Visualisatie van de Charcoal Agar Resazurin Assay voor Semi-kwantitatieve, Medium-throughput bepalen van het aantal mycobacteriën

1. Bereiding van CARA Microplaten Autoclaaf 900 ml Middlebrook 7H11 agar die 0,2% glycerol en 0,4% geactiveerde koolstof in een 2 L Erlenmeyer kolf, of als alternatief 450 ml in een 1 L glazen beker. Omvatten een groot autoclaveerbaar roerstaafje in de kolf of beker. Dek de opening van de kolf of bekerglas af met aluminiumfolie en hechten aan glas met autoclaaf tape. Koel om (ongeveer 55-65 ° C) te raken op een magnetische roer plaat ingesteld op een lage snelheid naar de houtskool in suspensie te houden. Voer alle volgende stappen aseptisch in een bioveiligheid kap die een magnetische roer plaat. Verwijder folie. Voeg 100 ml OADC supplement (OADC supplement, bij gebruik bij 10%, opbrengst uiteindelijke media concentraties van 0,2% dextrose, 0,5% albumine, 0,085% NaCl, 0,0005% oliezuur en 0,4 mg / ml catalase) aan de 2 L Erlenmeyer of 50 ml OADC de 1 L beker en meng. Bij gebruik van een erlenmeyer, giet ongeveer 25-40 ml 7H11-OADC-houtskool in een steriele reagensreservoir. Bij gebruik van de beker, is het niet noodzakelijk een reagensreservoir gebruiken. Vul een 96-well microplaat met 200 gl / putje 7H11-OADC-houtskool uit het reagensreservoir of beker. Werk snel om agar stollen en de introductie van luchtbellen te vermijden. Vermijd spatten vast medium buiten de putjes, als een bron van schimmel besmetting kan worden. Met behulp van een multichannel pipet, gebruikt u een set van 12 filter tips voor de overdracht van 7H11-OADC houtskool om de 8 rijen (AH) van de 96-well plaat. OPMERKING: Het medium stolt snel. Om te voorkomen dat verstopping pipetpunten, veranderen ze regelmatig. Als alternatief, giet CARA microplaten met behulp van een P1000 elektronische multichannel pipet met filter tips om te helpen bij de voorbereiding van een groot aantal platen. LET OP: Door de geringe omvang van microplaat putten, de agar in CARA microplaten stolt binnen enkele minuten van het gieten. Plaats stapels CARA microplaten in hersluitbare plastic bags om te voorkomen dat uitdrogen. WINKEL CARA microplaten bij 4 ° C. 2. instellen repliceren en niet-replicating MIC 90 Testen Inoculeer M. tuberculosis, M. bovis BCG of M. smegmatis op een OD 580 van 0,01-0,1 en uit te breiden tot mid-log-fase (OD 580 ~ 0.5) in Middlebrook 7H9-ADN (Middlebrook 7H9 dat 0,2% glycerol, 0,2% dextrose , 0,5% albumine en 0,085% NaCl) of 7H9-OADC (Middlebrook 7H9 dat 0,2% glycerol en 10% OADC supplement). Grow M. tuberculosis en M. bovis BCG als ~ 20 ml staande culturen in celkweek flessen en M. smegmatis schudden in polypropyleen met ronde bodem (4 ml kweek) of 50 ml conische centrifugebuizen (10-20 ml cultuur). Incubeer pathogène mycobacteriën bij 37 ° C met 20% O2 en 5% CO2, en M. smegmatis bij 37 ° C met 20% O2. Het opzetten van een minimale-remmendeconcentratie (MIC 90) -achtige experiment onder replicerende en niet-replicerende omstandigheden (figuur 2). OPMERKING: Testmiddelen worden gewoonlijk getest in duplo of viervoud proeven 4 of 2 verbindingen respectievelijk per 96-well microplaat mogelijk. Bijvoorbeeld, in een 96-well plaat, een testagens kan worden getest in rijen AD en andere in rijen EH. De DMSO (vehikel) in de kolommen 1, 2 en 12, en het testmiddel verdunningsreeks loopt van kolom 3 (laagste concentratie) naar kolom 11 (hoogste concentratie). MIC 90 -achtige assays gebruiken typisch 2-voudige verdunningsreeks. Er zijn tal van non-replicating modellen beschikbaar voor mycobacteriën 14-16,18,24,25 en ter illustratie, maken we gebruik van een multi-stress-model van niet-replicatie 6,8,9. Voor replicating assay distribueren 200 ul cellen in 7H9-ADN bij een OD 580 van 0,01 in ieder putje van een heldere bodem, met weefselkweek behandelde plaat met 96 putjes. <li> Voor de niet-replicerende assay, was de cellen tweemaal in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende 0,02% tyloxapol en resuspendeer cellen in niet-replicerende medium (0,05% KH 2PO 4, 0,05% MgSO 4, 0,005% ferri-ammoniumcitraat , 0,0001% ZnCl2, 0,1% NH4Cl, 0,5% BSA, 0,085% NaCl, 0,02% tyloxapol, 0,05% butyraat, pH ingesteld op 5,0 met 2 N NaOH). Verdun cellen tot een OD 580 van 0,1 in niet-replicerende medium en NaNO 2 uit een vers bereide 1 M voorraadoplossing toe tot een eindconcentratie van 0,5 mM. Verdeel 200 ul cellen in een OD 580 van 0,1 in ieder putje van een heldere bodem, met weefselkweek behandelde plaat met 96 putjes. LET OP: Maak verbinding verdunningen als 100-voudige stockoplossingen in DMSO. Dus een typisch MIC plaat testen van het effect van een molecuul op een eindconcentratie 0,4-100 ug / ml zou voorraadoplossingen van 0,04-10 mg / ml in DMSO