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Immunology and Infection

Visualizzazione del carbone Agar resazurina Assay per semi-quantitativa, medio-throughput enumerazione dei micobatteri

Published: December 14, 2016
doi:
10.3791/54690
, , , , , , , ,
1Departments of Microbiology & Immunology,Weill Cornell Medical College, 2Medicine,Weill Cornell Medical College

Summary

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

Abstract

Vi è un urgente bisogno di scoprire e progredire anti-infettivi che accorciano la durata della tubercolosi trattamento (TB). Mycobacterium tuberculosis, l'agente eziologico della tubercolosi, è refrattario alla chemioterapia rapida e duratura dovuta alla presenza di bacilli espongono fenotipica resistenza ai farmaci. Il c harcoal una gar R esazurin un ssay (CARA) è stato sviluppato come strumento per caratterizzare molecole attive scoperti da campagne di screening high-throughput contro replicare e non replicare M. tuberculosis. L'inclusione di carbone attivo in agar batteriologico aiuta a mitigare l'impatto di composto riporto, ed elimina la necessità di cellule prima di individuare il CARA micropiastre pre-diluito. Dopo un periodo di incubazione 7-10 giorni a 37 ° C, la riduzione di resazurina da microcolonie micobatteri crescono sulla superficie di pozzetti CARA consente semi-quantitativa assessment di numeri batteriche tramite fluorimetria. Il CARA rileva circa un 2-3 log10 differenza nei numeri batteriche e prevede una minima concentrazione battericida che porta a ≥99% uccisione dei batteri (MBC ≥99). Il CARA aiuta a determinare se una molecola è attiva sul bacilli che replicano, non replicante, o entrambi. Esperimenti pilota utilizzando la CARA facilitare l'identificazione di cui la concentrazione di agente e tempo di esposizione composto di prova richiede un'ulteriore valutazione da formare colonie unità (CFU) saggi. Inoltre, il CARA può predire se attivi replicano sono battericida o batteriostatica.

Introduction

Mycobacterium tuberculosis, l'agente eziologico della tubercolosi, in grado di sopravvivere in un host in uno stato latente che è refrattario alla eradicazione antibiotica. Fenotipica (non genetica) la resistenza di M. tuberculosis durante l'infezione si crede che sia dovuta, in parte, alle popolazioni di bacilli non replicando 1,2. Classe persistenti I espongono fenotipica della resistenza ai farmaci nascono tramite rari meccanismi stocastici tra grandi popolazioni di cellule sensibili droga 3,4. persistenti classe II sono resi non replicante da fattori di immunità dell'ospite, tra cui sollecitazioni esterne in microambienti incontrati durante l'infezione. Recentemente abbiamo sviluppato un modello in vitro di classe II non replicare la persistenza di imitare le condizioni che devono affrontare da M. tuberculosis nei macrofagi e granulomi attivati. Il modello multi-stress di classe II persistenza comprende condizioni che crescita lenta, come una fonte di carbonio acido grasso, e completamente halt crescita, come l'acidità lieve (pH 5.0), ipossia (1% O 2), e l'ossido nitrico e altri intermedi reattive 5-9. Lo screening su larga scala utilizzando questo modello multi-stress del non-replica e altri modelli non-replicanti di classe II, ha dato diverse molecole la cui attività è diretta contro lo Stato non replicando 5-7,9-18. Gli stessi schermi non replicare anche rivelato una categoria di molecole che possiedono attività contro bacilli sia replicante e non replicare, chiamati "Dual attivi" 7,10,12,19,20.

Scoperta di nuovi farmaci antibatterici in fase di hit-to-lead comporta estesa caratterizzazione di molecole candidate a scegliere i cavi per l'espansione di successo, la caratterizzazione farmacologica preliminare, l'identificazione di destinazione e studi preliminari in vivo di efficacia. Come primo passo, anti-infettivi sono classificati per il loro meccanismo batteriostatica o battericida di azione e, se battericida, whe uccisione dei batteri è tempo e / o concentrazione-dipendente. Il saggio formanti colonie unità (CFU) è il metodo gold standard classico per rispondere a queste domande. Nel saggio CFU, i batteri sono esposti ad un agente di test, dopodiché aliquote vengono rimossi, diluiti serialmente, e aliquote di diluizioni sono distribuite su mezzi solidi batteriologico e incubate per consentire la crescita di cellule sopravvissute. Infine, colonie batteriche vengono enumerati. Il saggio CFU richiede un gran numero di micropiastre per diluire le cellule e Petri-piastre di agar contenenti per enumerare le colonie sopravvissute. Il saggio CFU per lenta micobatteri in crescita è ostacolata dal loro tempo lento generazione (18-24 ore), che richiede circa 3 settimane per le colonie di apparire su piastre. Inoltre, lo spazio incubatore è spesso limitato a specializzati biosicurezza livello 3-strutture.

