן 0.004 כדי 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​(assay משכפלים) ו / או 0.08 כדי 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​(assay המשכפלות שאינם). הערה: שימוש 6-bromo-1H-indazol-3-אמין 9 על 0.1 כדי 25 מיקרוגרם / מיליליטר מומלץ כמתחם בקרה שיש בה סלקטיבית, ננו 2 פעילות תלויות במודל רב-מתח של שכפול שאינו. עבור שכפול מבחנים, דגירת microplates ב 37 מעלות צלזיוס ב 20% O 2, 5% CO 2 למשך 7 ימים (מ שחפת ומ בוביס BCG) או 1-48 שעות (מ smegmatis). עבור דגם מתח רב של שכפול עישון, דגירה microplates למשך 7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס ב 1% O 2, 5% CO 2 (<em> M. שחפת ומ בוביס BCG). 3. הרכבה של CARA microplates בנקודות זמן שבהן CARA ישמש בתור מחוץ לקרוא, בזהירות resuspend גם תכולת הצלחת assay -style 90 MIC באמצעות פיפטה רב p200 נקבע על 50-75 μl. עד פיפטה ומטה לפחות 5-10 פעמים בעדינות מערבולת את התוכן גם בתנועה מעגלית באמצעות הטיפים פיפטה. העברת 10 μl של תוכן טוב assay אל microplate CARA. ודא כי הצו של התוכן הטוב על צלחת assay תואם את סדר התוכן הטוב של microplate CARA. הימנע מתיז במהלך העברות וודא 10 μl הם הבחינו לאמצע בארות microplate CARA. אשר את 10 μl סופג לתוך microplate CARA. הערה: אין דילולים נדרשו לפני תצפית תאים על CARA microplates. ערימות לאגד של CARA microplates עם קלטת צלחתואז למקם לתוך שקית פלסטיק הניתנת לאטימה חוזרת. דגירה CARA microplates על 37 מעלות צלזיוס עם 20% O 2 (מ smegmatis) או 1% O 2, 5% CO 2 (מ שחפת ומ בוביס BCG). לקבלת מ שחפת ומ בוביס BCG, משכפלים מבחני: דגירה של 7 ימים; עבור שחפת ו בוביס מ BCG שאינם משכפלים מבחנים, דגירה במשך 10 ימים; עבור מ 'smegmatis, משכפלי מבחנים, דגירה של 1-2 ימים; עבור מ 'smegmatis, מבחנים שאינם לשכפל, דגירת 2-3 ימים. הערה: טיימס הם הערכות ועשוי להיות שונה בהתאם עבור שכפול שונה, שאינו לשכפל, ותנאי לחץ. 4. פיתוח CARA microplates לפתח את CARA microplates כאשר סרט של התפתחות חיידקים, או, מושבות מקרוסקופית גדולות, גלוי על בארות בקרה השלילית (רכב). הערה: לאחר דגירה ממושכת, בארות microplate CARA לעתים קרובותנראה יבש ואנו ממליצים תוכן טרום להרטיב היטב עם PBS סטרילית. זה משמש כדי למנוע הפחם מפני ספיגת resazurin, מה שעלול להוביל קרינה נמוכה או אמיד גם וריאציה. באמצעות סט אחד של 12 טיפים p200 עם טפטפת רב, לוותר 40 μl של PBS סטרילי לאורך הצד של בארות ולאפשר PBS להפיץ לרוחב החלק העליון של microcolonies חיידקי / אגר. כן CARA בפיתוח מגיב על ידי ערבוב 5 מ"ג resazurin (0.01% סופיים) ו -50 מיליליטר של 5% Tween80 ב PBS. וורטקס ולסנן סטרילית. הערה: כרטיס מגיב בפיתוח חלופה CARA יכול להיות מוכן על ידי ערבוב מוכן מסחרית resazurin בתמיסה נוזלית של 1: 1 (כרך / כרך) עם 10% Tween80 ב PBS. הוסף 50 μl של מגיב CARA בפיתוח מוכן טרי היטב כל של microplate CARA בעזרת פיפטה 12 ערוצים. צלחות רוק הלוך ושוב כמה פעמים כדי לעזור להפיץ מגיב על פני המזרן אגר חיידקים בכל טוב. מניחים את הצלחות iשקית resealable פלסטיק נה לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות עבור מ smegmatis ו 45-60 דקות עבור שחפת או M. בוביס BCG. הערה: אם בארות שליטה ברכב הצליח להפוך ורוד במהלך השעה הראשונה, הצלחות ניתנות מחדש ארזה וטופחו במשך תקופות זמן ארוכות יותר. לפני קריאת קרינה, למקם CARA microplates במנדף בטיחות ביולוגי במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר עם המכסים שלהם הוסרו. בעת שימוש ספקטרופוטומטרים BSL3 מחוץ ארון בטיחות ביולוגי, לדבוק מדבקת PCR האיכות אופטית על הצלחת וסוגרים על ידי לחיצה בעדינות על פני שטח המדבקה עם מגבת נייר רכה. לקבוע קרינה באמצעות העליון לקרוא עם עירור ב 530 ננומטר פליטה ב 590 ננומטר. אין זה הכרחי כדי ריק הצלחת. ניתוח 5. נתונים ריכוז מגרש מעכב על ציר ה- X על סקלה לוגריתמית 10 הקרינה על ציר Y-על בקנה מידה ליניארי. השתמש פיזורעלילת העסקה עקומה להתאים כגון "יומן מעכב מול מדרון תגובה משתנית (4 פרמטרים)". נקודות נתונים מגרשים כאמצעי ± שגיאת התקן.

