Mikobakteriler Yarı kantitatif, Orta hacimli Sayımı İçin Kömür Agar Resazurin Testi görselleştirme

CARA mikro hazırlanması 1. 2 L'lik bir Erlenmeyer şişesi içinde% 0.2 gliserol ve% 0.4 aktif kömür ihtiva eden Middlebrook 7H11 ağarı Otoklav 900 mi, ya da seçenek olarak, bir 1 L'lik bir cam beher içinde, 450 mi. şişeye veya beher büyük bir otoklav karıştırma çubuğu ekleyin. alüminyum folyo ile şişesi veya beher açılmasını Kapak ve otoklav bant ile cama ekleyin. süspansiyonda kömür korumak için düşük bir hıza ayarlanmış bir manyetik karıştırma plakası üzerinde (yaklaşık 55-65 ° C) dokunun soğutun. Bir manyetik karıştırma plakası olan bir biyogüvenlik kaput içinde aseptik sonraki tüm adımları uygulayın. folyoyu çıkartın. 100 mi OADC ek ekleyin (OADC takviyesi,% 10 kullanıldığında,% 0.2 dekstroz,% 0.5 albümin,% 0.085 NaCl,% 0.0005, oleik asit, ve 0.4 mg / ml katalaz verimleri son ortam konsantrasyonlar) 2 L'lik bir Erlenmeyer şişesine ya da 50 ml 1 L çanağa OADC ve karıştırmaya devam edin. Bir Erlenmeyer şişesine kullanılıyorsa, yaklaşık 25-4 dökünsteril reaktif rezervuara 7H11-OADC kömür 0 mi. kabı kullanarak, Reaktif kabını kullanmak gerekli değildir. 200 ul / oyuk reaktif rezervuar ya da kaptan 7H11-OADC kömür ile 96 gözlük bir mikroplakanın doldurun. Agar katılaşma ve kabarcıkların giriş önlemek için hızlı bir şekilde çalışın. Bu mantar bulaşma kaynağı olabilir gibi, kuyu katı ortam dışında sıçramasını önlemek. Bir çok kanallı pipet kullanarak, 96 oyuklu plakanın 8 sıra (AH) için 7H11-OADC kömür transferini 12 filtresi uçlarından birini dizisi kullanılır. NOT: orta hızla katılaşır. pipet uçları tıkanmasını önlemek için, bunları sık sık değiştirin. Alternatif olarak, çok sayıda tabak hazırlanmasında yardımcı olmak için filtre ipuçları ile P1000 elektronik çok kanallı pipet kullanarak mikro-plakalar CARA'nın dökün. NOT: nedeniyle mikroplaka kuyu düşük hacim, CARA mikroplitelerin agar dökme dakika içinde katılaşır. açılıp kapanabilir plastik ba içinde CARA mikrolevha- Yeri yığınlarıgs kurumasını önlemek için. Mağaza CARA mikro 4 ° C 'de. 90 Deneyleri 2. kopyalama Kurma ve MİK Sigara kopyalayan M. tuberculosis, M. bovis BCG aşılamak veya M bir OD 0.01-0.1 arasında 580 smegmatit ve Middlebrook 7H9-ADN orta log fazı (OD 580 ~ 0.5) genişletmek (Middlebrook 7H9% 0.2 gliserol içeren,% 0.2 dekstroz % 0.5 albümin ve% 0.085 NaCl) ya da 7H9-OADC (Middlebrook 7H9% 0.2 gliserol ve% 10 OADC ek ihtiva eden). Hücre kültürü şişelerinde kültürü duran, 20 ml ~ şekilde M. tuberculosis ve M. bovis BCG büyümek ve M. polipropilen yuvarlak taban (4 ml kültür) veya 50 ml konik santrifüj tüpleri (10-20 ml kültür) içinde sallama ile smegmatis. % 20 O2 ve% 5 CO2 ile 37 ° C 'de patojen mikobakteriler inkübe, ve M.