Mentre ingombrante, saggi di CFU sono il gold standard per caratterizzare l'impatto di molecole non-replicanti e dual-attivi sul mycobacteria. Saggi non-replicanti sono soggetti ad alti tassi di falsi positivi, come molti sono accoppiati a replicare i test per valutare cellulare 6-8 vitalità. Ad esempio, un composto che ha una potente attività contro replicare M. tuberculosis (una "replica attiva") può riuscire a uccidere durante il dosaggio non replicanti, ma può ancora uccidere in virtù di riporto dalla fase non replicando del test per la fase di recupero del saggio, che è condotto in condizioni che supportano la replica ( "condizioni di replicare"). Compound riporto complica ulteriormente l'analisi di molecole attive doppio, il che rende difficile distinguere se l'attività è stata la replica, non-replicante, o doppio.

Per affrontare i problemi di cui sopra, abbiamo sviluppato il c harcoal una gar r esazurin un ssay (CARA) per una rapida, l'enumerazione semi-quantitativa delle specie micobatteriche come M. tuberculOsis, M. bovis BCG, e M. smegmatis 7 (figure 1 e 2). In soluzioni tampone in vitro, carbone attivo sequestra rapidamente la maggior parte dei farmaci standard utilizzati per trattare la tubercolosi 7. Il carbone attivo in CARA micropiastre lega i composti che possono trasportare più di da una micropiastra saggio, e questa caratteristica del CARA elimina la necessità di diluire serialmente contenuti saggio bene prima enumerazione 7,21,22. Il numero di microcolonie micobatterici sulla superficie agar di CARA micropiastre è stimato mediante l'aggiunta di resazurina, un colorante blu, la cui forma ridotta, resorufina, è una molecola rosa la cui fluorescenza viene misurata da un spettrofotometria 23. CARA micropiastre vengono incubate per 1-2 giorni per M. smegmatis e 7-10 giorni per i micobatteri a crescita lenta come il M. tuberculosis e M. bovis BCG. Il CARA ha una gamma dinamica ristretta di ~ 2-3 log 10 differenze in CFU. Quando viene utilizzato al posto di un saggio CFU, una singola micropiastra CARA sostituisce circa cinque piastre a 96 pozzetti utilizzati per diluizioni seriali e piastre di agar 120 tri-stile utilizzato per la placcatura. Interpretazione dei dati CARA aiuta a guidare studi successivi per determinare quali incubazione i tempi e le concentrazioni di composti di testare in saggi più laborioso CFU-based.

