Araçlar Helix bozan, site-spesifik DNA içi çapraz bağlantılar işlenmesi Mimari Protein HMGB1 Rolü Eğitim için
Summary
Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.
Abstract
Yüksek mobilite grubu kutusu 1 (HMGB1) proteini, transkripsiyon, DNA replikasyonu ve DNA onarımı gibi genomunda çok önemli fonksiyonları, düzenlenmesinde görev olmayan bir histon mimari proteindir. HMGB1 standart B-DNA'ya daha yüksek afinite ile yapısal olarak bozuk DNA'ya bağlanır. Örneğin, biz HMGB1 DNA sarmalının bozulmalarına neden kovalent DNA iki ipliklerini bağlamak çapraz bağlantılar (ICLs), zincirler arası ve bırakılırsa unrepaired hücre ölümüne neden olabilir bağlanan bulundu. Bağlı sitotoksik potansiyel birçok ICL-uyarıcı maddeler, şu anda klinik olarak kemoterapötik maddeler olarak kullanılmaktadır. ICL oluşturucu maddeler belli baz dizilerine (örneğin, '-TA-3 5'psoralen için tercih edilen çapraz site) için tercihleri gösterirken, büyük ölçüde gelişigüzel bir şekilde DNA hasarına neden. Ancak, kovalent olarak dizi-spesifik DNA'ya bağlanan bir üçlü oluşturan oligonükleotid (TFO), ICL-indükleme maddesinin birleştirilmesi suretiyleşekilde, hedef DNA hasarı elde edilebilir. Burada, bir araç olarak kullanmak için bir mutasyon raportör plasmid üzerinde bir site-spesifik ICL oluşturmak için kovalent 8-Trimethylpsoralen (HMT) psoralen 5 'Bir 4'-hidroksimetil-4,5' ucuna üzerine konjuge edilmiş bir TFO kullanımı insan hücrelerinde HMGB1 karmaşık DNA lezyonlarının mimari değişiklik, işleme ve onarım incelemek için. Biz deneysel teknikler muhabiri plazmidler üzerinde TFO yönettiği ICLs hazırlamak ve kromatin immünopresipitasyon deneyleri kullanılarak bir hücresel bağlamda TFO yönettiği ICLs ile HMGB1 ilişkisini sorgulamak için açıklar. Buna ek olarak, HMGB1 ile psoralen çapraz bağlı plazmid üzerinde kişiye süpersarmal dönüş miktarı ölçülerek hasarlı DNA spesifik mimari modifikasyonu değerlendirmek için, DNA sarılma analizler açıklanmaktadır. Bu teknikler, TFO-yönlendirilmiş ICLs veya ilgi duyulan herhangi bir hücre hattı için diğer hedef DNA hasarının işlem ve onarımında yer alan diğer proteinler rollerini incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Üçlü-helikal bir yapı oluşturmak için 1-5 Hoogsteen-hidrojen bağlanması yoluyla bir dizi-spesifik şekilde oligonükleotid (TFOlar) bağlama dupleks DNA tripleks-oluşturan. Tripleks teknolojisi, transkripsiyon, DNA hasarı tamir ve gen hedefleme (referanslar 6-8 gözden) olarak biyomoleküler mekanizmalar, çeşitli sorgulamak için kullanılır olmuştur. TFOlar muhabiri plazmidler 9,10 site-spesifik zarar ikna etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Laboratuar ve diğerleri daha önce plazmid pSupFG1 5,10-12 ilgili supF genindeki bölgeye spesifik DNA kol içi çapraz bağlantılar (ICLs) ikna etmek için bir psoralen moleküle gergin bir TFO, AG30, kullandık. ICLs bu lezyonlar kovalent iki DNA ipliklerini çapraz gibi son derece sitotoksik olan ve unrepaired bırakılırsa, gen transkripsiyonunu bloke ve DNA replikasyonu makineleri 13,14 engelleyebilir. Çünkü bunların sitotoksik potansiyel ICL-uyarıcı maddeler tedavisinde kemoterapötik ilaçlar olarak kullanılmış olanKanser ve diğer hastalıkların 15. Bununla birlikte, insan hücrelerinde ICLs işleme ve tamir iyi anlaşılmamıştır. Bu nedenle, insan hücrelerinde ICLs işleme oluşumundaki mekanizmaların daha iyi anlaşılması ICL tabanlı kemoterapik rejimlerin etkinliğinin geliştirilmesi için yardımcı olabilir. TFO kaynaklı ICLs ve onarım ara DNA sarmalının önemli yapısal bozuklukların neden olma potansiyeli var. Bu tür bozulmalar kanonik B formu çift katlı DNA 16-20 daha yüksek afinite ile bozulmuş DNA'ya bağlanan, mimari proteinleri muhtemel hedeflerdir. Burada, kromatin immunoprecipitation (ChIP) psoralen-çapraz plazmidler üzerinde deneyler yoluyla insan hücrelerinde ICLs ile son derece bol bir mimari protein dernek, HMGB1 okudu ve insan psoralen-çapraz plazmid DNA topolojisini modüle HMGB1 bir rol tespit kanser hücre lizatları.
