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Immunology and Infection

Visualisation de l'Agar Charcoal résazurine Essai pour semi-quantitative, Moyen-débit Enumération des mycobactéries

Published: December 14, 2016
doi:
10.3791/54690
, , , , , , , ,
1Departments of Microbiology & Immunology,Weill Cornell Medical College, 2Medicine,Weill Cornell Medical College

Summary

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

Abstract

Il y a un besoin urgent de découvrir et progresser anti-infectieux qui raccourcissent la durée de la tuberculose (TB). Mycobacterium tuberculosis, l'agent étiologique de la tuberculose, est réfractaire à une chimiothérapie rapide et durable du fait de la présence de bacilles présentant une résistance médicamenteuse phénotypique. Le c harcoal un gar r esazurin un éssayé (CARA) a été développé comme un outil pour caractériser les molécules actives découvertes par des campagnes de criblage à haut débit contre la reproduction et non réplicatif M. tuberculosis. Inclusion de charbon actif en milieu agar bactériologique contribue à atténuer l'impact du composé de report, et élimine l'obligation de cellules avant de repérer sur CARA microplaques pré-dilué. Après une période d'incubation de 7-10 jours à 37 ° C, la réduction de la résazurine par les microcolonies mycobactéries à croissance sur la surface de CARA microplaque semi-quantitative permet assessment du nombre de bactéries par fluorométrie. Le CARA détecte environ un 2-3 log 10 différence dans le nombre de bactéries et prédit une concentration minimale bactéricide conduisant à ≥99% kill bactérienne (MBC ≥99). Cara permet de déterminer si une molécule active sur les bacilles qui répliquent, ne se répliquant pas, ou les deux. Des expériences pilotes utilisant le CARA facilitent l'identification qui concentration de l'agent et le temps d'exposition composé essai nécessite une évaluation plus poussée par unités formant des colonies (UFC) des essais. En outre, le CARA peut prédire si actifs répliquant sont bactéricide ou bactériostatique.

Introduction

Mycobacterium tuberculosis, l'agent étiologique de la tuberculose, peut survivre dans un hôte dans un état latent qui est réfractaire à l' éradication des antibiotiques. Phénotypique résistance (non génétique) de M. tuberculosis au cours de l' infection est considérée comme étant due, en partie, aux populations de bacilles non répliquants 1,2. Persisters de classe I présentant une résistance aux médicaments phénotypique se posent à travers des mécanismes stochastiques rares parmi les grandes populations de cellules sensibles à la drogue 3,4. persisters de classe II sont rendus non répliquant par des facteurs de l'immunité de l'hôte, y compris les contraintes externes microenvironnements rencontrées au cours de l'infection. Nous avons récemment développé un modèle in vitro de classe II non répliquant la persistance de reproduire les conditions rencontrées par M. tuberculosis dans les macrophages et les granulomes activés. Le modèle multi-stress de la classe II comprend la persistance des conditions que la croissance lente, comme une source de carbone d'acide gras, et complètement halla croissance du t, comme légère acidité (pH 5,0), hypoxie (1% de O 2) et de l' oxyde nitrique et d' autres produits intermédiaires azotés réactifs 5-9. Criblage à grande échelle utilisant ce modèle multi-stress de la non-réplication, et d' autres modèles de classe II non-répliquant, a donné diverses molécules dont l' activité est dirigée contre l'état non-réplication 5-7,9-18. Les mêmes écrans non répliquants ont également révélé une catégorie de molécules qui possèdent une activité contre les bacilles à la fois répliquer et non-répliquant, appelées «doubles actifs» 7,10,12,19,20.

Antibactérienne découverte de médicaments dans la phase hit-to-lead implique une caractérisation des molécules candidates de choisir des pistes pour l' expansion de succès, la caractérisation pharmacologique préliminaire, l' identification des cibles et des études d'efficacité in vivo préliminaires. Comme une première étape, les anti-infectieux sont classés par leur mécanisme bactériostatique ou bactéricide de l'action et, si bactéricide, wkill bactérienne u'il est temps et / ou de la concentration-dépendante. Le test de formation de colonies unité (CFU) est la méthode standard classique, l'or pour répondre à ces questions. Dans l'essai de CFU, les bactéries sont exposées à un agent de test, après quoi des parties aliquotes sont enlevées, dilués en série, et des aliquotes de dilutions sont étalées sur un milieu solide bactériologie et incubées pour permettre la croissance des cellules survivantes. Enfin, les colonies bactériennes sont énumérées. Le dosage de CFU exige un grand nombre de plaques de microtitrage pour diluer les cellules et de Petri contenant des plaques d'agar-agar à énumérer les colonies survivantes. Le dosage CFU pour lent mycobactéries à croissance est entravée par leur temps lent de génération (18-24 h), ce qui nécessite environ 3 semaines pour les colonies apparaissent sur des plaques. De plus, l'espace de l'incubateur est souvent limitée spécialisés biosécurité de niveau 3 installations.

