التصور من الفحم آجار ريسازورين الفحص لشبه الكمي، متوسطة الإنتاجية تعداد مايكوباكتيريا
Summary
The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.
Abstract
هناك حاجة ملحة لاكتشاف والتقدم مكافحة العدوى أن تقصير مدة السل (TB) العلاج. المتفطرة السلية، العامل المسبب للمرض السل، هو صهر للعلاج الكيميائي السريع ودائم بسبب وجود عصيات العارضة المقاومة للأدوية المظهرية. ج harcoal في غار ص esazurin على ssay (كارا) تم تطويره كأداة لتشخيص الجزيئات النشطة التي اكتشفها حملات التحري الإنتاجية العالية ضد تكرار وتكرار غير-م السل. إدراج الفحم المنشط في وسط أجار باكتريولوجي يساعد على التخفيف من تأثير مركب المرحل، ويلغي شرط لمرحلة ما قبل تمييع الخلايا قبل اكتشاف على كارا microplates. بعد فترة حضانة 7-10 يوم عند 37 درجة مئوية، والحد من ريسازورين التي كتبها microcolonies الفطرية تنمو على سطح الآبار صفيحة كارا يسمح شبه الكمي ASSEssment أعداد البكتيريا عن طريق التألق. وكارا يكشف ما يقرب من 2-3 سجل 10 الفرق في أرقام البكتيرية وتتوقع تركيز مبيد للجراثيم الحد الأدنى مما يؤدي إلى ≥99٪ قتل البكتيريا (MBC ≥99). وكارا يساعد على تحديد ما إذا كان جزيء نشط على عصيات التي يتم تكرار وعدم تكرار، أو كليهما. التجارب الرائدة باستخدام كارا تسهيل تحديد أي تركيز وكيل الاختبار ووقت التعرض مركب يتطلب مزيدا من التقييم من قبل مستعمرة تشكيل وحدة (كفو) المقايسات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للكارا التكهن بما اذا كان نشاطا تكرار هي جراثيم أو جراثيم.
Introduction
المتفطرة السلية، العامل المسبب للمرض السل، ويمكن البقاء على قيد الحياة في مضيف في حالة كامنة الذي هو صهر في القضاء على المضادات الحيوية. ويعتقد المظهرية (غير وراثية) مقاومة السل م خلال العدوى أن ذلك يعود، في جزء منه، إلى السكان من عصيات غير تكرار 1،2. الطبقة صوامد أنا التي تظهر مقاومة المخدرات المظهرية تنشأ عن طريق آليات العشوائية نادرة بين أعداد كبيرة من الخلايا الحساسة للمخدرات 3،4. يتم تقديم الدرجة الثانية صوامد عدم تكرار من قبل عوامل مناعة المضيف، بما في ذلك الضغوط الخارجية في microenvironments اجه خلال العدوى. وضعنا مؤخرا نموذجا في المختبر من الدرجة الثانية غير تكرار استمرار لتقليد الظروف التي تواجه M. السل في الضامة وحبيبية تفعيلها. نموذج متعدد الإجهاد من الدرجة الثانية استمرار يتضمن الشروط التي بطء النمو، مثل مصدر الكربون الأحماض الدهنية، ونصف تمامانمو تي، مثل حموضة خفيفة (الرقم الهيدروجيني 5.0)، نقص الأكسجة (1٪ O 2)، وأكسيد النتريك وغيرها من السلع الوسيطة النيتروجين التفاعلي 5-9. فحص على نطاق واسع استخدام هذا النموذج متعدد الإجهاد عدم تكرارها، وغيرها من الدرجة الثانية نماذج غير تكرار، قد حقق الجزيئات المتنوعة التي توجه ضد الدولة غير تكرار-5-7،9-18 النشاط. وكشف نفس الشاشات غير تكرار أيضا فئة من الجزيئات التي تمتلك النشاط ضد كل من تكرار وغير تكرار العصيات، ويطلق عليه "نشاطا المزدوجة" 7،10،12،19،20.
