أدوات لدراسة دور HMGB1 البروتين المعماري في تجهيز اللولب تشويه، والحمض النووي الخاصة بالموقع Interstrand Crosslinks
Summary
Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.
Abstract
مربع المجموعة عالية التنقل 1 (HMGB1) البروتين هو بروتين المعماري غير بسيطة التي تشارك في تنظيم العديد من الوظائف الهامة في الجينوم، مثل النسخ، وتكرار الحمض النووي، وإصلاح الحمض النووي. يربط HMGB1 على الحمض النووي مشوهة هيكليا مع ارتفاع تقارب من لالكنسي B-DNA. على سبيل المثال، وجدنا أن HMGB1 يربط الحمض النووي interstrand crosslinks (ICLS)، التي تربط تساهمي فروع اثنين من الحمض النووي، وتسبب تشويه الحلزون، وإذا تركت دون اصلاح يمكن أن يسبب موت الخلايا. نظرا لقدرتها السامة للخلايا، وتستخدم العديد من وكلاء ICL الذي يحفز حاليا وكلاء العلاج الكيميائي في العيادة. بينما تظهر وكلاء ICL تشكيل تفضيلات لبعض متواليات قاعدة (على سبيل المثال، 5'-TA-3 "هو موقع يشابك المفضل لالسورالين)، فإنها تحفز إلى حد كبير التلف في الحمض النووي بطريقة عشوائية. ومع ذلك، من خلال اقتران تساهميا وكيل ICL الذي يحفز إلى النوكليوتيد تشكيل ثلاثي (TFO)، الذي يربط الحمض النووي في تسلسل محددالطريقة الحمض النووي من التلف المستهدفة يمكن أن يتحقق. هنا، ونحن نستخدم TFO مترافق تساهميا على 'نهاية ل4'-hydroxymethyl-4،5' 5 (همت) السورالين trimethylpsoralen-8، لتوليد ICL في مواقع محددة على البلازميد الطفرة مراسل لاستخدام أداة لدراسة تعديل المعماري ومعالجة وإصلاح آفات الحمض النووي المعقدة التي HMGB1 في الخلايا البشرية. وصفنا تقنيات تجريبية لإعداد ICLS موجهة TFO على البلازميدات مراسل، واستجواب جمعية HMGB1 مع ICLS موجهة TFO في سياق الخلوي باستخدام فحوصات مناعي لونين. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف فحوصات الحمض النووي supercoiling لتقييم تعديل المعماري معين من الحمض النووي التالف عن طريق قياس كمية من الأدوار superhelical أدخلت على البلازميد-السورالين crosslinked بواسطة HMGB1. هذه التقنيات يمكن استخدامها لدراسة دور البروتينات الأخرى المشاركة في تجهيز وإصلاح ICLS موجهة TFO أو غيرها من الأضرار الحمض النووي المستهدفة في أي خط من الخلايا في المصالح.
Introduction
ثلاثي تشكيل أليغنوكليوتيد] (TFOs) مأزق مزدوج الحمض النووي بطريقة تسلسل معين عن طريق الربط Hoogsteen الهيدروجين لتشكيل هياكل الثلاثي حلزونية 1-5. وقد استخدمت تقنية ثلاثي لاستجواب مجموعة متنوعة من الآليات الجزيئية البيولوجية، مثل النسخ، وإصلاح الحمض النووي من التلف، واستهداف الجين (إعادة النظر في المراجع 6-8). وقد استخدمت على نطاق واسع TFOs للحث على الضرر في مواقع محددة على البلازميدات مراسل 9،10. مختبرنا وغيرها قد استخدمت سابقا TFO، AG30، مربوط الى جزيء السورالين للحث على crosslinks DNA interstrand في مواقع محددة (ICLS) في الجين supF على pSupFG1 البلازميد 5،10-12. ICLS هي السامة للخلايا للغاية حيث أن هذه الآفات تشعبي تساهميا اثنين من خيوط الحمض النووي، وإذا تركت دون اصلاح، يمكن منع النسخ الجيني وتعيق آلية تكرار الحمض النووي 13،14. بسبب قدرتها السامة للخلايا، وقد استخدمت وكلاء ICL الذي يحفز كما أدوية العلاج الكيميائي في علاجمن السرطان وأمراض أخرى 15. ومع ذلك، وتجهيز وإصلاح ICLS في الخلايا البشرية ليست مفهومة جيدا. وبالتالي، فهم أفضل من الآليات التي تشارك في تجهيز ICLS في الخلايا البشرية يمكن أن تساعد على تحسين فعالية نظم العلاج الكيميائي على أساس ICL. ICLS يسببها TFO وسيطة إصلاح لهم لديها القدرة على التسبب في تشوهات هيكلية مهمة لولب الحمض النووي. هذه التشوهات هي أهداف محتملة للبروتينات المعمارية، الذي ربط الحمض النووي مشوهة مع تقارب أعلى من لالكنسي B-شكل مزدوج الحمض النووي 16-20. هنا، درسنا جمعية بروتين المعماري وفيرة للغاية، HMGB1 مع ICLS في الخلايا البشرية عبر مناعي لونين (رقاقة) فحوصات على البلازميدات-السورالين crosslinked والتعرف على دور HMGB1 في تحوير طوبولوجيا من البلازميد-السورالين crosslinked في الإنسان لست] الخلايا السرطانية.