Bien que lourde, des tests de CFU sont l'étalon-or pour caractériser l'impact des molécules non-répliquant et double-actifs sur mycobacteria. Essais non-répliquants sont soumis à des taux élevé de faux positifs que de nombreux sont couplés à la réplication des tests pour évaluer la viabilité cellulaire 6-8. Par exemple, un composé qui a une activité puissante contre la réplication M. tuberculosis (une «réplication active») peut échouer à tuer pendant le test non-réplication, mais peut encore tuer en vertu de report de la phase non-réplication du essai pour la phase de récupération de l'essai, qui est effectuée dans des conditions qui favorisent la replication ( «conditions répliquant»). Composé report complique encore l'analyse de molécules actives double, ce qui rend difficile de distinguer si l'activité a été reproduit, non répliquant, ou double.

Pour résoudre les problèmes décrits ci – dessus, nous avons développé le c harcoal un gar r esazurin un éssayé (CARA) pour le dénombrement rapide, semi-quantitative des espèces de mycobactéries telles que M. tuberculosis, M. bovis BCG et M. smegmatis 7 (figures 1 et 2). Dans des solutions tampons in vitro, le charbon activé séquestrant rapidement la plupart des médicaments classiques utilisés pour traiter la tuberculose 7. Le charbon actif en CARA microplaques lie les composés qui peuvent porter sur d'une microplaque de dosage, et cette caractéristique de la CARA élimine l'exigence de diluer en série le contenu test de puits avant le recensement 7,21,22. Le nombre de microcolonies mycobactériennes sur la surface d' agar de CARA microplaques est estimée par l'ajout de résazurine, un colorant bleu, dont la forme réduite, résorufine, est une molécule rose dont la fluorescence est mesurée par un spectrophotométrie 23. CARA microplaques sont incubées pendant 1-2 jours pour M. smegmatis et de 7-10 jours pour les mycobactéries à croissance lente telles que M. tuberculosis et M. bovis BCG. Le CARA a une plage dynamique étroite de ~ 2-3 log 10 difference en UFC. Quand il est utilisé au lieu d'un dosage de CFU, une seule microplaque CARA remplace environ cinq plaques à 96 puits utilisées pour des dilutions en série et des plaques de gélose 120 tri-style utilisé pour le placage. Interprétation des données CARA permet de guider les études ultérieures en déterminant les temps et les concentrations de composés d'incubation à tester dans des essais à base de CFU plus laborieux.