اكتشاف دواء مضاد للجراثيم في مرحلة الكر والرصاص ينطوي توصيف واسعة من الجزيئات مرشح أن يختار يؤدي لتوسيع ضرب، وتوصيف الصيدلانية الأولي، تحديد الهدف، وفي الدراسات المجراة فعالية الأولية. وكخطوة مبكرة، تصنف مضادات العدوى عن طريق آلية للجراثيم أو جراثيم عملها، وإذا كان للجراثيم، ثقتل البكتيريا hether هو زمني و / أو تعتمد على التركيز. مقايسة مستعمرة تشكيل وحدة (كفو) هو الكلاسيكية، والذهب الطريقة القياسية لمعالجة هذه المسائل. في مقايسة كفو، تتعرض البكتيريا إلى وكيل الاختبار، وبعد ذلك يتم إزالة قسامات، تخفيفه بشكل متسلسل، وتنتشر aliquots من التخفيفات في المتوسط باكتريولوجي صلب وحضنت للسماح نمو الخلايا على قيد الحياة. وأخيرا، يتم تعداد المستعمرات البكتيرية. فحص كفو يتطلب أعدادا كبيرة من صفيحة معايرة دقيقة لتمييع الخلايا وبيتري لوحات تحتوي على أجار تعداد المستعمرات الباقين على قيد الحياة. ويعوق فحص كفو لبطء المتفطرات متزايد من قبل وقتهم بطيئة جيل (18-24 ساعة)، الأمر الذي يتطلب ما يقرب من 3 أسابيع للمستعمرات لتظهر على لوحات. وعلاوة على ذلك، مساحة حاضنة غالبا ما تكون محدودة في مجال السلامة الأحيائية على مستوى 3 مرافق متخصصة.
في حين مرهقة، المقايسات كفو هي المعيار الذهبي لتوصيف تأثير عدم تكرار وثنائية نشطة الجزيئات على mycobacterI ل. غير تكرار المقايسات تخضع لارتفاع معدلات إيجابية كاذبة تقترن إلى تكرار فحوصات لتقييم الخلوي 6-8 الجدوى العديد من. على سبيل المثال، أن المجمع قد النشاط قوية ضد تكرار السل م (أ "تكرار نشطة") قد تفشل لقتل أثناء الفحص غير تكرار، ولكن يمكن أن لا تزال تقتل بحكم المرحل من مرحلة غير تكرار لل فحص لمرحلة الانتعاش من الفحص، التي تجري في ظل الظروف التي تدعم التكرار ( "تكرار الظروف"). مركب تحمل أكثر يزيد من تعقيد تحليل الجزيئات النشطة المزدوجة، مما يجعل من الصعب التمييز بين ما إذا كان النشاط تقلد وعدم تكرار، أو المزدوجة.
لمعالجة القضايا المذكورة أعلاه، قمنا بتطوير ج harcoal في غار ص esazurin على ssay (كارا) ل، تعداد شبه الكمي السريع الأنواع المتفطرات مثل M. tuberculعمليات التفتيش الموقعي، M. البقرية BCG، وم اللخنية 7 (الشكلان 1 و 2). في المحاليل في المختبر، والفحم المنشط تعزل بسرعة أكثر من الأدوية القياسية المستخدمة لعلاج السل 7. الفحم المنشط في كارا microplates يربط المركبات التي يمكن أن تحمل أكثر من صفيحة الفحص، وهذه سمة من سمات كارا يلغي شرط لتمييع متسلسل محتويات فحص جيدا قبل تعداد 7،21،22. ويقدر عدد microcolonies الفطرية على سطح أجار من كارا microplates بإضافة ريسازورين، صبغة زرقاء، الذي شكل انخفاض، resorufin، هو جزيء الوردي الذي يقاس من قبل القياس الطيفي 23 مضان. كارا microplates يتم تحضين لمدة 1-2 أيام لاللخنية م و7-10 أيام لالمتفطرات بطيئة النمو مثل السل م و م البقرية BCG. وكارا لديها مجموعة ديناميكية الضيق ~ 2-3 سجل 10 زراعية مختلفةrence في هراري. عندما تستخدم بدلا من فحص كفو، وصفيحة كارا واحد يحل محل ما يقرب من خمس لوحات 96-جيدا تستخدم لالتخفيفات المتسلسلة ولوحات أجار على غرار ثلاثي 120 المستخدمة في الطلاء. تفسير البيانات CARA يساعد على توجيه الدراسات اللاحقة التي حضانة مرات وتركيز مركب تحديد لاختبار في المقايسات أكثر شاقة أساس كفو.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تطوير كارا أصلا لتخفيف عنق الزجاجة في التقدم عدم تكرار أو جزيئات ثنائية نشطة 7. يخدم كارا كخطوة وسيطة بين تأكيدا تركيز الاستجابة الزيارات الفرز الأولية وفحوصات كفو (الشكل 1). منذ لوحة كارا واحدة يمكن أن تحل محل العديد من صفيحة معايرة دقيقة اللازمة لإعداد التخفيفات المسلسل، ولوحات بيتري التي تحتوي على أجار تستخدم لتعداد البكتيريا على قيد الحياة، يوفر كارا وسيلة بسيطة لتقييم بسرعة النشاط جزيء واختبار متغيرات متعددة في آن واحد، بما في ذلك تركيز مركب والوقت من التعرض لهذا المركب.