vereisen. Voeg 2 pl disingen van testmiddel 1 in rijen AE en 2 pl verdunningen van testmiddel 2 in rijen EH. Meng grondig. Voeg 2 ul mediumcontrole (gewoonlijk DMSO) in controleputjes, kolommen 1, 2, 12 (rijen AH). Meng grondig. Voor elk experiment werden ten minste één positieve controle zoals rifampicine 0,004-1 ug / ml (replicerend assay) en / of 0,08-20 ug / ml (niet-replicerende assay). Opmerking: Het gebruik van 6-broom-1H-indazool-3-amine 9 0,1 tot 25 ug / ml wordt aanbevolen als een controle verbinding, die selectief is, NaNO 2 afhankelijke activiteit in de meervoudige stress-model van niet-replicatie. Voor het repliceren assays, incubeer microtiterplaten bij 37 ° C bij 20% O2 en 5% CO2 gedurende 7 dagen (M. tuberculosis en M. bovis BCG) of 1-48 uur (M. smegmatis). Voor de meervoudige stress-model van niet-replicatie, incubeer microplaten gedurende 7 dagen bij 37 ° C bij 1% O2 en 5% CO2 (<em> M. tuberculose en M. bovis BCG). 3. Enten van CARA Microplaten Op tijdstippen waarop het CARA worden gebruikt als uitlezing zorgvuldig mengen en de inhoud van de MIC 90 -achtige testplaat met een p200 multichannel pipet bedraagt 50-75 pl. Pipet op en neer ten minste 5-10 keer en voorzichtig wervelen de put inhoud in een cirkelvormige beweging met behulp van de pipet tips. Breng 10 pl bepalingsbuffer goed inhoud naar de CARA microplaat. Zorg ervoor dat de volgorde van de put inhoud van de assay plaat overeenkomt met de volgorde van de put inhoud van het CARA microplaat. Vermijd spatten tijdens de transfers en zorg ervoor dat de 10 ul worden gespot in het midden van de CARA microplaat putten. Bevestig de 10 ul absorbeert in de CARA microplaat. LET OP: Er zijn geen verdunningen vereist voor het spotten van cellen op het CARA microplaten. Bind stapels CARA microplaten met plaat en tapeplaats dan in een hersluitbare plastic zak. Incubeer CARA microplaten bij 37 ° C met 20% O 2 (M. smegmatis) of 1% O2 en 5% CO 2 (M. tuberculosis en M. bovis BCG). Voor M. tuberculosis en M. bovis BCG, repliceren assays: incubeer gedurende 7 dagen; voor M. tuberculosis en M. bovis BCG non-replicating assays, incubeer gedurende 10 dagen; M. smegmatis, repliceren assays, incubeer gedurende 1-2 dagen; M. smegmatis, niet-replicerend assays Incubeer 2-3 dagen. LET OP: De tijden zijn schattingen en kunnen dienovereenkomstig worden aangepast voor verschillende repliceren, non-replicating, en stress omstandigheden. 4. Ontwikkeling CARA Microplaten Ontwikkel de CARA microplaten wanneer een film van de groei van bacteriën, of groter, macroscopische kolonies, zijn zichtbaar op de negatieve (voertuig) controleputjes. NB: Na langdurig incubatie, CARA microplaat putten vaaklijken droog en we raden pre-wetting goed inhoud met steriele PBS. Hiermee wordt voorkomen dat de houtskool uit absorberende Resazurin, wat kan leiden tot lage fluorescentie of well-to-well variatie. Met behulp van een enkele set van 12 p200 tips met een multichannel pipet, afzien van 40 pi steriel PBS langs de kant van de putten en laat de PBS te verdelen over de bovenkant van de agar / bacteriële microkolonies. Bereid CARA ontwikkelen reagens door 5 mg resazurine (0,01% eind) en 50 ml 5% Tween80 in PBS. Vortex en steriel filter. Opmerking: Een alternatieve CARA ontwikkelen reagens kan worden bereid door commercieel bereid resazurin vloeibare oplossing in 1: 1 (vol / vol) met 10% Tween80 in PBS. Voeg 50 ul van vers bereide CARA ontwikkelen reagens aan elk putje van de microplaat CARA behulp van een 12-kanaals pipet. Rock platen heen en weer een paar keer om te helpen verspreiden reagens over de agar en bacteriële mat in elk putje. Leg de platen ina hersluitbare plastic zak en incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 30 min voor M. smegmatis en 45-60 min voor M. tuberculosis of M. bovis BCG. Opmerking: Als het voertuig controle putjes niet aan rood wordt binnen het eerste uur, de platen kunnen opnieuw worden verpakt en gedurende langere tijdsperioden. Vóór lezen fluorescentie plaatst CARA microplaten in een bio kap voor 15 min bij kamertemperatuur met de deksels verwijderd. Bij het gebruik van BSL3 spectrofotometers buiten een bioveiligheid kast, houden een optische kwaliteit PCR sticker over de plaat en sluit strak door zachtjes te drukken op de sticker met een zachte papieren handdoek. Bepaal fluorescentie via top gelezen met excitatie bij 530 nm en emissie bij 590 nm. Het is niet nodig om lege de plaat. 5. Data Analysis Plot remmerconcentratie op de X-as op een log schaal 10 en fluorescentie op de Y-as op een lineaire schaal. Gebruik een scatterplot waarbij een curve fit zoals "log remmer versus respons-variabele helling (4 parameters)". Plot datapunten als gemiddelden ± standaard fout.