マイコバクテリアの半定量的、ミディアムスループット列挙のためのチャコール寒天レサズリンアッセイの可視化

CARAマイクロプレートの調製あるいはオートクレーブ900 2Lのエルレンマイヤーフラスコ中の0.2％のグリセロール及び0.4％の活性炭を含むミドルブルック7H11寒天mlの、または、1 Lのガラスビーカー450ミリリットル。フラスコやビーカーに大きなオートクレーブ滅菌攪拌棒を含めます。アルミホイルでフラスコやビーカーの開口部をカバーし、オートクレーブテープでガラスに取り付けます。 懸濁液中の木炭を維持するために低速度に設定した磁気攪拌プレート上（約55〜65℃）に触れないようにクール。 磁気撹拌プレートを持つバイオセーフティフード内で無菌的に後続のすべての手順を実行します。 ホイルを外します。 100ミリリットルOADCサプリメントを追加します（OADCサプリメント、10％で使用した場合、0.2％デキストロース、0.5％アルブミン、0.085パーセントのNaCl、0.0005％のオレイン酸、および0.4 mg / mlでカタラーゼの収率最終培地濃度）2 L三角フラスコへ、または1リットルのビーカーに50ミリリットルOADC、および混合を続けます。 三角フラスコを使用した場合、約25-4を注ぎます無菌試薬槽に7H11-OADC-炭の0ミリリットル。ビーカーを使用する場合は、試薬リザーバを使用する必要はありません。 200μL/ウェルの試薬槽やビーカーから7H11-OADC-木炭で96ウェルマイクロプレートを埋めます。寒天固化や気泡の導入を避けるために、迅速に作業。それが真菌汚染の原因になる可能性がありとして、井戸の外に固形培地をはね避けてください。マルチチャンネルピペットを用いて、96ウェルプレートの8行（AH）へ7H11-OADC-炭の転送のために12フィルターチップの1セットを使用します。 注：メディアはすぐに固化します。ピペットチップを詰まらないようにするには、頻繁に変更します。 あるいは、多数のプレートを調製する際に支援するためにフィルターチップとP1000電子マルチチャンネルピペットを使用して、マイクロプレートCARAを注ぎます。 注：これによりマイクロプレートウェルの低体積に、CARAマイクロプレート内の寒天を注ぐの分以内に固化します。 再密封可能なプラスチック製のBAでCARAマイクロプレートの場所スタックgsが乾燥避けるために。 4℃でマイクロストアCARA。 2. 90アッセイを複製および非複製MICの設定 結核菌 、M。ボビス BCGを接種するか、M.は OD 0.01から0.1の580でスメグマチスとミドル7H9-ADNで対数期中期（OD 580〜0.5）に拡張（ミドル7H9は0.2％グリセロールを含む、0.2％デキストロース0.5％のアルブミン、0.085％のNaCl）又は7H9-OADC（ミドル7H9 0.2％グリセロール及び10％OADCサプリメントを含みます）。 細胞培養フラスコで培養を立って20ミリリットル〜として結核菌 およびM.ボビス BCGを育てるとM.は、ポリプロピレン丸底（4ミリリットル文化）または50mlコニカル遠心管（10〜20ミリリットル文化）で振とうしながらスメグマチス 。 20％O 2および5％CO 2、37℃での病原性マイコバクテリアをインキュベートし、M.、20％のO 2、37℃でスメグマチス 。 最小限の阻害を設定します濃度（MIC 90）条件（ 図2）を複製し、非複製の下-style実験。 注：試験薬剤は、通常、96ウェルマイクロプレートあたり、それぞれ、試験4、または2の化合物を可能にするために、重複または四連でアッセイされます。例えば、96ウェルプレート中で、一つの試験薬剤は、行EHの行のADと他のでアッセイすることができます。 DMSO（車両）は、列1、2、および12であり、試験薬剤の希釈系列は、カラム11（最高濃度）に3列（最低濃度）から実行されます。 MIC 90スタイルのアッセイは、典型的に2倍希釈系列を使用します。そこマイコバクテリア14-16,18,24,25に利用可能な多数の非複製のモデルがあり、例示的な目的のために、我々は、非複製6,8,9のマルチストレスモデルを使用しています。 複製アッセイのために、透明底、組織培養処理した96ウェルプレートのすべてのウェルにOD 0.01の580で7H9-ADNで200μlの細胞を配布します。 <非複製アッセイのためLI>、0.02％チロキサポールを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を2回洗浄し、非複製培地（0.05％KH 2 PO 4、0.05％のMgSO 4、0.005％クエン酸第二鉄アンモニウムで再懸濁細胞、0.0001％のZnCl 2、0.1％NH 4 Clで、0.5％のBSA、0.085パーセントのNaCl、0.02％チロキサポール、0.05％酪酸; pHを2 N NaOHで5.0に調整）。 非複製培地でOD 0.1の580に細胞を希釈し、最終濃度0.5mMに新たに調製した1 MストックからのNaNO 2を追加します。 透明底、組織培養処理した96ウェルプレートのすべてのウェルにOD 0.1の580で200μlの細胞を配布します。 注：DMSO中の100倍ストック溶液として化合物の希釈液を調製します。