HMGB1 هو وفيرة للغاية، وأعرب عن بتواجد مطلق غير لهلهجة البروتين المعماري الذي يربط الحمض النووي التالف وركائز الحمض النووي منظم بدلا من ذلك مع تقارب أعلى من الكنسي B-شكل الحمض النووي 17-20. وتشارك HMGB1 في العديد من عمليات التمثيل الغذائي الحمض النووي، مثل النسخ، وتكرار الحمض النووي، وإصلاح الحمض النووي 16،21-23. لقد أثبتنا سابقا أن HMGB1 بربط ICLS موجهة TFO في المختبر مع قابلية عالية 20. وعلاوة على ذلك، لقد أثبتنا أن عدم وجود HMGB1 زيادة تجهيز مطفرة من ICLS موجهة TFO وحددت HMGB1 بمثابة إصلاح النوكليوتيدات الختان (NER) المشارك عامل 23،24. مؤخرا، وجدنا أن HMGB1 يرتبط ICLS موجهة TFO في الخلايا البشرية والتوظيف لمثل هذه الآفات يعتمد على بروتين معدل الالتحاق الصافي، XPA 16. وقد تبين supercoiling السلبي من الحمض النووي للترويج لإزالة فعالة من آفات الحمض النووي التي كتبها NER 25، وقد وجدنا أن HMGB1 يدفع supercoiling سلبي تفضيلي على إخراج TFO اصق ICL التي تحتوي علىركائز منتصف (نسبة إلى ركائز غير التالفة البلازميدات) 16، توفير فهم أفضل للدور المحتمل (ق) من HMGB1 باعتبارها NER المشارك عامل. ليست مفهومة تجهيز ICLS تماما في الخلايا البشرية. وبالتالي، يمكن للتقنيات والمقايسات وضعت على أساس الأدوات الجزيئية الموصوفة هنا يؤدي إلى التعرف على البروتينات إضافية تشارك في إصلاح ICL، والتي بدورها قد تخدم أهدافا الدوائية التي يمكن استغلالها لتحسين فعالية نظم العلاج الكيميائي للسرطان.
هنا، نهج فعال لتقييم كفاءة تشكيل ICL موجهة TFO في البلازميد من تغيير طبيعة الاغاروز الكهربائي للهلام تم مناقشتها. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام البلازميدات التي تحتوي على ICLS موجهة TFO، تقنيات لتحديد جمعية HMGB1 مع البلازميدات التالفة ICL في سياق الخلوي باستخدام المقايسات رقاقة تعديل تم وصفها. بالإضافة إلى ذلك، وهي طريقة سطحي لدراسة التعديلات التي أدخلها الطوبوغرافية عشروقد تم تحديد ه البروتين المعماري HMGB1، وتحديدا على ركائز البلازميد التالفة ICL في الخلية لست] الإنسان عن طريق إجراء فحوصات supercoiling عبر ثنائية الأبعاد الكهربائي للهلام الاغاروز. وصف تقنيات يمكن استخدامها لتعزيز فهم إشراك إصلاح الحمض النووي والبروتينات المعمارية في معالجة التلف في الحمض النووي المستهدفة على البلازميدات في الخلايا البشرية.