Representative Results

תוצאות CARA צפים מתוארות באיור 2 מוצגות בטבלת 1. עבור שכפול תאים, CARA מנוהלת במקביל עם מבחני תקן 90 MIC, ועל מבחנים שאינם משכפל את CARA מנוהלת במקביל עם assay 90 MIC מותאם כי מצמיד את שלב תוצאה. ריכוז סוכן מבחן שתוצאתו כישלון הקרינה CARA להתעלות מעל רמות הרקע הוא CARA-MBC ≥99 (איור 3 א). התחתי "≥99" מציין כי CARA-MBC מספק ריכוז מוערך של סוכן בדיקה מולידה ≥2 10 יומן להרוג חיידקים (≥99 להרוג%). את assay נוזל מרק MIC 90 אינו מסוגל להבחין בין בקטריות ופעילות בקטריו והבחנה זו צריכה להיפתר על ידי assay CFU. על ידיהאמנה, הסף המבדיל bactericidal מפעילות בקטריו עבור mycobacteria הגדלים לאט הוא כ 2-3 יומן 10 להרוג למעלה מ -7 ימים 7,26. מאז הטווח הדינמי של CARA הוא גם 2-3 להרוג יומן 10, CARA יכול לספק אומדן של בקטריות או פעילות בקטריו. CARA בקלות מזהה כמה פעילים משכפלים כמו בקטריו בשל כשל של תרכובות אלה כדי להקטין קרינת CARA לרמות רקע (איור 2). עם זאת, כמה תרכובות עם פעילות בקטריו נגד שכפול מ שחפת להיות השפעה פוסט-אנטיביוטי חזק, כלומר הם ממשיכים לעכב לצמיחה מחודשת של חיידקים במהלך שלב ההחלמה גם בהיעדר של העברת המתחם. תופעה זאת יכולה להיות קשה לזהות ב assay CARA. תרכובות חשודות בהפעלת השפעה פוסט-אנטיביוטיה אם הם מציגים "חלון סטטי", מוגדר כשינוי פי 4> אל betwee התקיןn עקומות מיקרופון CARA (איור 3B). חלון סטטי עולה כי מולקולה פעילה נגד שכפול מ שחפת עשויה להיות בקטריו במקום bactericidal. במקרים מסוימים, חלונות סטטי ניכרת רק לאחר הבדיקה של קרינת ציר Y מורחבת CARA (איור 3c ו 3D). נתוני 90 CARA ו MIC בדרך כלל הם זממו יחד (איור 4). נציגי נתונים עבור מולקולות replicating- והלא המשכפלות פעילות נבדקו על ידי MIC 90 ו CARA מוצגים באיור 4. ישנן 4 כיתות אשר עיקר הפעילות עבור מולקולות: 1) משכפלים bactericidal (הפגינו עם איזוניאזיד, איור 4 א); 2) משכפלים בקטריו (הפגינו עם linezolid, איור 4); 3) אי-משכפלים bactericidal (הפגינו עם oxyphenbutazone, איור 4C); ו, 4) נציגlicating-אקטיבי (בקטריו או בקטריות) והלא-משכפלים bactericidal (הפגינו עם PA-824, איור 4d). חשוב לציין, איורים 4 א ו -4 להפגין שבעוד איזוניאזיד ו linezolid נראה כי פעילות נגד חיידקים שאינם משכפלים ידי assay MIC 90, CARA מציע להם אינם פעילים בתנאים שאינם משכפלים נבדק. כדי לבחון את התועלת של CARA ב נבא הזמן- של מולקולה והשפעת ריכוז התלויה, משכפלים מ smegmatis נחשף ריכוז גדל והולך של ריפמפיצין (5a הדמוי – ד), ובזמנים שונים בין 1-24 שעות, aliquots נראה לצלחות CARA. נתונים אלו הצביעו על כך ריפמפיצין המופעל השפעה מוקדם ככל 1 hr (איור 5 א), מוצגת פעילות bactericidal הגדלת בין 3 ל 24 שעות (דמויות 5b-ד), והרגו ≥2-3 יומן 10 ב ~ 10 מיקרוגרם / מ"ל ב -24 שעות (איור 5D). ניסוי דומה בדיקות quadruplicates של שליטה ברכב ו -9 ריכוזי התרופה, ועל -4 מועדים לפי שעון, יהיה מונע על