% 20 O2 ile 37 ° C' de smegmatis. minimal-inhibitör kurmakkonsantrasyon (MİK 90) kopyalayan ve non-kopyalayan koşulları (Şekil 2) altında tarzı deney. Not: Deney maddeleri, genellikle, 96 oyuklu mikro-başına, sırasıyla test 4, veya 2 bileşikleri, izin vermek için yinelenen veya dörtlü olarak deneye tabi tutulur. Örneğin, bir 96-yuvalı plaka içinde, bir test maddesi satır EH satırlar AD ve başka analiz edilebilir. DMSO (araç) sütun 1, 2, ve 12 ve test maddesi seyreltme serisi sütuna 11 (en yüksek konsantrasyon) sütun 3 (en düşük konsantrasyon) kadar devam eder. MIC 90 tarzı tahliller tipik olarak 2 kat seyreltme serisi kullanır. Orada mikobakteriler 14-16,18,24,25 için çok sayıda olmayan kopyalayan modelleri ve amaçlıdır, non-çoğaltma 6,8,9 bir çok stres modeli kullanıyor. Kopyalayan deneyi için, açık bir dipli doku kültürü tedavi 96 oyuklu plakanın her kuyulara bir OD 0.01 580 7H9-ADN 200 ul hücre dağıtın. <li> replike olmayan testi için,% 0.02 tiloksapol ihtiva eden fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde hücreler iki kez yıkama ve replike olmayan ortam (% 0.05 KH 2 PO 4,% 0.05 MgSO 4,% 0.005 demir amonyum sitrat yeniden süspanse hücreleri ,% 0.0001 ZnCl2,% 0.1 NH4CI,% 0.5 BSA,% 0.085 NaCl,% 0.02 tiloksapol,% 0.05 bütirat pH) 2 N NaOH ile 5.0'a ayarlanmıştır. Replike olmayan bir ortam içinde bir OD 0.1 580 hücreleri seyreltilir ve 0.5 mM nihai bir konsantrasyona kadar taze hazırlanmış 1 M'lık bir stok nano 2 ekleyin. Berrak tabanlı doku kültürü tedavi 96 oyuklu plakanın her kuyulara bir OD 0.1 580 200 ul hücre dağıtın. Not: DMSO içinde 100 kat stok çözeltiler halinde bileşik dilüsyonları hazırlayın. Bu durumda, nihai bir konsantrasyona 0,4-100 ug bir molekülün etkilerini test tipik bir MIC levha / ml DMSO'da 0,04-10 mg / ml stok solüsyonları gerektirecektir. di 2 ul ekleyinsatırlar AE içine Test maddesinin 1 mel çözümler ve satırları EH içine Test maddesinin 2 dilüsyonları 2 ul. İyice karıştırın. sütun 1, 2, 12 (satırlar AH), kontrol kuyulara 2 ul araç kontrolü (genellikle DMSO) ekleyin. İyice karıştırın. Her deney için, örneğin 0.004 ile 1 ug / ml (replike deneyi) ve / veya 0.08 ila 20 ug / ml (replike olmayan deneyi) ile ilgili rifampisin gibi en az bir pozitif kontrol. Not: 0.1 ila 25 ug / ml'de, 6-bromo-1 H-indazol-3-amin 9'a göre bir kullanım dışı çoğaltma çok stres modelinde seçici olan kontrol bileşiği Nano 2 bağımlı aktivitesi olarak önerilmektedir. Tahlilleri çoğaltılması için, 7 gün (M. tuberculosis ve M. bovis BCG) ya da 1-48 saat (M smegmatis) için% 20 O2 ve% 5 CO2 seviyesinde 37 ° C'de mikro-inkübe edilir. Olmayan replikasyon çok stres modelinde, (<% 1 O 2 ve% 5 CO2 seviyesinde 37 ° C'de 7 gün süreyle inkübe mikroem> M. tüberküloz ve M. bovis BCG). CARA mikro 3. İnokülasyon CARA bir okuma olarak kullanılacak olan zaman noktalarında, dikkatli bir şekilde de 50-75 ul ayarlanmış bir P200 çok kanallı pipet kullanarak MIC 90 tarzı deney plakasının içeriğini yeniden süspanse edin. nazikçe Pipet yukarı ve aşağı, en az 5-10 kez ve pipet uçları kullanarak dairesel hareketlerle iyice içeriğini girdap. Aktarım CARA mikroplakaya tahlil kuyu içeriğinin 10 ul. tahlil plaka üzerinde kuyu içeriğinin sırası CARA mikrolevha'sının iyi içeriğinin sırasını aynı olduğundan emin olun. aktarımları sırasında sıçramasını önlemek ve 10 ul CARA mikroplak kuyuların ortasına benekli emin olun. CARA