Protocol

1. Préparation de CARA microplaques Autoclaves 900 ml de gélose Middlebrook 7H11 contenant 0,2% de glycerol et 0,4% de charbon activé dans un erlenmeyer de 2 L, ou en variante, à 450 ml dans un bécher de 1 litre en verre. Inclure une grande barre d'agitation autoclavable dans le ballon ou bécher. Couvrir l'ouverture du flacon ou bêcher avec une feuille d'aluminium et attacher le verre avec du ruban autoclave. Refroidir à toucher (environ 55-65 ° C) sur une plaque d'agitation magnétique réglé à une vitesse faible pour maintenir le charbon de bois en suspension. Effectuez toutes les étapes ultérieures de manière aseptique dans une hotte de biosécurité qui a une plaque d'agitation magnétique. Retirer la feuille. Ajouter 100 ml de supplément de OADC (supplément OADC, lorsqu'il est utilisé à 10%, les rendements des concentrations de médias finale de 0,2% de glucose, 0,5% d'albumine, 0,085% de NaCl, l'acide oléique 0,0005% et 0,4 mg / ml de catalase) dans le flacon de 2 L d'Erlenmeyer , ou 50 ml OADC le bécher de 1 l, et continuer à mélanger. Si vous utilisez un flacon Erlenmeyer, verser environ 25-40 ml de 7H11-OADC charbon dans un réservoir de réactif stérile. Si l'on utilise le gobelet, il est nécessaire d'utiliser un réservoir de réactif. Remplir une microplaque à 96 puits avec 200 ul / puits de 7H11-OADC charbon depuis le réservoir de réactif ou bécher. Travaillez rapidement pour éviter la solidification de la gélose et l'introduction de bulles. Évitez les éclaboussures milieu solide en dehors des puits, comme cela peut être une source de contamination fongique. En utilisant une pipette multicanaux, utiliser un ensemble de 12 conseils de filtre pour le transfert de 7H11-OADC charbon aux 8 lignes (AH) de la plaque de 96 puits. NOTE: Le milieu se solidifie rapidement. Pour éviter le colmatage des embouts de pipette, changer fréquemment. Sinon, versez CARA microplaques en utilisant une pipette multicanaux électronique p1000 avec des pointes de filtre pour aider à préparer de nombreuses plaques. NOTE: En raison du faible volume de puits de microplaques, l'agar-agar dans CARA microplaques se solidifie en quelques minutes de coulée. La place des piles de CARA microplaques en ba en plastique refermablesgs pour éviter le dessèchement. Magasin CARA microplaques à 4 ° C. 2. Configuration Réplication et MIC non réplicatif 90 Assays Inoculer M. tuberculosis, M. bovis BCG ou M. smegmatis à une DO 580 de 0,01-0,1 et d' étendre à la phase mi-log (DO 580 ~ 0,5) dans Middlebrook 7H9-ADN (Middlebrook 7H9 contenant 0,2% de glycérol, 0,2% de dextrose , 0,5% d'albumine et 0,085% de NaCl) ou 7H9-OADC (Middlebrook 7H9 contenant 0,2% de glycerol et un supplément OADC 10%). Cultiver M. tuberculosis et M. bovis BCG ~ 20 ml de cultures permanentes dans des flacons de culture cellulaire et de M. smegmatis avec agitation en polypropylène à fond rond (culture 4 ml) ou de 50 ml des tubes de centrifugation coniques (10 à 20 ml de culture). Incuber mycobactéries pathogènes à 37 ° C avec 20% O 2 et 5% de CO 2, et M. smegmatis à 37 ° C avec 20% de O 2. Mettre en place un minimum inhibitriceconcentration (CMI 90) d'expérimentation de style sous répliquant et ne se répliquant pas les conditions (figure 2). NOTE: Les agents de test sont généralement testés en double ou quatre exemplaires pour permettre les essais 4, ou 2 composés, respectivement, par 96 puits microplaque. Par exemple, dans une plaque de 96 puits, un agent de test peut être dosé en