ידי assay CFU מבוססי תקן. לפיכך, CARA יש תפקיד גילוי סמים כמנגנון בינוני תפוקה, מהיר לזהות פרופיל הפעילות של מולקולה. תחזיות CARA יש להעריך בקפדנות באמצעות assay CFU סטנדרטי. התוספת של פחם פעיל 0.4% צלחות פטרי לניתוח CFU עשויה לעזור לשפר קורלציה נתוני CARA, ועלולה לגרום ספירת CFU מדויקת יותר, בסדר הגודל של תיקון בדרך כלל להיות פרופורציונאלי של העצמה המתחמת 21,22. איור 1: CARA הוא כלי ניבוי גילוי סמים. בתרשים זה מסכם את השירות של CARA כקובץשלב ביניים בין הקרנת סמים (הקרנת נקודה אחת, דובדבן חיטוט, מבחני מנת תגובה) ואת זמן רב להיט-to-Lead מבחנים (מבחני CFU וזיהוי היעד). [המעובד באישור ואח זהב., סוכני מיקרוביאלית וכימותרפיה 2015 7] אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2: סכמטי של assay מרק MIC 90 ו CARA עם תוצאות צפויות. שניהם תוצאות MIC 90 ו CARA מוצגות 8 פעולות אפשריות. צבע הקידוד עבור בארות microplate 90 MIC הוא לבן (אין צמיחה) וחום (צמיחה), ועל CARA microplates הוא שחור (לא קרינה) ורוד (קרינת resorufin). נתונים הם היפותטיות. [המעובד באישור זהב et al., סוכני מיקרוביאלית וכימותרפיה 2015 7] אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3: מתמחה במונחי CARA והגדרות. ריכוז bactericidal המינימאלי של מולקולה וכתוצאה מכך רמות רקע של קרינת CARA הוא CARA-MBC ≥99 (א). בתנאים משכפלים, משמרת ≥4 פי של CARA-MBC ≥99 ימינה של MIC 90 מצביעה לעתים קרובות פעילות בקטריו והוא נקרא "חלון סטטי" (ב). עבור מולקולות עם אפקט פוסט-אנטיביוטי חזק, חלונות סטטי עלולה להיות קשה להתבונן (ג) ודורשהרחבת ציר Y (קרינת CARA) לדמיין (ד). נתונים הם היפותטיות. [המעובד באישור ואח זהב., סוכני מיקרוביאלית וכימותרפיה 2015 7] אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 4: להמחשה MIC 90 ו CARA תוצאות עבור תרכובות בחר. נתונים עבור MIC 90 (אדום) ו CARA (כחול) הם הפגינו עבור (א) איזוניאזיד (INH), (ב) linezolid, (ג) oxyphenbutazone, ו- (ד) PA-824. Wild-type מ שחפת H37Rv נחשף תרכובות עבור 7 ימים בתנאים מעתיקים רגילים או המודל רב-מתח של שכפול בלתי 7-9. 90 מבחני CARA MIC בוצעו כפי שמוצג באיור 2. [המעובד באישור ואח זהב., סוכני מיקרוביאלית וכימותרפיה 2015 7] אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 5: Dose- ופעילות תלוי זמן של ריפמפיצין. המגזר השקלי הלא צמוד פתוגניים, בצמיחה מהירה מ smegmatis נחשף ריכוז גדל והולך של ריפמפיצין בתנאים aliquots משכפלים נדגמו עבור CARA ב 1 (א), 3 (ב), 6 (ג) ו -24 (ד) hr. [המעובד באישור אל הזהב et., מיקרוביאלית סוכני כימותרפיה 2015 7].com / קבצים / ftp_upload / 54,690 / 54690fig5large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. טבלה 1: סיכום של התוצאות החזויות באיור 2. [המעובד באישור ואח זהב., סוכני מיקרוביאלית וכימותרפיה 2015 7] אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.