في مقايسة كفو، بالإضافة إلى التخفيفات التسلسلية التي غالبا ما تتراوح ما يصل إلى 10 6 أضعاف، لوحة أجار عادة يخفف جزيئات من قبل ~ 800 أضعاف إضافية (10 ميكرولتر على 8 مل في طبق بيتري على غرار الثلاثية). لدينا على مرحلتين، متعدد الإجهاد فحص فحص للمركبات نشطة على غير متماثل م توberculosis لديه عامل المرحل من 5 أضعاف، وهذا هو، هدية مركب في مرحلة غير تكرار للفحص موجود في خمس تركيز الأصلي في (تكرار) مرحلة من مراحل الفحص 6-9 ثمرة. ويخفف من آثارها كارا تحمل أكثر الآثار من خلال عزل جزيئات صغيرة مع الفحم المنشط. معظم الأدوية السل والمرشحين السريري ربط الفحم المنشط بسرعة وبشكل كامل، مع استثناء من أمينوغليكوزيد الستربتومايسين 7. إدراج الفحم المنشط في لوحات أجار لفحوصات كفو منع تثبيط نمو البكتيريا، أو قتل البكتيريا، من خلال المرحل TMC207 وPA-824 7،21،22. وبالتالي، بحكم دمج الفحم المنشط في آغار باكتريولوجي، وكارا لا تعتمد على التخفيفات المسلسل من الخلايا وكيل الاختبار.
وكارا يمكن أن تساعد في التنبؤ تأثير جراثيم أو جراثيم تكرار الأصول وتأثير مبيد للجراثيم الأصول غير تكرار. في زيستخدم eneral، وكارا بالتوازي مع هيئة التصنيع العسكري القياسية 90 المقايسات. القوة التنبؤية لكارا يأتي من مقارنة MIC 90 والنتائج كارا (الشكل 2 والجدول 1). عندما تستخدم لدراسة العوامل المضادة للالفطرية، يمكن للكارا التنبؤ بدقة النشاط الذي تكرار للجراثيم (الشكل 4A)، تكرار للجراثيم (الشكل 4B)، غير تكرار للجراثيم (الشكل 4C)، أو ثنائي النشط (الشكل 4D). كما يسمح كارا تقييم بسيط من النشاط في المجمع عبر كل جرعة والوقت. المقايسات كفو وحدها تتطلب الكثير من الجهد والمادية لتقييم نشاط مركب على مجموعة واسعة من الجرعات والأوقات، ولكن المهمة يصبح التحكم فيها عندما تضيق النتائج كارا مجموعة من الشروط لتلك التي في مركب نشط بشكل واضح (الشكل 5 ).
في حين أن كارا له فائدة في دراسة العمل منالمعهد القومي للاتصالات العدوى على المتفطرات، وفحص والقيود. وكارا لديها مجموعة ديناميكية الضيق (2-3 سجل 10) وقد لا يكون مناسبا للظروف في أي واحد تتوقع قد لا يكون هناك أكثر من 2-3 سجل 10 قتل البكتيريا. وتتطلب التوقعات كارا مزيد من الدراسة باستخدام أسلوب أكثر صرامة ودقيقة لتعداد أرقام البكتيرية، مثل فحص كفو. تأثير ما بعد المضادات الحيوية لبعض مضادات العدوى، مثل نظام تقييم الأداء، ويمكن أن يربك كارا كأداة التنبؤية للتمييز بين المركبات مع جراثيم والنشاط للجراثيم ضد تكرار السل م 7.