Protocol

1. Preparazione del CARA Micropiastre Autoclave 900 ml di Middlebrook 7H11 agar contenente 0,2% glicerolo e 0,4% carbone attivo in un pallone da 2 L Erlenmeyer, o in alternativa, 450 ml in un bicchiere di vetro 1 L. Include una grande ancoretta autoclavabile nel pallone o il bicchiere. Coprire l'apertura del pallone o becher con foglio di alluminio e allegare al vetro con nastro autoclave. Raffreddare a toccare (circa 55-65 ° C) su una piastra di ancoretta magnetica impostato a bassa velocità per mantenere il carbone in sospensione. Eseguire tutti i passaggi successivi in ​​modo asettico in una cappa di biosicurezza che ha una piastra di agitazione magnetica. Rimuovere la pellicola. Aggiungere 100 ml Integratore OADC (supplemento OADC, quando viene utilizzato al 10%, produce concentrazioni dei media finale di 0,2% di destrosio, 0,5% di albumina, 0,085% di NaCl, acido oleico 0,0005%, e 0,4 mg / ml catalasi) al pallone 2 L Erlenmeyer o 50 ml OADC al 1 L becher, e continuare a mescolare. Se si utilizza un beuta, versare circa 25-40 ml di 7H11-OADC-carbone in un serbatoio di reagente sterile. Se si utilizza il becher, non è necessario utilizzare un serbatoio di reagenti. Riempire una micropiastra a 96 pozzetti con 200 pl / pozzetto di 7H11-OADC-carbone dal serbatoio del reagente o bicchiere. Lavorare velocemente per evitare la solidificazione agar e l'introduzione di bolle. Evitare spruzzi solida esterna mezzo dei pozzi, come che può essere fonte di contaminazione fungina. Utilizzando una pipetta multicanale, usare un set di 12 punte di filtro per il trasferimento di 7H11-OADC-carbone di legna per le 8 righe (AH) della piastra a 96 pozzetti. NOTA: Il mezzo solidifica rapidamente. Per evitare di intasare i puntali delle pipette, cambiarli spesso. In alternativa, versare CARA micropiastre utilizzando un P1000 pipetta multicanale elettronica con punte di filtro per aiutare nella preparazione di numerosi piatti. NOTA: A causa del basso volume di pozzetti, l'agar-agar in CARA micropiastre solidifica in pochi minuti di colata. Luogo pile di CARA micropiastre in ba plastica richiudibiligs per evitare l'essiccazione. Conservare CARA micropiastre a 4 ° C. 2. Configurazione di Replica e MIC non replicando 90 saggi Seminare M. tuberculosis, M. bovis BCG o M. smegmatis ad un OD 580 di 0,01-0,1 e si espandono per fase di mid-log (OD 580 ~ 0,5) in Middlebrook 7H9-ADN (Middlebrook 7H9 contenente 0,2% glicerolo, 0,2% di destrosio , 0,5% di albumina, e 0,085% NaCl) o 7H9-OADC (Middlebrook 7H9 contenente 0,2% glicerolo e supplemento OADC 10%). Crescere M. tuberculosis e M. bovis BCG come ~ 20 ml culture in piedi in fiasche di coltura cellulare e M. smegmatis con agitazione in polipropilene a fondo tondo (cultura 4 ml) o conici da centrifuga da 50 ml (10-20 cultura ml). Incubare micobatteri patogeni a 37 ° C con 20% O 2 e 5% di CO 2, e M. smegmatis a 37 ° C con 20% O 2. Impostare un minimal-inibitorioconcentrazione (MIC 90) esperimento in stile in replica e non replicare le condizioni (Figura 2). NOTA: Gli agenti di test sono solitamente analizzati in duplicati o quadruplicates per consentire il test 4, o 2 composti rispettivamente, a 96 pozzetti micropiastra. Ad esempio, in una piastra a 96 pozzetti, un agente di prova può essere analizzato in righe AD e un altro in file EH. Il DMSO (veicolo) è nelle colonne 1, 2, e 12, e la serie di diluizione agente di test va da colonna 3 (concentrazione minima) alla colonna 11 (più alta concentrazione). MIC 90 saggi -style tipicamente impiegano serie di diluizioni di 2 volte. Ci sono numerosi modelli non-replicanti disponibili per micobatteri 14-16,18,24,25 e per scopi illustrativi, stiamo utilizzando un modello multi-stress di non replica 6,8,9. Per il saggio replicante, distribuire 200 cellule microlitri in 7H9-ADN ad un OD 580 di 0,01 in tutti i pozzetti di una chiara fondo, coltura di tessuti trattati piastra da 96 pozzetti. <li> Per il saggio non replicando, lavare le cellule due volte in tampone fosfato (PBS) contenente 0,02% tyloxapol, e Risospendere le cellule in mezzo non replicare (0,05% KH 2 PO 4, 0.05% MgSO 4, 0,005% citrato ferrico di ammonio , 0,0001% ZnCl 2, 0,1% di NH 4 Cl, 0,5% BSA, 0,085% NaCl, 0,02% tyloxapol, 0,05% butirrato, pH regolato a 5,0 con NaOH 2 N). Diluire le cellule ad un OD 580 di 0,1 in mezzo non replicanti e aggiungere NaNO 2 da un preparato fresco 1 M magazzino ad una concentrazione finale di 0,5 mM. Distribuire 200 cellule microlitri ad un OD 580 di 0,1 in tutti i pozzetti di una chiara fondo, coltura di tessuti trattati piastra da 96 pozzetti. NOTA: Preparare diluizioni composti da soluzioni di riserva di 100 volte in DMSO. Così, una piastra MIC tipica testare l'impatto di una molecola ad una concentrazione finale di 0,4-100 ug / ml richiederebbe soluzioni stock di 0,04-10 mg / ml in DMSO. Aggiungere 2 ml