rangées AD et un autre en rangées EH. DMSO (véhicule) se trouve dans les colonnes 1, 2 et 12, et la série de dilutions de l'agent de test se déroule de la colonne 3 (concentration la plus faible) à la colonne 11 (concentration la plus élevée). MIC 90 essais -style emploient généralement une série de dilutions de 2 fois. Il existe de nombreux modèles non-réplication disponibles pour mycobactéries 14-16,18,24,25 et à titre d' illustration, nous utilisons un modèle multi-stress de la non-réplication 6,8,9. Pour le test de réplication, distribuer 200 cellules ul dans 7H9-ADN à une DO 580 de 0,01 dans tous les puits d'une plaque de 96 puits à fond transparent, la culture de tissus traités. <li> Pour le dosage ne se répliquant pas , laver les cellules deux fois dans du tampon phosphate salin (PBS) contenant 0,02% tyloxapol, et remettre les cellules dans un milieu non répliquant (0,05% KH 2 PO 4, 0,05% de MgSO4, 0,005% de citrate de fer ammoniacal 0,0001% de ZnCl 2, 0,1% de NH4CI, 0,5% de BSA, 0,085% de NaCl, 0,02% tyloxapol, 0,05% de butyrate; pH ajusté à 5,0 avec du NaOH 2 N). Diluer les cellules à une DO 580 de 0,1 dans un milieu non-réplication et ajoutez NaNO 2 à partir d' un fraîchement préparé 1 M stocks à une concentration finale de 0,5 mM. Distribuer 200 cellules pi à une DO 580 de 0,1 dans tous les puits d'une plaque de 96 puits à fond transparent, la culture de tissus traités. NOTE: Préparer des dilutions de composés sous forme de solutions d'achat d'actions 100 fois dans le DMSO. Ainsi, une plaque MIC typique de tester l'impact d'une molécule à une concentration finale 0,4 à 100 pg / ml, il faudrait des solutions mères de 0,04 à 10 mg / ml dans le DMSO. Ajouter 2 pi de dilutions d'agent d'essai 1 dans les lignes AE et 2 pi de dilutions d'agent d'essai 2 dans les lignes EH. Bien mélanger. Ajouter 2 ul contrôle du véhicule (généralement DMSO) dans les puits de contrôle, les colonnes 1, 2, 12 (lignes AH). Bien mélanger. Pour chaque expérience, comprennent au moins un témoin positif tel que la rifampicine de 0,004 à 1 pg / ml (essai reproduisant) et / ou de 0,08 à 20 pg / ml (titrage ne se répliquant pas). NOTE: L'utilisation de la 6-bromo-1H-indazol-3-amine , 9 à 0,1 et 25 ug / ml est recommandée en tant que composé témoin qui a sélectif, NaNO2 activité dépendante du modèle à plusieurs contraintes de non-réplication. Pour la réplication des essais, incuber les microplaques à 37 ° C , à 20% de O 2 et 5% de CO 2 pendant 7 jours (M. tuberculosis et M. bovis BCG) ou de 1 à 48 h (M.smegmatis). Pour le modèle à plusieurs contraintes de non-réplication, laisser incuber microplaques pendant 7 jours à 37 ° C , à 1% de O 2 et 5% de CO 2 (<em> M. tuberculosis et M. bovis BCG). 3. Ensemencement de CARA microplaques Aux points de temps dans lequel le CARA sera utilisé comme-out lire, attentivement resuspendre bien le contenu de la plaque d'essai de style MIC 90 à l' aide d' une pipette multicanaux p200 fixé à 50-75 ul. Pipette haut et bas au moins 5-10 fois et agiter doucement le contenu du puits dans un mouvement circulaire en utilisant les embouts de pipette. Transfert 10 pl de contenu test de puits à la microplaque de CARA. Assurez-vous que l'ordre des contenus des puits sur la plaque d'essai correspond à l'ordre du contenu des puits de la microplaque de CARA. Éviter les éclaboussures lors des transferts et assurez-vous que les 10 ul sont repérés dans le milieu des puits de microplaques CARA. Confirmez les 10 pi absorbe dans