HMGB1 son derece bol ve yayg ifade non-onunkanonik B formu DNA 17-20 daha yüksek afinite ile hasar görmüş DNA ve alternatif olarak yapılandırılmış DNA alt tabakaları bağlanan sesi mimari proteini. HMGB1 örneğin transkripsiyon, DNA replikasyonu ve DNA onarımı 16,21-23 gibi çeşitli DNA metabolik süreçlerde, yer almaktadır. Daha önce HMGB1 yüksek afiniteyle 20 ile in vitro TFO yönelik ICLs bağlanan olduğunu göstermiştir. Dahası, HMGB1 olmaması bir nükleotid eksizyon onarım (EŞ) ko-faktör 23,24 olarak TFO yönelik ICLs mutajenik işleme ve tespit HMGB1 artış olduğunu göstermiştir. Son zamanlarda, HMGB1 insan hücrelerinde TFO yönelik ICLs ilişkili olan ve bu lezyonların olan alım NER protein, DA 16 bağlıdır olduğunu bulduk. DNA negatif süper NER 25 DNA lezyonları randımanlı bir şekilde uzaklaştırılmasını teşvik ettiği gösterilmiştir, ve HMGB1 TFO yönelik ICL içeren ÜLR'lerde tercihen negatif süper indükler bulmuşlardırBir NER ko-faktör olarak HMGB1 potansiyel rolü (ler) daha iyi anlaşılmasını sağlayan (non-hasarlı plazmidler yüzeylere göre) orta yüzeyler 16. ICLs işleme tamamen insan hücrelerinde anlaşılmamıştır; Bu nedenle, burada tarif edilen moleküler araçlar göre teknikler ve gelişmiş deneyler da kanser kemoterapi rejimleri etkinliğini arttırmak için kullanılabilir farmakolojik hedefler olarak hizmet verebilir ICL onarımında yer alan ilave edilen proteinlerin tanımlanması için yol açabilir.
Burada, etkili bir yaklaşım tartışılmıştır agaroz jel elektroforezi ile denaturasyon ile plazmid DNA TFO-yönlendirilmiş ICL oluşumu etkinliğini değerlendirmek. Bundan başka, TFO-yönlendirilmiş ICLs içeren plasmidler kullanılarak teknikler tarif edilmiştir Chip tahlilleri kullanarak hücresel bir çerçevede ICL hasarlı plazmidler ile HMGB1 ilişkisini belirlemek için. Ayrıca, bir uyduruk bir yöntem th tarafından tanıtıldı topolojik değişiklikleri incelemek içinözellikle insan hücre lizatlarında ICL hasarlı plazmid yüzeylerde e mimari proteini HMGB1, iki boyutlu agaroz jel elektroforez ile sarılma tahlilleri gerçekleştirilerek tespit edilmiştir. tarif edilen teknikler, insan hücrelerinde plazmid hedefli DNA hasarının işleme DNA tamiri ve mimari proteinlerin katılımı anlaşılmasını ilerletmek için de kullanılabilir.
Bu plazmid DNA, ve daha sonra plazmid çip ve sırasıyla, DNA topolojisi değiştirebilir lezyonlar ile ilişkilendirmek proteinler ve proteinleri belirlemek için deneyleri sarılma ilgili TFO-yönelimli site özel psoralen ICLs oluşumu için ayrıntılı protokoller tarif eder. Bu deneyler, diğer DNA hasar verici maddeler, TFOlar, plazmid alt tabakalar ve ilgi memeli hücre hatları ile gerçekleştirmek için modifiye edilebilir. Aslında, en azından bir olası benzersiz ve yüksek afiniteli TFO-bağlama bölgesi, insan genomunda 26 her açıklamalı geni içinde olduğunu göstermiştir. NasılBiz Mukherjee ve Vasquez 2016, 16 kullanılan gibi bir zamanda, netlik sağlamak için, insan U2OS hücrelerinde spesifik mutasyon haberci plazmid (pSupFG1) belirli bir psoralen-konjuge TFO (pAG30) kullanımı için bu teknikleri tarif.