وصفنا بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لتشكيل ICLS السورالين موجهة TFO-مواقع محددة على DNA البلازميد، ورقاقة البلازميد لاحق وsupercoiling فحوصات لتحديد البروتينات التي ترتبط بها مع الآفات، والبروتينات التي تغير طوبولوجيا الحمض النووي، على التوالي. يمكن تعديل هذه المقايسات لأداء مع غيرها من العوامل الحمض النووي المدمر، TFOs، ركائز البلازميد، وخطوط الخلايا الثديية من الفائدة. في الواقع، لقد أظهرنا أن هناك إمكانية فريدة وعالية تقارب موقع واحد على الأقل ملزم TFO داخل كل الجينات المشروح في الجينوم البشري (26). كيفمن أي وقت مضى، من أجل الوضوح، وصفنا هذه التقنيات لاستخدام TFO مترافق السورالين محددة (pAG30) على البلازميد الطفرة مراسل معين (pSupFG1) في خلايا U2OS الإنسان كما أننا قد تستخدم في موخرجي وفاسكيز، 2016 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
تشكيل كفاءة ICLS موجهة TFO هو يعتمد على عاملين هامين: أولا، مكونات عازلة الصحيح (على سبيل المثال، MgCl 2) وتستغرق وقتا من حضانة TFO مع الركيزة الحمض النووي هدفه (تعتمد على تقارب ملزمة للTFO إلى هدفه على الوجهين، وتركيزات المستخدمة). والثانية، والجرعة المناسبة للأشعة…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر أعضاء فاسكيز المختبر لإجراء مناقشات مفيدة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية لل/ معهد الصحة الوطني للسرطان [CA097175، CA093279 إلى KMV]. والوقاية من السرطان ومعهد بحوث من تكساس [RP101501]. تمويل مقابل رسوم الوصول المفتوح: المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني للسرطان [CA093279 إلى KMV].
Materials
| 5'HMT Psoralen-AG30 | Midland Certified Reagent Co., Midland, TX | Custom order | HPLC (or gel) purified |
| Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit | Cell signaling Inc. | 9003 | Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer. |
| GoTaq Green | Promega | M7122 | PCR master mix |
| HMGB1 antibody | Abcam | Ab18256 | |
| Wizard Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9281 | |
| Chloroquine-diphosphate salt | Sigma | C6628-50G | For two-dimensional agarose gel electrophoresis |
| EcoRI | New England BioLabs | R0101S | |
| GenePORTER transfection reagent | Genlantis | T201015 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Invitrogen | 38042-024 | |
| Blak-Ray long wave ultraviolet lamp | Upland, CA | B 100 AP | UVA lamp |
| EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 | Epigentek | EQC-1100 | Water bath sonicator |
| Mylar filter | GE Healthcare Life Sciences | 80112939 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6111 | |
| BIO-RAD Chemidoc | BIO-RAD | XRS+ system | DNA imaging system |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| 37% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775-25ML | Used for crosslinking |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | Cell culture media |
| PBS | ThermoFisher | 70013073 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 | Cell culture |
| Bromocresol green | Sigma-Aldrich | 114-359 | DNA loading dye |
| Siliconized tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | Low retention microfuge tube |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A74-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP24731 | |
| Photometer | InternationalLight Technologies | ILT1400-A | UVA dose measurement |
| Cell lines | |||
| Human U2OS osteosarcoma | ATCC | ATCC HTB-96 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Human cervical adenocarcinoma HeLa | ATCC | ATCC-CCL-2 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Proximal forward primer | 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac | ||
| Proximal reverse primer | 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg | ||
| Distal forward primer | 5′-aat acc gcg cca cat agc ag | ||
| Distal reverse primer | 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc |
References
- Moser, H. E., Dervan, P. B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation. Science. 238, 645-650 (1987).
- Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro. Science. 241, 456-459 (1988).
- Beal, P. A., Dervan, P. B. Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation. Science. 251, 1360-1363 (1991).
- Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides. J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).
- Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).
- Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis. Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).
- Chin, J. Y., Glazer, P. M. Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides. Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).
- Seidman, M. M., Glazer, P. M. The potential for gene repair via triple helix formation. J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).
- Vasquez, K. M. Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks. Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).
- Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation. Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).
- Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair. Science. 271, 802-805 (1996).
- Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis. Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).
- Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner. Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).
- Vare, D., et al. DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells. DNA repair. 11, 976-985 (2012).
- Huang, Y., Li, L. DNA crosslinking damage and cancer – a tale of friend and foe. Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).
- Mukherjee, A., Vasquez, K. M. HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells. Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).
- Bidney, D. L., Reeck, G. R. Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins. Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).
- Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1. Science. 243, 1056-1059 (1989).
- Jung, Y., Lippard, S. J. Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA. Biochemistry. 42, 2664-2671 (2003).
- Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA. Biochemistry. 44, 4188-4195 (2005).
- Das, D., Scovell, W. M. The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex. J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).
- Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA. Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).
- Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).
- Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks. DNA repair. 8, 865-872 (2009).
- Park, J. Y., Ahn, B. Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo. FEBS letters. , 174-178 (2000).
- Wu, Q., et al. High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes. Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).
- Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA. Biochemistry. 28, 5658-5664 (1989).
- Betous, R., et al. Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells. Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).
- Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).
- Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).
- Puri, N., et al. Minimum number of 2′-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides. Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).
- Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy. Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).
- Boulware, S. B., et al. Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer. Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).