Discussion

CARA פותח במקור כדי להקל על צוואר בקבוק בהתקדמות שאינה שכפול או כפולות פעילות מולקולות 7. CARA משמש כשלב ביניים בין אישור ריכוז התגובה של להיטים ההקרנה הראשי מבחני CFU (איור 1). מאז צלחת CARA יחידה יכולה להחליף צלחות microtiter רבות נדרשות להכין דילולי סדרתי, ומכיל-אגרו צלחות פטרי משמשות לציון חיידקים ששרדו, CARA מספק אמצעי פשוט להעריך במהירות הפעילות של מולקולה לבדוק משתנים מרובים בו זמנית, כוללים ריכוז תרכובת וזמן החשיפה המתחם.

ב assay CFU, בנוסף דילולים סדרו כי לעתים קרובות בטווח של עד 10 6 -fold, הצלחת אגרה בדרך כלל מדללת מולקולות על ידי ~ 800 פי נוסף (10 μl על 8 מיליליטר בצלחת תלת בסגנון פטרי). Assay הקרנה דו השלבים, רב-המתח שלנו עבור חומרים פעילים על שאינו משכפל מ tuיש berculosis גורם carry-over של פי 5, כלומר, מתנה מתחמת בשלב שאינו משכפל של assay נוכחת חמישית הריכוז המקורי התולדה (משכפלים) שלב של assay 6-9. מפחית CARA לשאת על תופעות ידי בידוד מולקולות קטנות עם פחם פעיל. רוב התרופות שחפת ומועמדים קליניים להיקשר פחם פעיל במהירות ובאופן מוחלט, למעט של aminoglycoside סטרפטומיצין 7. הכללה של פחם פעיל צלחות אגרו עבור מבחני CFU מנעה עיכוב התפתחות חיידקים, או להרוג חיידקים, על ידי נשא מעל TMC207 ו PA-824 7,21,22. לפיכך, מכוח שילוב פחם פעיל אגר bacteriologic, את CARA אינה תלויה דילולים סדרתי של תאים וסוכן הבדיקה.

CARA יכול לעזור לחזות השפעה בקטריו או bactericidal של חומרים פעילים משכפלים וההשפעה bactericidal של חומרים פעילים שאינם משכפלים. בסולeneral, את CARA משמש במקביל מבחני 90 MIC סטנדרטי. כוח הניבוי של CARA מגיע מלהשוות MIC 90 ותוצאות CARA (איור 2 ולוח 1). כאשר נעשה שימוש כדי ללמוד בחומרים אנטי mycobacterial, את CARA יכול לחזות את הפעילות באופן מדויק כי הוא מעתיק bactericidal (איור 4 א), משכפלים בקטריו (איור 4 ב), שאינם משכפלים bactericidal (איור 4C), או פעיל כפול (איור 4D). CARA גם מאפשר הערכה פשוטה של ​​פעילות המתחם על פני שני מינון וזמן. מבחני CFU לבד דורשים הרבה מאמץ וחומר כדי להעריך את הפעילות של תרכובת על פני טווח רחב של מינונים וזמנים, אבל המשימה הופכת לניהול כאשר תוצאות CARA לצמצם את הטווח של תנאים אלה שבם במתחם פעיל באופן מובהק (איור 5 ).

יש בעוד CARA שירות בלימוד הפעולה שלNTI הזיהום על mycobacteria, assay יש מגבלות. CARA יש טווח דינמי צר (2-3 יומן 10), ועשוי שלא להיות מתאים התנאים שבהם אחד צופה ייתכן שלא יהיו יותר מ -2 עד 3 יומן 10 להרוג חיידקים. תחזיות CARA דורשות מחקר נוסף בשיטה מחמירה ומדויקת יותר למנות מספרי חיידקים, כגון assay CFU. ההשפעה שלאחר האנטיביוטיה של כמה זיהום אנטי, כגון PAS, יכולה לבלבל את CARA ככלי ניבוי להבחין בין תרכובות עם bactericidal ופעילות בקטריו נגד שכפול מ שחפת 7.