Protocol
Representative Results
Discussion
TFO-yönlendirilmiş ICLs etkili bir şekilde oluşumuna iki önemli faktörlere bağlıdır: hedefine TFO bağlanması afinitesine bağlı olarak hedef DNA alt-tabaka ile TFO inkübasyon uygun tampon bileşenleri (örneğin, MgCI2) Birinci ve zaman (bağımlı dubleks ve konsantrasyonlar) kullanılan; ve ikinci, UVA uygun dozu (365 nm) ışınlama verimli psoralen çapraz bağlantılar oluşturmak için. Optimum tripleks oluşumu HPLC ya da jel saflaştırılmış TFOlar kullanılarak elde edilebili…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar yararlı tartışmalar için Vasquez laboratuvar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma [Kmv için CA097175, CA093279] Sağlık / Ulusal Kanser Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen; Kanser Önleme ve Texas Araştırma Enstitüsü [RP101501] ve. açık erişim ücret karşılığında Fon: National Institutes Sağlık / Ulusal Kanser Enstitüsü [KMV için CA093279].
Materials
| 5'HMT Psoralen-AG30 | Midland Certified Reagent Co., Midland, TX | Custom order | HPLC (or gel) purified |
| Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit | Cell signaling Inc. | 9003 | Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer. |
| GoTaq Green | Promega | M7122 | PCR master mix |
| HMGB1 antibody | Abcam | Ab18256 | |
| Wizard Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9281 | |
| Chloroquine-diphosphate salt | Sigma | C6628-50G | For two-dimensional agarose gel electrophoresis |
| EcoRI | New England BioLabs | R0101S | |
| GenePORTER transfection reagent | Genlantis | T201015 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Invitrogen | 38042-024 | |
| Blak-Ray long wave ultraviolet lamp | Upland, CA | B 100 AP | UVA lamp |
| EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 | Epigentek | EQC-1100 | Water bath sonicator |
| Mylar filter | GE Healthcare Life Sciences | 80112939 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6111 | |
| BIO-RAD Chemidoc | BIO-RAD | XRS+ system | DNA imaging system |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| 37% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775-25ML | Used for crosslinking |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | Cell culture media |
| PBS | ThermoFisher | 70013073 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 | Cell culture |
| Bromocresol green | Sigma-Aldrich | 114-359 | DNA loading dye |
| Siliconized tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | Low retention microfuge tube |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A74-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP24731 | |
| Photometer | InternationalLight Technologies | ILT1400-A | UVA dose measurement |
| Cell lines | |||
| Human U2OS osteosarcoma | ATCC | ATCC HTB-96 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Human cervical adenocarcinoma HeLa | ATCC | ATCC-CCL-2 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Proximal forward primer | 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac | ||
| Proximal reverse primer | 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg | ||
| Distal forward primer | 5′-aat acc gcg cca cat agc ag | ||
| Distal reverse primer | 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc |
References
- Moser, H. E., Dervan, P. B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation. Science. 238, 645-650 (1987).
- Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro. Science. 241, 456-459 (1988).
- Beal, P. A., Dervan, P. B. Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation. Science. 251, 1360-1363 (1991).
- Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides. J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).
- Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).
- Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis. Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).
- Chin, J. Y., Glazer, P. M. Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides. Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).
- Seidman, M. M., Glazer, P. M. The potential for gene repair via triple helix formation. J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).
- Vasquez, K. M. Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks. Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).
- Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation. Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).
- Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair. Science. 271, 802-805 (1996).
- Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis. Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).
- Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner. Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).
- Vare, D., et al. DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells. DNA repair. 11, 976-985 (2012).
- Huang, Y., Li, L. DNA crosslinking damage and cancer – a tale of friend and foe. Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).
- Mukherjee, A., Vasquez, K. M. HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells. Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).
- Bidney, D. L., Reeck, G. R. Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins. Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).
- Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1. Science. 243, 1056-1059 (1989).
- Jung, Y., Lippard, S. J. Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA. Biochemistry. 42, 2664-2671 (2003).
- Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA. Biochemistry. 44, 4188-4195 (2005).
- Das, D., Scovell, W. M. The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex. J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).
- Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA. Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).
- Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).
- Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks. DNA repair. 8, 865-872 (2009).
- Park, J. Y., Ahn, B. Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo. FEBS letters. , 174-178 (2000).
- Wu, Q., et al. High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes. Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).
- Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA. Biochemistry. 28, 5658-5664 (1989).
- Betous, R., et al. Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells. Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).
- Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).
- Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).
- Puri, N., et al. Minimum number of 2′-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides. Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).
- Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy. Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).
- Boulware, S. B., et al. Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer. Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).