このように、最終濃度0.4〜100μgので分子の影響を試験する典型的なMICプレート/ mlのDMSO中0.04から10 mg / mlでのストック溶液を必要とするであろう。 ディの2μLを加えます行AEと行EHに試験剤2の希釈液を2μlに試験剤1のlutions。完全に混合。 カラム1、2、12（行AH）、対照ウェルに2μlの車両制御（通常はDMSO）を追加します。完全に混合。 各実験について、このような0.004〜1 / mlの（複製アッセイ）および/または0.08〜20μgの/ mlの（非複製アッセイ）からのリファンピシンなどの少なくとも1つのポジティブコントロールが含まれています。 注：0.1〜25 / mlの非複製のマルチストレスモデルにおける選択的ナノ2依存性の活性を有する対照化合物として推奨されているに6-ブロモ-1H-インダゾール-3-アミンを使用する9。 アッセイを複製するために、7日（ 結核菌 およびM.ボビス BCG）、または1から48時間（M.がスメグマチス ）のために20％O 2、5％CO 2で37℃でマイクロプレートインキュベートします。非複製のマルチストレスモデルは、<（1％O 2および5％CO 2で37℃で7日間インキュベートし、マイクロプレートem>のM。結核とM.ボビス BCG）。 CARAマイクロプレートの3接種 CARAは、読み出しとして使用された時点で、慎重によく50-75μLに設定P200マルチチャンネルピペットを使用してMIC 90スタイルのアッセイプレートの内容物を再懸濁します。静かにピペットで上下に少なくとも5〜10倍とは、ピペットチップを使用して、円を描くようによく内容を旋回させます。 CARAマイクロプレートに移し、アッセイウェルの内容物を10μl。アッセイプレート上のウェルの内容の順序がCARAマイクロプレートのウェル内容の順序と一致していることを確認してください。転送中に飛散を避け、10μlのは、CARAのマイクロプレートウェルの中央にスポットされていることを確認します。 CARAマイクロプレートに吸収10μlのを確認してください。 注：前CARAマイクロプレート上の細胞をスポッティングするために必要な一切の希釈はありません。 プレートテープでマイクロCARAのスタックをバインドし、その後、再密封可能なビニール袋に入れます。マイクロCARAインキュベート20％O 2、37°C​​（M.がスメグマチス ）または1％O 2および5％CO 2（ 結核菌およびM.ボビス BCG）で。 アッセイを複製、 結核菌とM.ボビス BCGの場合：7日間インキュベート。 結核菌とM.ボビス BCG非複製アッセイのために、10日間インキュベート。 M.はスメグマチスのために、アッセイを複製し、1〜2日間インキュベートします。 M.はスメグマチスのために、非複製アッセイは、2〜3日インキュベートします。 注：時間は見積もりであり、異なる複製、非複製、およびストレス条件のために応じて修正することができます。 4. CARAマイクロプレートの開発細菌の増殖、または大きく、肉眼で見えるコロニーのフィルムは、負（車両）コントロールウェルに表示されたときにマイクロプレートCARAを開発します。 注：長時間のインキュベーション後、CARAのマイクロプレートウェル、多くの場合、ドライ表示され、我々は、滅菌PBSでプリウエット内容をよくお勧めします。これは、低蛍光またはウェル間の変動につながる可能性がレサズリンを、吸収から炭を防止する役割を果たす。 マルチチャンネルピペットで12 P200チップの単一のセットを使用して、ウェルの側面に沿って滅菌PBS40μlのを分配し、PBSは、寒天/細菌微小コロニーの上部に配布することができます。 CARAは、5mgレサズリン（最終0.01％）、PBS中5％のTween80 50ミリリットルを混合することにより、試薬を開発して準備します。渦と滅菌フィルター。 注：PBS中の10％Tween80を1（体積/体積）の代替CARA現像試薬が1で溶液レサズリン商業的に調製された混合することにより調製することができます。 12チャンネルピペットを用いて、CARAマイクロプレートの各ウェルに試薬を開発し、新たに調製したCARAの50μLを加えます。ロックプレートは前後に数回は、各ウェル中の寒天および細菌マット全体で試薬を分配するのに役立ちます。 プレートを置き私ナジッパー付きビニール袋とは、Mのために少なくとも30分間スメグマチスと結核菌やM.ボビス BCGのために45から60分間37℃でインキュベートします。 注：ビヒクル対照ウェルを1時間以内ピンク色をオンに失敗した場合、プレートを再度袋及びより長い時間インキュベートすることができます。 蛍光を読み取るに先立ち、削除彼らのふたで、室温で15分間、バイオセーフティフード内でマイクロCARAを配置します。安全キャビネットの外でBSL3分光光度計を使用する場合は、板の上に光学的品質のPCRステッカーを付着し、ソフトペーパータオルでステッカーの表面を軽く押して、しっかりと密封します。 590 nmで530 nmでの励起および発光で読み取るトップ介して蛍光を決定します。これは、ブランクプレートをする必要はありません。 5.データ解析リニアスケール上のY軸上のログ10スケールと蛍光上のX軸上のプロット阻害剤濃度。散乱を使用します曲線を採用したプロットは、「応答可変勾配（4パラメータ）に対する阻害剤をログに記録」としてフィット。 ±標準誤差としてプロットデータポイント。