di diluzioni di agente di test 1 in righe AE e 2 ml di diluizioni di prova offerente 2 in righe EH. Mescolare accuratamente. Aggiungere 2 microlitri controllo del veicolo (di solito DMSO) nei pozzetti di controllo, colonne 1, 2, 12 (righe AH). Mescolare accuratamente. Per ogni esperimento, includere almeno un controllo positivo come rifampicina da 0,004 a 1 ug / ml (analisi replicare) e / o 0,08 a 20 pg / ml (analisi non replicante). NOTA: L'uso di 6-bromo-1H-indazol-3-ammina 9 a 0.1 al 25 ug / ml è raccomandato come un composto di controllo che è selettiva, NaNO 2 attività -dipendente nel modello multi-stress non replica. Per replicare i saggi, incubare micropiastre a 37 ° C a 20% O 2 e il 5% di CO 2 per 7 giorni (M. tuberculosis e M. bovis BCG) o 1-48 ore (M. smegmatis). Per il modello multi-stress non replica, incubare le micropiastre per 7 giorni a 37 ° C a 1% O 2 e 5% CO 2 (<em> M. la tubercolosi e la BCG M. bovis). 3. Semina del CARA Micropiastre A intervalli di tempo in cui il CARA verrà utilizzato come un read-out, con attenzione risospendere ben contenuto della piastra saggio in stile MIC 90 usando una pipetta multicanale p200 fissato a 50-75 ml. Pipetta su e giù per almeno 5-10 volte e mescolare delicatamente il contenuto dei pozzetti in un movimento circolare utilizzando i puntali delle pipette. Trasferimento 10 ml di contenuto saggio e alla micropiastra CARA. Assicurarsi che l'ordine dei contenuti e sulla piastra saggio corrisponde l'ordine dei contenuti e della micropiastra CARA. Evitare gli schizzi durante i trasferimenti e assicurarsi che i 10 ml sono macchiati in mezzo pozzi CARA micropiastra. Confermare i 10 ml assorbe nella micropiastra CARA. NOTA: Non vi sono diluizioni necessarie prima di individuare le cellule sul CARA micropiastre. pile Bind di CARA micropiastre con nastro piatto epoi posto in un sacchetto di plastica richiudibile. Incubare CARA micropiastre a 37 ° C con il 20% O 2 (M. smegmatis) o 1% O 2 e il 5% di CO 2 (M. tuberculosis e M. bovis BCG). Per M. tuberculosis e M. bovis BCG, replicando saggi: incubare per 7 giorni; per M. tuberculosis e M. bovis BCG non replicando saggi, incubare per 10 giorni; M. smegmatis, replicando saggi, incubare per 1-2 giorni; M. smegmatis, saggi non-replicanti, incubare 2-3 giorni. NOTA: I tempi sono stime e possono essere modificate di conseguenza per i diversi replica, non-replicanti, e condizioni di stress. 4. Sviluppare CARA Micropiastre Sviluppare il CARA micropiastre quando un film di crescita batterica, o, colonie macroscopiche più grandi, sono visibili sui pozzetti negativi (veicolo) di controllo. NOTA: Dopo l'incubazione prolungata, CARA pozzetti spessoapparire secca e si consiglia di pre-bagnanti e contenuti con PBS sterile. Questo serve ad evitare che il carbone di assorbire resazurin, che può portare a bassa fluorescenza o ben-to-well variazione. Utilizzando un unico set di 12 P200 punte con una pipetta multicanale, erogare 40 ml di PBS sterile lungo il lato dei pozzi e consentire la PBS per distribuire in tutta la parte superiore delle microcolonie agar / batteriche. Preparare CARA sviluppo miscelando 5 mg resazurin (0,01% finale) e 50 ml di 5% Tween80 in PBS. Vortex e filtro sterile. NOTA: Un CARA reagente sviluppo alternativo può essere preparata mescolando preparati commercialmente resazurin soluzione liquida a 1: 1 (vol / vol) con il 10% Tween80 in PBS. Aggiungere 50 ml di reagente appena preparato sviluppare CARA a ciascun pozzetto della micropiastra CARA usando una pipetta a 12 canali. lastre di roccia avanti e indietro un paio di volte per distribuire il reagente in tutto il tappetino agar e batteri in ogni pozzetto. Posizionare le piastre ina busta di plastica richiudibile e incubare a 37 ° C per almeno 30 minuti per M. smegmatis e 45-60 min per M. tuberculosis o BCG M. bovis. NOTA: Se i pozzetti di controllo del veicolo non riescono a diventare rosa entro la prima ora, le piastre possono essere ri-confezionati e incubate per lunghi periodi di tempo. Prima della lettura di fluorescenza, posizionare CARA micropiastre in una cappa di biosicurezza per 15 minuti a temperatura ambiente con i loro coperchi rimossi. Quando si utilizza spettrofotometri BSL3 al di fuori di un armadio biosicurezza, aderire un adesivo PCR qualità ottica sopra la piastra e sigillare ermeticamente premendo delicatamente sulla superficie adesivo con un tovagliolo di carta morbida. Determinare fluorescenza tramite top letto con eccitazione a 530 nm ed emissione a 590 nm. Non è necessario vuoto piastra. Analisi 5. I dati Concentrazione dell'inibitore Tracciare sulla asse X in scala logaritmica 10 e fluorescenza sul Y su una scala lineare. Utilizzare una dispersionetrama impiegando una curva adatta come "log inibitore contro pendenza di risposta variabile (4 parametri)". punti dati Plot come media ± errore standard.