ישנן שתי המלצות לשיפור איכות CARA. ראשית, יש לשפוך CARA microplates במהירות לפני מתמצק אגר, תוך שמירה על דיוק נפח והימנעות מתיז מחוץ microwells. ללא קשר למספר של צלחות נדרשו, אנו ממליצים לבצע 0.5 עד 1 אצוות L של מדיום כדי לעזור לשמור על מ 'edium במצב נוזלי למשך הזמן הנדרש כדי לשפוך צלחות. שינוי עצות לעתים קרובות בעת מילוי microplates עם מדיום נמנע באמצעות טיפים סתומים חלקית. שנית, יש למזער השתנות artifactual הקרינה בין משכפל. Microcolonies mycobacterial, בפרט עבור mycobacteria פתוגניים כגון שחפת, לרוב גדלים בצורה לא סדירה. לדוגמא, microcolonies גדל על פני השטח אגר עשוי להשתנות בגודלם, בצורתם, גובה, או יכול להימשך עד הקירות הפנימיים של בארות microplate. אתגר אחד הוא לכסות את כל החיידקים באופן אחיד עם המגיב מתפתח. משוכה נוספת היא כי לאחר דגירה ממושכת על 37 מעלות צלזיוס, מדיום bacteriologic המוצק של microplates CARA עשוי להיות יבש נוטה קליט המגיב מתפתח. מאז פחם פעיל יכול להיקשר resazurin להרוות קרינה 7, ייתכנו גם ל-גם וריאציה בשל בארות יבשות סופגות את resazurin בפיתוח פתרון ואת Charcoa מופעלl מרווה resazurin קרינה. טרום להרטיב את פני השטח של כל בארות microplate CARA עם PBS מיד לפני הוספת ריאגנט פיתוח מפחית את שתי הבעיות הללו – מגיב בפיתוח יגיעו כל מושבות mycobacterial באותה מידה, ואת resazurin נשאר בבטחה מעל פחם פעיל. CARA עשויים להיות יישומים לזיהוי ואפיון פנוטיפים של מוטציות mycobacterial, או מבחני גילוי תרופות בינוני תפוקה עבור מינים של חיידקים אחרים.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים קריסטין ברנס-הואנג לבדיקה מומחה של כתב היד J. David Warren (Weill Cornell Medical College) לסיוע כימיה תוך פיתוח CARA. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית Accelerator והתרופות TB של ביל ומלינדה גייטס, את אבי ואת הווארד פ מילשטיין תוכנית ברפואה Translational, וכן יחידת המחקר NIH TB (U19 AI111143). המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה נתמכת על ידי קרן הרסט ויליאם רנדולף. SSK נתמכה על ידי K08AI108799 מענק NIH.