هناك نوعان من التوصيات لتحسين نوعية كارا. أولا، لا بد من صب كارا بسرعة microplates قبل يتصلب أجار، مع الحفاظ على دقة الحجمي وتجنب الرش خارج microwells. بغض النظر عن عدد من لوحات المطلوبة، فإننا ننصح جعل 0،5-1 دفعات L المتوسطة للمساعدة في الحفاظ على مedium في شكل سائل لمدة من الوقت اللازم لتصب لوحات. تغيير نصائح في كثير من الأحيان في حين ملء microplates مع متوسط يتجنب استخدام نصائح انسداد جزئي. ثانيا، لا بد من تقليل التباين مصطنعة في مضان بين مكررات. microcolonies الفطرية، ولا سيما بالنسبة للالمتفطرات المسببة للأمراض مثل السل م، وغالبا ما تنمو بطريقة متقطعة. على سبيل المثال، microcolonies المتزايد على سطح أجار قد تختلف في الحجم والشكل والطول، أو قد تمتد حتى الجدران الداخلية من آبار صفيحة. وأحد التحديات هو لتغطية جميع العصيات بشكل موحد مع كاشف النامية. عقبة أخرى هي أنه بعد الحضانة لفترات طويلة عند 37 درجة مئوية، ومتوسط باكتريولوجي الصلب وكارا microplates قد تصبح جافة وعرضة للامتصاص كاشف النامية. منذ الفحم المنشط يمكن ربط ريسازورين وإرواء مضان 7، قد يكون هناك تباين جيد إلى جيد بسبب الآبار الجافة استيعاب ريسازورين تطوير الحل وcharcoa تفعيلهال تبريد ريسازورين مضان. قبل ترطيب سطح جميع الآبار كارا صفيحة مع برنامج تلفزيوني على الفور قبل أن يضيف الكاشف تطوير يخفف كل من هذه المشاكل – وكاشف تطوير الوصول إلى جميع المستعمرات المتفطرات على قدم المساواة، ويبقى ريسازورين بأمان فوق الفحم المنشط. قد يكون كارا التطبيقات في تحديد وتوصيف الظواهر من المسوخ المتفطرات، أو في المتوسطة الإنتاجية المقايسات اكتشاف المخدرات الأنواع البكتيرية الأخرى.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لكريستين بيرنز هوانغ لخبراء الاستعراض للمخطوطة وجيه ديفيد وارن (كلية وايل كورنيل الطبية) للحصول على المساعدة الكيمياء مع تطوير كارا. وأيد هذا العمل من قبل برنامج مسرع لأدوية السل من مؤسسة بيل وميليندا غيتس، وآبي وهاوارد برنامج ميلشتاين P. في الطب بالحركة، ووحدة بحوث السل المعاهد الوطنية للصحة (U19 AI111143). ويدعم قسم علم الأحياء الدقيقة وعلم المناعة من قبل مؤسسة ويليام راندولف هيرست. وأيد SSK من المعاهد الوطنية للصحة منحة K08AI108799.
Materials
| Middlebrook 7H9 | Beckton Dickinson | 271310 | |
| Middlebrook 7H11 | Beckton Dickinson | 298810 | |
| Middlebrook OADC | Beckton Dickinson | 212351 | |
| BSA, heat shock | Roche | 3118958001 | |
| activated charcoal | Sigma | C5510 | |
| PBS, Dulbecco's Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies / Invitrogen | 14190-144 | |
| tween 80 | Sigma | P8074 | |
| tyloxapol | Sigma | T8761 | |
| sodium nitrite | Sigma | 2252 | |
| rifampicin | Sigma | R3501 | |
| 6-bromo-1H-indazol-3-amine | Alfa Aesar | H34095 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
| magnesium sulfate, heptahydrate | Sigma | M1880 | |
| ferric ammonium citrate | Sigma | F5879 | |
| zinc sulfate, heptahydrate | Sigma | Z0251 | |
| ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
| butyric acid, liquid | Sigma | B103500 | |
| resazurin powder | Sigma | R7017 | |
| sodium chloride | J.T. Baker | 4058-01 | |
| prepared resazurin solution | Invitrogen | DAL1100 | |
| PCR stickers | Denville | B1212-5 | |
| spectrophotometer | Molecular Devices | M5 | |
| 96-well, tissue culture treated microplates | Corning | 3595 | |
| reagent reservoirs | VWR | 89094-678 | |
| resealable plastic bags | VWR | 395-94602 | |
| 14 mL Polypropylene round-bottom tubes | Corning | 352059 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Corning | 352070 | |
| 75 cm2 Cell culture flask | Corning | 431464U | |
| clear, flat bottom tissue culture treated 96-well microplate | Costar | 3595 | |
| Prism 6 for OS X | GraphPad | http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
References
- Nathan, C. Fresh approaches to anti-infective therapies. Sci. Transl. Medicine. 4 (140), 140-142 (2012).