Representative Results

Risultati CARA attesi sono descritti in figura 2 e riassunti nella Tabella 1. Per replicare le cellule, il CARA viene eseguito in parallelo con uno standard MIC 90 saggi, e per i dosaggi non replicare, il CARA viene eseguito in parallelo con un microfono 90 test adattato che è accoppiato ad una fase di conseguenza. La concentrazione di agente di test che si traduce in un fallimento di Cara-fluorescenza a salire sopra i livelli di fondo è il CARA-MBC ≥99 (Figura 3a). Il "≥99" pedice indica che il CARA-MBC fornisce una concentrazione stimata di agente di test che dà origine a ≥2 log10 uccisione dei batteri (≥99% kill). Il saggio brodo MIC 90 liquido è in grado di discriminare tra battericida e attività batteriostatica e questa distinzione deve essere risolta da un saggio CFU. Diconvenzione, la soglia che distingue battericida da attività batteriostatica per crescita lenta micobatteri è di circa 2-3 log10 uccidere oltre 7 giorni 7,26. Dal momento che la gamma dinamica del CARA è anche 2-3 log 10 uccidere, il CARA in grado di fornire una stima del battericida o attività batteriostatica. Il CARA identifica facilmente alcuni principi attivi che replicano come batteriostatico a causa di fallimento di questi composti a diminuire CARA di fluorescenza a livelli di fondo (Figura 2). Tuttavia, alcuni composti con attività batteriostatica contro replicando M. tuberculosis hanno un potente effetto post-antibiotico, cioè continuano ad inibire la ricrescita dei batteri durante la fase di recupero anche in assenza del composto di riporto. Questo effetto può essere difficile da riconoscere nel test CARA. I composti sono sospettati di esercitare un effetto post-antibiotico nel caso si manifesti una "finestra statico", definita come uno spostamento> 4 volte al betwee destran le curve MIC e Cara (Figura 3b). La finestra statica indica che una molecola attiva contro replicare M. tuberculosis può essere batteriostatica invece battericida. In alcuni casi, le finestre statiche sono evidenti solo dopo il controllo di un asse Y espanso per CARA fluorescenza (Figura 3c e 3d). Cara e MIC dati 90 sono generalmente tracciate insieme (Figura 4). Dati rappresentativi per le molecole replicating- e non-replicanti-attivi testati da MIC 90 e CARA sono mostrati in figura 4. Ci sono 4 principali classi di attività per le molecole: 1) replicando battericida (dimostrata con isoniazide, figura 4a); 2) replicando batteriostatica (dimostrata con Linezolid, figura 4b); 3) non replicando battericida (dimostrata con ossifenbutazone, figura 4c); e, 4) replicating-attiva (batteriostatica o battericida) e non replicare battericida (dimostrata con PA-824, Figura 4d). Importante, le figure 4a e 4b dimostrare che mentre isoniazide e linezolid sembrano avere attività contro batteri non replica dal saggio MIC 90, CARA suggerisce sono inattivi nelle condizioni non-replicanti testati. Per verificare l'utilità del CARA nel predire l'impatto tempo e concentrazione-dipendente di una molecola, replicando M. smegmatis è stato esposto a concentrazioni crescenti di rifampicina (figure 5a – d), e in diversi momenti tra 1-24 ore, aliquote sono stati avvistati su piastre CARA. Questi dati hanno indicato che la rifampicina esercitato un impatto già nel 1 ora (figura 5a), visualizzata aumentando l'attività battericida tra 3 e 24 ore (figure 5b-d), e ucciso ≥2-3 log 10 a ~ 10 mg / ml per 24 ore (figura 5d). Un esperimento simile testando quadruplicates di un