mikrolevhadaki içine emer 10 ul onaylayın. NOT: Önceki CARA mikroplitelerin üzerinde hücreleri tespit için gerekli hiçbir seyreltmeler vardır. plaka bant ile mikropleytin Cara Bind yığınları veDaha sonra açılıp kapanabilir bir plastik torbaya koyun. Mikro CARA'nın inkübe% 20 O2 ile 37 ° C (M smegmatis) ya da% 1 O2 ve% 5 CO2 (M. tuberculosis ve M. bovis BCG) de. M. tuberculosis ve M. bovis BCG, tahliller replike: 7 gün inkübe; M. tuberculosis ve M. bovis BCG için replike olmayan tahliller, 10 gün boyunca inkübe; M. smegmatis deneyleri, replike, 1-2 gün süre ile inkübe; M. smegmatis, non-replike deneyler, 2-3 gün inkübe edilir. NOT: Times tahminleri ve farklı kopyalayan olmayan kopyalayan ve stres koşullarında buna göre modifiye edilebilir. 4. CARA mikropleytin Geliştirme bakteriyel büyüme, ya da daha büyük, makroskopik kolonilerin film, negatif (araç) kontrol kuyuları görünür olduğunda mikropleytin CARA'nın geliştirin. Not: Uzun süreli inkübasyondan sonra, CARA mikro levha genelliklekuru görünür ve biz steril PBS ile ön ıslatma iyi içeriğini tavsiye ederiz. Bu düşük floresan veya iyi-kuyu varyasyon yol açabilir resazurin, emici gelen kömür önlemek için hizmet vermektedir. Çok kanallı pipet ile 12 P200 ipuçları tek bir set kullanarak, kuyuların kenarı boyunca steril PBS 40 ul dağıtmak ve PBS ağar / bakteriyel mikrokoloniler üstünde dağıtmak için izin verir. CARA 5 mg resazurin (son% 0.01) ve PBS içinde% 5 Tween80 50 ml karıştırılarak dönüştürme maddesi hazırlanır. Vortex ve steril filtre. Not: PBS içinde% 10 Tween80 1 (hacim / hacim) bir alternatif CARA dönüştürücü madde 1 sıvı solüsyon resazurin ticari olarak hazırlanmış karıştırılmasıyla hazırlanabilir. 12 kanallı bir pipet kullanarak CARA mikrolevhanın her çukuruna taze hazırlanmış CARA dönüştürücü madde 50 ul ekle. Kaya plakaları ileri geri birkaç kez her kuyuda Agar ve bakteriyel mat genelinde reaktifi dağıtmak yardımcı olur. tabak yerleştirin ina açılıp kapanabilir plastik torba ve M en az 30 dakika smegmatis, M. Tüberküloz ya da M. bovis BCG 45-60 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. NOT: Araç kontrol kuyuları ilk bir saat içinde pembe edecek başarısız olursa, plakalar yeniden doldurulur ve daha uzun süreler için inkübe edilebilir. floresansı okunarak önce çıkarılır bunların kapakları, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir biyo-güvenlik başlığı içinde mikro CARA'nın yerleştirin. Bir biyogüvenlik kabini dışında BSL3 spektrofotometreleri kullanırken, plaka üzerinde bir optik kalitesi PCR etiketini uygun ve yumuşak bir kağıt havlu ile etiket yüzeyine hafifçe bastırarak sıkıca kapatın. 590 nm'de 530 nm 'de bir eksitasyon ve emisyon ile oku kafa üzerinden floresan belirler. Bu boş levha için gerekli değildir. 5. Veri Analizi Doğrusal bir ölçek üzerinde Y ekseni üzerinde log 10 ölçek ve floresan X-ekseni üzerinde Konu inhibitör konsantrasyonu. Bir dağılım kullanınbir eğri istihdam arsa gibi "yanıtı değişken yamaç (4 parametre) karşı inhibitör log" olarak uygun. ± standart hata anlamına gelir arsa veri noktaları.