Materials

Middlebrook 7H9 Beckton Dickinson 271310
Middlebrook 7H11 Beckton Dickinson 298810
Middlebrook OADC Beckton Dickinson 212351
BSA, heat shock Roche 3118958001
activated charcoal Sigma C5510
PBS, Dulbecco's Ca2+ and Mg2+ free Life Technologies / Invitrogen 14190-144
tween 80 Sigma P8074
tyloxapol Sigma T8761
sodium nitrite Sigma 2252
rifampicin Sigma R3501
6-bromo-1H-indazol-3-amine Alfa Aesar H34095
potassium phosphate monobasic   Sigma P0662
magnesium sulfate, heptahydrate  Sigma M1880
ferric ammonium citrate  Sigma F5879
zinc sulfate, heptahydrate Sigma Z0251
ammonium chloride  Sigma A9434
butyric acid, liquid Sigma B103500
resazurin powder Sigma R7017
sodium chloride  J.T. Baker 4058-01 
prepared resazurin solution  Invitrogen DAL1100
PCR stickers Denville B1212-5
spectrophotometer Molecular Devices M5
96-well, tissue culture treated microplates Corning 3595
reagent reservoirs VWR  89094-678
resealable plastic bags VWR  395-94602
14 mL Polypropylene round-bottom tubes Corning  352059
50 mL conical centrifuge tube Corning 352070
75 cm2 Cell culture flask Corning 431464U
clear, flat bottom tissue culture treated 96-well microplate Costar 3595
Prism 6 for OS X GraphPad http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nathan, C. Fresh approaches to anti-infective therapies. Sci. Transl. Medicine. 4 (140), 140-142 (2012).
  2. Gomez, J. E., McKinney, J. D. M. tuberculosis persistence, latency, and drug tolerance. Tuberculosis (Edinb). 84, 29-44 (2004).
  3. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
  4. Bigger, J. Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation. Lancet. , 497-500 (1944).
  5. Bryk, R., et al. Selective killing of nonreplicating mycobacteria. Cell Host Microbe. 3, 137-145 (2008).
  6. Gold, B., et al. Nonsteroidal anti-inflammatory drug sensitizes Mycobacterium tuberculosis to endogenous and exogenous antimicrobials. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 16004-16011 (2012).
  7. Gold, B., et al. Rapid, semi-quantitative assay to discriminate among compounds with activity against replicating or non-replicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 59, 6521-6538 (2015).
  8. Gold, B., Warrier, T., Nathan, C., Parish, T., Roberts, D. . Mycobacteria Protocols, Methods in Molecular Biology. 1285, 293-315 (2015).
  9. Warrier, T., et al. Identification of Novel Anti-mycobacterial Compounds by Screening a Pharmaceutical Small-Molecule Library against Nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Infect. Dis. , 580-585 (2015).
  10. Zheng, P., Chem, J. .. M. e. d. .., et al. Synthetic Calanolides with Bactericidal Activity Against Replicating and Nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Chem. , (2014).
  11. Darby, C. M., et al. Whole cell screen for inhibitors of pH homeostasis in Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 8, e68942 (2013).
  12. Darby, C. M., Nathan, C. F. Killing of non-replicating Mycobacterium tuberculosis by 8-hydroxyquinoline. J. Antimicrob. Chemother. 65, 1424-1427 (2010).
  13. de Carvalho, L. P., Darby, C. M., Rhee, K., Nathan, C. Nitazoxanide Disrupts Membrane Potential and Intrabacterial pH Homeostasis of Mycobacterium tuberculosis. ACS Med. Chem. Lett. 2, 849-854 (2011).
  14. Xie, Z., Siddiqi, N., Rubin, E. J. Differential antibiotic susceptibilities of starved Mycobacterium tuberculosis isolates. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4778-4780 (2005).
  15. Grant, S. S., et al. Identification of novel inhibitors of nonreplicating Mycobacterium tuberculosis using a carbon starvation model. ACS Chem. Biol. 8, 2224-2234 (2013).
  16. Zhang, M., et al. Streptomycin-starved Mycobacterium tuberculosis 18b, a drug discovery tool for latent tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 56, 5782-5789 (2012).
  17. Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem. Biol. 7, 1190-1197 (2012).
  18. Cho, S. H., et al. Low-oxygen-recovery assay for high-throughput screening of compounds against nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 51, 1380-1385 (2007).
  19. Franzblau, S. G., et al. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 92, 453-488 (2012).
  20. Rebollo-Lopez, M. J., et al. Release of 50 new, drug-like compounds and their computational target predictions for open source anti-tubercular drug discovery. PLoS One. 10, e0142293 (2015).
  21. Tasneen, R., et al. Contribution of the nitroimidazoles PA-824 and TBA-354 to the activity of novel regimens in murine models of tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 59, 129-135 (2015).
  22. Grosset, J. H., et al. Assessment of clofazimine activity in a second-line regimen for tuberculosis in mice. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 188, 608-612 (2013).
  23. Shiloh, M. U., Ruan, J., Nathan, C. Evaluation of bacterial survival and phagocyte function with a fluorescence-based microplate assay. Infect. Immun. 65, 3193-3198 (1997).
  24. Wang, F., et al. Identification of a small molecule with activity against drug-resistant and persistent tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E2510-E2517 (2013).
  25. Wayne, L. G., Hayes, L. G. An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence. Infect. Immun. 64, 2062-2069 (1996).
  26. Barry, A. L., et al. . Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents: approved guideline. 19, (1999).

Tags

Charcoal Agar Resazurin AssaySemi-quantitativeMedium-throughputMycobacteria EnumerationTuberculosis Drug DiscoveryM. SmegmatisReplicating And Non-replicating Bacteria7H11 AgarOADC Supplement96-well Microplate

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gold, B., Roberts, J., Ling, Y., Lopez Quezada, L., Glasheen, J., Ballinger, E., Somersan-Karakaya, S., Warrier, T., Nathan, C. Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria. J. Vis. Exp. (118), e54690, doi:10.3791/54690 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image