controllo del veicolo e 9 concentrazioni di farmaco, ed a 4 punti di tempo, sarebbe proibitivo mediante un saggio standard di CFU-based. Così, il CARA ha un ruolo nella scoperta di farmaci come mezzo throughput, meccanismo rapido per identificare profilo di attività di una molecola. previsioni CARA devono essere rigorosamente valutati utilizzando un test standard di CFU. L'aggiunta di 0,4% carbone attivo per piastre di Petri per l'analisi CFU può contribuire a migliorare la correlazione con i dati CARA, e può portare a precisare una conta, l'entità della correzione in genere proporzionale alla potenza del compound 21,22. Figura 1: Il CARA è uno strumento predittivo nella scoperta di nuovi farmaci. Questo diagramma riassume l'utilità del CARA comestadio intermedio tra lo screening di stupefacenti (lo screening unico punto, cherry-picking, e saggi di dose-risposta) e hit-to-lead test in termini di tempo (saggi CFU e l'identificazione di destinazione). [Adattato con permesso da Gold et al., Agenti antimicrobici e Chemioterapia 2015 7] Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2: Schema del test brodo MIC 90 e CARA con i risultati attesi. Entrambi MIC 90 e Cara risultati sono presentati per 8 attività possibili. La codifica a colori per MIC 90 pozzetti è bianco (nessuna crescita) e marrone (crescita), e per Cara micropiastre è nero (senza fluorescenza) e rosa (fluorescenza resorufina). I dati sono ipotetici. [Adattato con il permesso di oro et al., Agenti antimicrobici e Chemioterapia 2015 7] Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3: Specialized termini e definizioni CARA. La concentrazione battericida minima di una molecola con conseguente livelli di CARA di fluorescenza di fondo è il CARA-MBC ≥99 (a). In condizioni replicano, uno spostamento ≥4 volte della CARA-MBC ≥99 alla destra del MIC 90 indica spesso attività batteriostatica ed è chiamata una "finestra statica" (b). Per molecole con un potente effetto post-antibiotico, finestre statiche possono essere difficili da osservare (c) e richiedonoespansione del Y (CARA fluorescenza) per visualizzare (d). I dati sono ipotetici. [Adattato con permesso da Gold et al., Agenti antimicrobici e Chemioterapia 2015 7] Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 4: MIC illustrativa 90 e CARA risultati per selezionare i composti. I dati per il MIC 90 (rosso) e CARA (blu) sono dimostrati per (a) isoniazide (INH), (b) linezolid, (c) ossifenbutazone, e (d) PA-824. Wild-type M. tuberculosis H37Rv è stato esposto a composti per 7 giorni in condizioni standard o replicanti il modello multi-stress di non replica 7-9. MIC 90 saggi e CARA sono state eseguite come mostrato in Figura 2. [Adattato con permesso da Gold et al., Agenti antimicrobici e Chemioterapia 2015 7] Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 5: dose e attività di tempo-dipendente di rifampicina. Il non patogeni, in rapida crescita M. smegmatis è stato esposto a concentrazioni crescenti di rifampicina in condizioni di replicare e le aliquote sono stati campionati per CARA a 1 (a), 3 (b), 6 (c) e 24 (d) hr. [Adattato con permesso da Gold et al., Agenti antimicrobici e Chemioterapia 2015 7].com / files / ftp_upload / 54690 / 54690fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Tabella 1: Sintesi dei risultati attesi nella Figura 2. [Adattato con permesso da Gold et al., Agenti antimicrobici e Chemioterapia 2015 7] Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa tabella.