la microplaque de CARA. NOTE: Il n'y a pas dilutions nécessaires avant repérer les cellules sur le CARA microplaques. piles Bind de CARA microplaques avec du ruban adhésif de la plaque etplacer dans un sac en plastique refermable. Laisser incuber CARA microplaques à 37 ° C avec 20% de O 2 (M. smegmatis) , soit 1% de O 2 et 5% de CO 2 (M. tuberculosis et M. bovis BCG). Pour M. tuberculosis et M. bovis BCG, reproduisant les essais: laisser incuber pendant 7 jours; pour M. tuberculosis et M. bovis BCG non répliquant essais, incuber pendant 10 jours; pour M. smegmatis, reproduisant des essais, incuber pendant 1-2 jours; pour M. smegmatis, des essais non-répliquant, incuber 2-3 jours. NOTE: Les temps sont des estimations et peuvent être modifiées en conséquence pour répliquer différents, non répliquant, et des conditions de stress. 4. Développer CARA microplaques Développer le CARA microplaques quand un film de la croissance bactérienne, ou plus, des colonies macroscopiques, sont visibles sur les puits négatifs (véhicule) de contrôle. NOTE: Après une incubation prolongée, CARA puits de microplaques souventapparaissons sec et nous recommandons mouillants pré-contenu des puits avec du PBS stérile. Cela sert à empêcher le charbon d'absorber résazurine, ce qui peut conduire à une faible fluorescence ou variation-puits à puits. L'utilisation d'un ensemble unique de 12 p200 conseils avec une pipette multicanaux, distribuer 40 ul de PBS stérile le long du côté des puits et permettre à la PBS pour distribuer à travers le sommet des microcolonies agar / bactériennes. Préparer CARA réactif de développement en mélangeant 5 mg de résazurine (0,01% final) et 50 ml de 5% de Tween80 dans du PBS. Tourbillonnaire et d'un filtre stérile. Remarque: Une alternative CARA réactif de développement peut être préparé en mélangeant une solution préparée commercialement résazurine liquide à 1: 1 (vol / vol) avec 10% de Tween 80 dans du PBS. Ajouter 50 ul de réactif fraîchement préparé CARA développant à chaque puits de la microplaque CARA en utilisant une pipette à 12 canaux. plaques rocheuses en arrière à quelques reprises pour aider à distribuer le réactif sur le tapis agar et bactérienne dans chaque puits. Placez les plaques ina sac refermable en plastique et incuber à 37 ° C pendant au moins 30 min pour M. smegmatis et 45-60 min pour M. tuberculosis ou M. bovis BCG. NOTE: Si les puits de contrôle du véhicule ne parviennent pas à virer au rose dans la première heure, les plaques peuvent être ré-emballés et incubées pendant des périodes plus longues. Avant de lire la fluorescence, placez CARA microplaques dans une hotte de biosécurité pendant 15 min à température ambiante avec leurs couvercles enlevés. Lors de l'utilisation de spectrophotomètres BSL3 en dehors d'une enceinte de sécurité biologique, respecter un autocollant optique de PCR de qualité sur la plaque et sceller hermétiquement en appuyant doucement sur la surface de l'autocollant avec une serviette en papier doux. Déterminer la fluorescence par le haut lu avec une excitation à 530 nm et émission à 590 nm. Il ne faut pas la plaque vierge. Analyse 5. Données Parcelle concentration d'inhibiteur sur l'axe X sur une échelle log 10 et de la fluorescence sur l'axe des ordonnées une échelle linéaire. Utilisez un scatterterrain utilisant un ajustement de courbe comme «log inhibiteur en fonction pente de réponse variable (4 paramètres)». points de données du terrain comme moyen ± erreur standard.