- Gomez, J. E., McKinney, J. D. M. tuberculosis persistence, latency, and drug tolerance. Tuberculosis (Edinb). 84, 29-44 (2004).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
- Bigger, J. Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation. Lancet. , 497-500 (1944).
- Bryk, R., et al. Selective killing of nonreplicating mycobacteria. Cell Host Microbe. 3, 137-145 (2008).
- Gold, B., et al. Nonsteroidal anti-inflammatory drug sensitizes Mycobacterium tuberculosis to endogenous and exogenous antimicrobials. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 16004-16011 (2012).
- Gold, B., et al. Rapid, semi-quantitative assay to discriminate among compounds with activity against replicating or non-replicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 59, 6521-6538 (2015).
- Gold, B., Warrier, T., Nathan, C., Parish, T., Roberts, D. . Mycobacteria Protocols, Methods in Molecular Biology. 1285, 293-315 (2015).
- Warrier, T., et al. Identification of Novel Anti-mycobacterial Compounds by Screening a Pharmaceutical Small-Molecule Library against Nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Infect. Dis. , 580-585 (2015).
- Zheng, P., Chem, J. .. M. e. d. .., et al. Synthetic Calanolides with Bactericidal Activity Against Replicating and Nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Chem. , (2014).
- Darby, C. M., et al. Whole cell screen for inhibitors of pH homeostasis in Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 8, e68942 (2013).
- Darby, C. M., Nathan, C. F. Killing of non-replicating Mycobacterium tuberculosis by 8-hydroxyquinoline. J. Antimicrob. Chemother. 65, 1424-1427 (2010).
- de Carvalho, L. P., Darby, C. M., Rhee, K., Nathan, C. Nitazoxanide Disrupts Membrane Potential and Intrabacterial pH Homeostasis of Mycobacterium tuberculosis. ACS Med. Chem. Lett. 2, 849-854 (2011).
- Xie, Z., Siddiqi, N., Rubin, E. J. Differential antibiotic susceptibilities of starved Mycobacterium tuberculosis isolates. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4778-4780 (2005).
- Grant, S. S., et al. Identification of novel inhibitors of nonreplicating Mycobacterium tuberculosis using a carbon starvation model. ACS Chem. Biol. 8, 2224-2234 (2013).
- Zhang, M., et al. Streptomycin-starved Mycobacterium tuberculosis 18b, a drug discovery tool for latent tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 56, 5782-5789 (2012).
- Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem. Biol. 7, 1190-1197 (2012).
- Cho, S. H., et al. Low-oxygen-recovery assay for high-throughput screening of compounds against nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 51, 1380-1385 (2007).
- Franzblau, S. G., et al. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 92, 453-488 (2012).
- Rebollo-Lopez, M. J., et al. Release of 50 new, drug-like compounds and their computational target predictions for open source anti-tubercular drug discovery. PLoS One. 10, e0142293 (2015).
- Tasneen, R., et al. Contribution of the nitroimidazoles PA-824 and TBA-354 to the activity of novel regimens in murine models of tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 59, 129-135 (2015).
- Grosset, J. H., et al. Assessment of clofazimine activity in a second-line regimen for tuberculosis in mice. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 188, 608-612 (2013).
- Shiloh, M. U., Ruan, J., Nathan, C. Evaluation of bacterial survival and phagocyte function with a fluorescence-based microplate assay. Infect. Immun. 65, 3193-3198 (1997).
- Wang, F., et al. Identification of a small molecule with activity against drug-resistant and persistent tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E2510-E2517 (2013).
- Wayne, L. G., Hayes, L. G. An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence. Infect. Immun. 64, 2062-2069 (1996).
- Barry, A. L., et al. . Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents: approved guideline. 19, (1999).