Discussion

Il CARA è stato originariamente sviluppato per alleviare un collo di bottiglia in progressione non-replicante o molecole dual-attivo 7. Il CARA serve come un passaggio intermedio tra la conferma concentrazione-risposta di visite di screening primario e saggi CFU (Figura 1). Dal momento che un singolo piatto CARA può sostituire numerose micropiastre necessarie per preparare diluizioni seriali, e le piastre di Petri agar contenenti usati per contare i batteri sopravvissuti, il CARA fornisce un mezzo semplice per valutare rapidamente l'attività di una molecola e testare più variabili in una sola volta, tra cui concentrazione del composto e il tempo di esposizione al composto.

In un saggio CFU, oltre a diluizioni seriali che spesso vanno fino a 10 6 -fold, la piastra di agar diluisce tipicamente molecole di un ulteriore ~ 800 volte (10 microlitri su telaio 8 ml in una piastra Petri tri-style). I nostri due stadi, test di screening multi-stress per composti attivi sulla non replicando M. tutuberculosis ha un fattore di riporto di 5 volte, cioè un composto presente in fase non replicando del test è presente un quinto della concentrazione originale nel escrescenza (replica) fase del test 6-9. I mitiga CARA riporto effetti sequestrando piccole molecole con carbone attivo. La maggior parte dei farmaci tubercolosi e candidati clinici impegnare carbone attivo rapidamente e completamente, ad eccezione del aminoglicosidi streptomicina 7. L'inclusione di carbone attivo in piastre di agar per saggi CFU impedito inibizione della crescita batterica, o di uccisione dei batteri, per protrarsi TMC207 e PA-824 7,21,22. Così, in virtù delle incorporando carbone attivo in agar batteriologica, CARA non dipende diluizioni seriali di cellule e agente di test.

Il CARA può aiutare a prevedere l'impatto batteriostatica o battericida di attivi replicare e l'impatto battericida di principi attivi non replicare. in generale, il CARA è utilizzato in parallelo con MIC standard di 90 saggi. Il potere predittivo del CARA deriva dal confronto tra MIC 90 e risultati CARA (Figura 2 e Tabella 1). Quando viene utilizzato per studiare gli agenti anti-micobatteri, il CARA può prevedere con precisione l'attività che si replica battericida (figura 4a), replicando batteriostatica (figura 4b), battericida non replicare (figura 4c), o doppio attiva (Figura 4d). Il CARA permette anche semplice valutazione dell'attività di un composto attraverso sia la dose e il tempo. Saggi CFU alone richiedono molto sforzo e materiale per valutare l'attività di un composto in un ampio intervallo di dosi e tempi, ma il compito diventa gestibile quando i risultati CARA restringere la gamma di condizioni a quelle in cui il composto è dimostrabile attiva (Figura 5 ).

Mentre il CARA ha utilità nella studiare l'azione di unNTI-infettivi sul micobatteri, il test ha limitazioni. Il CARA ha una gamma dinamica stretta (2-3 log 10) e non può essere appropriato per le condizioni in cui si anticipa non ci può essere più di 2-3 log10 uccisione dei batteri. previsioni CARA richiedono ulteriori studi utilizzando un metodo più rigoroso e preciso per contare il numero batteriche, come un saggio CFU. L'effetto post-antibiotico di alcuni anti-infettivi, come il PAS, può confondere i CARA come strumento predittivo di distinguere tra composti con battericida e attività batteriostatica contro replicando M. tuberculosis 7.