Representative Results

Les résultats de CARA prévus sont décrits dans la figure 2 et résumés dans le tableau 1. Pour la réplication des cellules, la CARA est exécuté en parallèle à une norme MIC 90 dosages et pour des essais non répliquants, CARA est exécuté en parallèle avec un dosage adapté MIC 90 qui est couplé à une phase excroissance. La concentration de l' agent de test qui se traduit par l' échec de CARA-fluorescence à élever au- dessus des niveaux de fond est le CARA-MBC ≥99 (Figure 3a). Le "≥99" indice indique que le CARA-MBC fournit une concentration estimée de l' agent de test qui donne lieu à ≥2 log 10 kill bactérienne (≥99% kill). Le liquide bouillon MIC 90 dosage est incapable de distinguer entre activité bactéricide et bactériostatique et cette distinction doit être résolue par un dosage CFU. Parconvention, le seuil qui distingue bactéricide de l' activité bactériostatique pour les mycobactéries à croissance lente est d' environ 2-3 log 10 kill sur 7 jours 7,26. Étant donné que la plage dynamique de la CARA est également 2-3 log 10 kill, le CARA peut fournir une estimation de l' activité bactéricide ou bactériostatique. Le CARA identifie facilement certains actifs répliquant que bactériostatique en raison de l' échec de ces composés pour diminuer CARA fluorescence à des niveaux de fond (Figure 2). Cependant, certains composés ayant une activité bactériostatique contre la réplication M. tuberculosis ont un effet post-antibiotique puissant, ce qui signifie qu'ils continuent à inhiber la repousse des bactéries pendant la phase de récupération , même en l'absence de composé report. Cet effet peut être difficile à reconnaître dans l'essai de CARA. Les composés sont soupçonnés d'exercer un effet post-antibiotique si elles affichent une «fenêtre statique», définie comme un changement> 4 fois vers la droite between les courbes MIC et CARA (Figure 3b). La fenêtre statique indique qu'une molécule active contre la réplication M. tuberculosis peut être bactériostatique au lieu de bactéricide. Dans certains cas, les fenêtres statiques sont visibles seulement après inspection d'un axe Y expansé pour CARA fluorescence (Figure 3c et 3d). Données CARA et MIC 90 sont habituellement tracées ensemble (Figure 4). Les données représentatives pour les molécules replicating- et non répliquant-actifs testés par MIC 90 et CARA sont représentés sur la figure 4. Il y a 4 grandes classes d'activité pour les molécules: 1) la réplication bactéricide (démontré par l' isoniazide, la figure 4a); 2) répliquant bactériostatique (démontré par le linézolide, la figure 4b); 3) non-répliquant bactéricide (démontrée avec oxyphenbutazone, Figure 4c); et, 4) replicating bactéricide actif (bactériostatique ou bactéricide) et ne se répliquant pas (démontrée avec le PA-824, la figure 4d). Fait important, les figures 4a et 4b démontrent que , bien que l' isoniazide et le linézolide semblent avoir une activité contre les bactéries non répliquant par l'essai MIC 90, CARA suggère qu'ils sont inactifs dans les conditions non répliquants testées. Pour tester l'utilité du PRQA pour prédire l' impact du temps et dépendant de la concentration d'une molécule, reproduisant M.smegmatis a été exposée à des concentrations croissantes de la rifampicine (figures 5a – d) et à plusieurs reprises entre 1-24 heures, des aliquotes ont été repérés sur des plaques de CARA. Ces données indiquent que la rifampicine a exercé un impact dès 1 h (figure 5a), affiché en augmentant l' activité bactéricide entre 3 et 24 heures (figures 5b-d), et tué ≥2-3 log 10 à ~ 10 pg / ml par 24 h (Figure 5d). Test d'une expérience similaire d'un quatre exemplaires de contrôle du véhicule et 9 concentrations de médicament, et à 4 points de temps, serait prohibitif par un test à base de CFU standard. Ainsi, le CARA a un rôle dans la découverte de médicaments comme un débit moyen, mécanisme rapide pour identifier le profil d'activité d'une molécule. prédictions CARA doivent être rigoureusement évalués en utilisant un dosage CFU standard. L'addition de 0,4% de charbon actif à des boîtes de Petri pour l' analyse CFU peut aider à améliorer la corrélation des données cara et peut entraîner des chiffres plus précis UFC, l'ampleur de la correction étant sensiblement proportionnelle à la puissance du composé 21,22. Figure 1: Le CARA est un outil prédictif dans la découverte de médicaments. Ce schéma résume l'utilité du CARA commeétape intermédiaire entre le dépistage des drogues (dépistage du seul point, picorage et analyses dose-réponse) et hit-to-lead tests chronophages (tests de CFU et l'identification des cibles). [Adapté avec la permission de Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2015 7] S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2: Schéma du bouillon MIC 90 dosage et CARA avec des résultats attendus. Les deux MIC 90 et CARA résultats sont présentés pour 8 activités possibles. La couleur pour MIC 90 puits de microplaques est blanc (pas de croissance) et marron (croissance), et pour CARA microplaques est noir (pas de fluorescence) et rose (fluorescence résorufine). Les données sont hypothétiques. [Adapté avec la permission de Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2015 7] S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3: Spécialisé termes CARA et définitions. La concentration minimale bactéricide d'une molécule qui entraîne des niveaux de fluorescence de fond CARA est le MBC-CARA ≥99 (a). Dans des conditions de réplication, un changement ≥4 fois de la CARA-MBC ≥99 à droite de la MIC 90 indique souvent l' activité bactériostatique et est appelé une "fenêtre statique" (b). Pour les molécules ayant un effet post-antibiotique puissant, les fenêtres statiques peuvent être difficiles à observer (c) et nécessitentl' expansion de l'axe Y (PRQA de fluorescence) pour visualiser (d). Les données sont hypothétiques. [Adapté avec la permission de Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2015 7] S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4: MIC Illustration 90 et CARA résultats pour certains composés. Les données pour MIC 90 (rouge) et CARA (bleu) sont démontrées pour (a) l' isoniazide (INH), (b) linézolide, (c) oxyphenbutazone, et (d) PA-824. De type sauvage M. tuberculosis H37Rv a été exposé à des composés pendant 7 jours dans des conditions de réplication standard ou le modèle multi-stress de la non-réplication 7-9. MIC 90 dosages et CARA ont été réalisées comme représenté sur la figure 2. [Adapté avec la permission de Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2015 7] S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 5: la dose et de l' activité en fonction du temps de la rifampicine. Le non-pathogène, à croissance rapide M. smegmatis a été exposée à des concentrations croissantes de rifampicine dans des conditions de réplication et des aliquotes ont été échantillonnés pour CARA au 1 (a), 3 (b), 6 (c) et 24 (d) h. [Adapté avec la permission de Gold et al., Agents et Antimicrobial Chemotherapy 2015 7].com / fichiers / ftp_upload / 54690 / 54690fig5large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Tableau 1: Sommaire des résultats attendus de la figure 2. [Adapté avec la permission de Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2015 7] S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.

Discussion

Cara a été initialement développé pour atténuer un goulot d' étranglement dans la progression non répliquant ou des molécules bi-actifs 7. Le CARA sert comme une étape intermédiaire entre la confirmation des résultats de dépistage primaire et des tests de CFU (Figure 1) concentration-réponse. Depuis une plaque de CARA unique peut remplacer de nombreuses plaques de microtitration nécessaires pour préparer des dilutions en série, et des boîtes de Pétri contenant agar-utilisées pour énumérer les bactéries survivantes, le CARA fournit un moyen simple d'évaluer rapidement l'activité d'une molécule et tester plusieurs variables à la fois, y compris la concentration du composé et le temps d'exposition au composé.

Dans un dosage de CFU, en plus des dilutions en série allant souvent jusqu'à 10 -fold 6, la plaque de gélose dilue typiquement des molécules par un ~ 800 fois supplémentaire (10 ul ONTO 8 ml dans une boîte de Petri tri-mode). Nos deux étapes, test de criblage multi-stress pour les composés actifs sur la non-réplication M. tutuberculosis a un facteur de report de cinq fois, qui est un composé présent dans la phase non réplicatif du dosage est présent à raison d' un cinquième de la concentration initiale dans l'excroissance (replication) la phase de l'essai 6-9. Les atténue CARA effets de report en séquestrant petites molécules avec du charbon actif. La majorité des médicaments antituberculeux et les candidats cliniques lier charbon activé rapidement et complètement, à l'exception de l'aminoglycoside streptomycine 7. Inclusion du charbon actif dans des plaques d' agar pour les dosages de CFU a empêché l' inhibition de la croissance bactérienne, ou tuer des bactéries, par reportées sur TMC207 et PA-824 7,21,22. Ainsi, grâce à l'incorporation du charbon activé dans l'agar bactériologique, le CARA ne dépend pas des dilutions en série de cellules et de l'agent d'essai.

Le CARA peut aider à prédire l'impact bactériostatique ou bactéricide des actifs et de l'impact répliquant bactéricide des actifs non-réplication. En général, le CARA est utilisé en parallèle avec MIC norme 90 essais. Le pouvoir prédictif de la CARA provient de la comparaison MIC 90 et les résultats CARA (figure 2 et tableau 1). Lorsqu'ils sont utilisés pour étudier les agents anti-mycobactériens, le CARA peut prédire avec précision l' activité bactéricide qui est reproduit (figure 4a), reproduisant bactériostatique (figure 4b), bactéricide ne se répliquant pas (figure 4c), ou double actif (figure 4d). Le CARA permet également une évaluation simple de l'activité d'un composé à travers à la fois la dose et du temps. Dosages CFU nécessitent seulement beaucoup d'efforts et de matériel pour évaluer l' activité d'un composé sur une large gamme de doses et les temps, mais la tâche devient gérable lorsque les résultats de CARA limitent la gamme des conditions à celles dans lesquelles le composé est manifestement active (Figure 5 ).

Tandis que le CARA a une utilité dans l'étude de l'action d'unnti-infectieux sur les mycobactéries, le test a ses limites. Le CARA a une plage dynamique étroite (2-3 log 10) et peut ne pas être approprié pour les conditions dans lesquelles on prévoit qu'il y peut – être pas plus de 2 à 3 log 10 kill bactérienne. prédictions CARA nécessitent une étude plus approfondie en utilisant une méthode plus rigoureuse et précise d'énumérer le nombre de bactéries, comme un test CFU. L'effet post-antibiotique de certains anti-infectieux, tels que le PAS, peut confondre l'CARA comme un outil prédictif de distinguer entre les composés avec une activité bactéricide et bactériostatique contre la réplication M. tuberculosis 7.