Ci sono due raccomandazioni per migliorare la qualità del CARA. In primo luogo, si deve versare CARA micropiastre rapidamente prima che i solidifica agar, pur mantenendo la precisione volumetrica ed evitare spruzzi al di fuori di pozzetti. Indipendentemente dal numero di piatti richiesti, si consiglia di fare da 0,5 a 1 L lotti di terreno per aiutare a mantenere la medium in forma liquida per la durata del tempo necessario per versare piastre. Cambiare suggerimenti spesso durante il riempimento micropiastre con il mezzo evita con punte parzialmente ostruiti. In secondo luogo, si deve minimizzare la variabilità artefatta della fluorescenza tra le repliche. Microcolonie micobatteri, in particolare per i micobatteri patogeni quali M. tuberculosis, spesso crescono in modo irregolare. Ad esempio, microcolonie crescono sulla superficie agar possono variare di dimensione, forma, altezza, o possono estendersi fino alle pareti interne dei pozzetti. Una sfida è quella di coprire tutti i bacilli in modo uniforme con il reagente in via di sviluppo. Un altro ostacolo è che dopo prolungata incubazione a 37 ° C, il solido mezzo batteriologica del CARA micropiastre può diventare secca e incline ad assorbire il reagente di sviluppo. Dal momento che il carbone attivo può legarsi resazurina e dissetare la fluorescenza 7, ci possono essere well-to-bene variazioni in base a pozzi asciutti assorbono la resazurina soluzione di sviluppo e il Charcoa attivatol tempra resazurina fluorescenza. Pre-bagnare la superficie di tutti i pozzetti della micropiastra CARA con PBS immediatamente prima di aggiungere il reagente sviluppo mitiga entrambi questi problemi – il reagente di sviluppo raggiungerà tutte le colonie micobatteri ugualmente, e il resazurina rimane sicuro sopra il carbone attivo. Il CARA può avere applicazioni in identificare e caratterizzare fenotipi di mutanti micobatteri, o in media di throughput saggi scoperta di nuovi farmaci per le altre specie batteriche.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Siamo grati a Kristin Burns-Huang per la revisione degli esperti del manoscritto e J. David Warren (Weill Cornell Medical College) per l'assistenza chimica durante lo sviluppo del CARA. Questo lavoro è stato supportato dal TB Drug Accelerator Programma della Fondazione Bill e Melinda, il Abby e Howard P. Milstein programma in Translational Medicine, e una Unità di Ricerca TB NIH (U19 AI111143). Il Dipartimento di Microbiologia e Immunologia è sostenuto dalla Fondazione William Randolph Hearst. SSK è stato sostenuto da NIH concedere K08AI108799.

Materials

Middlebrook 7H9 Beckton Dickinson 271310
Middlebrook 7H11 Beckton Dickinson 298810
Middlebrook OADC Beckton Dickinson 212351
BSA, heat shock Roche 3118958001
activated charcoal Sigma C5510
PBS, Dulbecco's Ca2+ and Mg2+ free Life Technologies / Invitrogen 14190-144
tween 80 Sigma P8074
tyloxapol Sigma T8761
sodium nitrite Sigma 2252
rifampicin Sigma R3501
6-bromo-1H-indazol-3-amine Alfa Aesar H34095
potassium phosphate monobasic   Sigma P0662
magnesium sulfate, heptahydrate  Sigma M1880
ferric ammonium citrate  Sigma F5879
zinc sulfate, heptahydrate Sigma Z0251
ammonium chloride  Sigma A9434
butyric acid, liquid Sigma B103500
resazurin powder Sigma R7017
sodium chloride  J.T. Baker 4058-01 
prepared resazurin solution  Invitrogen DAL1100
PCR stickers Denville B1212-5
spectrophotometer Molecular Devices M5
96-well, tissue culture treated microplates Corning 3595
reagent reservoirs VWR  89094-678
resealable plastic bags VWR  395-94602
14 mL Polypropylene round-bottom tubes Corning  352059
50 mL conical centrifuge tube Corning 352070
75 cm2 Cell culture flask Corning 431464U
clear, flat bottom tissue culture treated 96-well microplate Costar 3595
Prism 6 for OS X GraphPad http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
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References

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Gold, B., Roberts, J., Ling, Y., Lopez Quezada, L., Glasheen, J., Ballinger, E., Somersan-Karakaya, S., Warrier, T., Nathan, C. Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria. J. Vis. Exp. (118), e54690, doi:10.3791/54690 (2016).
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