Il y a deux recommandations visant à améliorer la qualité de la CARA. Premièrement, il faut verser CARA microplaques rapidement avant la solidification de gélose, tout en conservant une précision volumétrique et d'éviter les éclaboussures en dehors de micropuits. Quel que soit le nombre de plaques nécessaires, nous recommandons de faire 0,5 à 1 L lots de moyen pour aider à maintenir le moyen sous forme liquide pendant toute la durée du temps nécessaire pour verser des plaques. Modification des conseils fréquemment pendant le remplissage des microplaques avec le milieu évite d'utiliser des conseils partiellement obstrués. Deuxièmement, il faut minimiser la variabilité artifactual de la fluorescence entre les répétitions. Microcolonies mycobactéries, en particulier pour les mycobactéries pathogènes telles que M. tuberculosis, se développent souvent de façon erratique. Par exemple, les microcolonies en développement sur la surface de la gélose peuvent varier en taille, la forme, la hauteur, ou peuvent se prolonger jusqu'à les parois intérieures des puits de microplaques. Un défi est de couvrir tous les bacilles uniformément avec le réactif de développement. Un autre obstacle est que, après une incubation prolongée à 37 ° C, le milieu bacteriologic solide de la CARA microplaques peut devenir sèche et enclin à absorber le réactif de développement. Puisque le charbon actif peut se lier résazurine et éteindre la fluorescence 7, il peut y avoir des variations du puits à bien en raison de puits secs absorbant la résazurine solution de développement et l'Charcoa activél trempe résazurine fluorescence. Pré-mouillage de la surface de tous les puits de microplaques CARA avec PBS immédiatement avant d'ajouter le réactif de développement atténue ces deux problèmes – le réactif de développement atteindra toutes les colonies de mycobactéries aussi, et la résazurine reste en toute sécurité au-dessus du charbon actif. Le CARA peut avoir des applications pour identifier et caractériser les phénotypes de mutants mycobactériennes, ou dans un milieu-débit des essais de découverte de médicaments pour d'autres espèces bactériennes.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous sommes reconnaissants à Kristin Burns-Huang pour examen par des experts du manuscrit et J. David Warren (Weill Cornell Medical College) à l'aide de la chimie tout en développant la CARA. Ce travail a été soutenu par le programme Accelerator TB Drug de la Fondation Bill et Melinda Gates, l'Abby et le programme Milstein P. Howard Translational Medicine, et une unité de recherche sur la tuberculose NIH (U19 AI111143). Le Département de microbiologie et d'immunologie est soutenu par la Fondation William Randolph Hearst. SSK a été soutenu par le NIH subvention K08AI108799.

Materials

Middlebrook 7H9 Beckton Dickinson 271310
Middlebrook 7H11 Beckton Dickinson 298810
Middlebrook OADC Beckton Dickinson 212351
BSA, heat shock Roche 3118958001
activated charcoal Sigma C5510
PBS, Dulbecco's Ca2+ and Mg2+ free Life Technologies / Invitrogen 14190-144
tween 80 Sigma P8074
tyloxapol Sigma T8761
sodium nitrite Sigma 2252
rifampicin Sigma R3501
6-bromo-1H-indazol-3-amine Alfa Aesar H34095
potassium phosphate monobasic   Sigma P0662
magnesium sulfate, heptahydrate  Sigma M1880
ferric ammonium citrate  Sigma F5879
zinc sulfate, heptahydrate Sigma Z0251
ammonium chloride  Sigma A9434
butyric acid, liquid Sigma B103500
resazurin powder Sigma R7017
sodium chloride  J.T. Baker 4058-01 
prepared resazurin solution  Invitrogen DAL1100
PCR stickers Denville B1212-5
spectrophotometer Molecular Devices M5
96-well, tissue culture treated microplates Corning 3595
reagent reservoirs VWR  89094-678
resealable plastic bags VWR  395-94602
14 mL Polypropylene round-bottom tubes Corning  352059
50 mL conical centrifuge tube Corning 352070
75 cm2 Cell culture flask Corning 431464U
clear, flat bottom tissue culture treated 96-well microplate Costar 3595
Prism 6 for OS X GraphPad http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
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References

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Gold, B., Roberts, J., Ling, Y., Lopez Quezada, L., Glasheen, J., Ballinger, E., Somersan-Karakaya, S., Warrier, T., Nathan, C. Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria. J. Vis. Exp. (118), e54690, doi:10.3791/54690 (2016).
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