Tools om de rol van de Architectural eiwit HMGB1 Bestudeer in de verwerking van Helix vervormen, site-specifieke DNA InterStrand Crosslinks
Summary
Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.
Abstract
Hoge mobiliteit groep box 1 (HMGB1) eiwit is een niet-histon architectonische eiwit dat betrokken is bij het reguleren van vele belangrijke functies in het genoom, zoals transcriptie, DNA-replicatie en DNA herstel. HMGB1 bindt structureel vervormde DNA met hogere affiniteit dan canonieke B-DNA. Zo vonden we dat HMGB1 bindt aan DNA InterStrand crosslinks (ICL), die covalent verbinden de twee strengen van het DNA, veroorzaakt vervorming van de helix, en als links unrepaired celdood veroorzaken. Door hun cytotoxische reactie, worden meerdere ICL-inducerende middelen momenteel gebruikt als chemotherapeutische middelen in de kliniek. Terwijl ICL-vormende middelen tonen voorkeuren voor bepaalde basensequenties (bijvoorbeeld 5'-TA-3 'is de geprefereerde verknoping site voor psoraleen), zij grotendeels veroorzaken DNA-schade op een willekeurige manier. Echter, door covalente koppeling van het ICL-inducerende middel aan een triplex-vormende oligonucleotiden (TFO), dat bindt aan DNA op een sequentie-specifiekewijze kan target DNA beschadiging worden bereikt. Hier gebruiken we een TFO covalent geconjugeerd aan het 5 'uiteinde een 4'-hydroxymethyl-4,5', 8-trimethylpsoraleen (HMT) psoraleen een plaatsspecifieke ICL genereren op een mutatie-reporterplasmide te gebruiken als hulpmiddel de architectonische modificatie, verwerking en reparatie van complexe DNA laesies bestuderen door HMGB1 in humane cellen. We beschrijven experimentele technieken om TFO gerichte ICLs voor te bereiden op de reporter plasmiden, en de associatie van HMGB1 met de TFO gerichte ICLs ondervragen in een cellulair context met behulp van chromatine immunoprecipitatie assays. Daarnaast beschrijven we DNA supercoiling assays voor specifieke architecturale modificatie van het beschadigde DNA beoordelen door het meten van de hoeveelheid superhelische windingen ingevoerd op het psoraleen-verknoopte plasmide door HMGB1. Deze technieken kunnen worden gebruikt om de rol van andere eiwitten die betrokken zijn bij de verwerking en reparatie van TFO-gerichte ICLs of andere gerichte DNA schade in een cellijn van belang bestuderen.
Introduction
Triplex-vormende oligonucleotiden (TFOs) binden duplex DNA in een sequentie-specifieke manier via Hoogsteen-waterstofbruggen triple helix structuren 1-5 te vormen. Triplex technologie is gebruikt om diverse biomoleculaire mechanismen, zoals transcriptie, DNA schade herstel en gene targeting (beoordeeld in referenties 6-8) ondervragen. TFOs zijn uitgebreid gebruikt voor plaatsspecifieke schade aan reporterplasmiden 9,10 induceren. Ons laboratorium en anderen hebben eerder gebruik gemaakt van een TFO, TL30, vastgemaakt aan een psoraleen molecuul naar site-specifieke DNA InterStrand crosslinks (ICL) in de supF gen op het plasmide pSupFG1 5,10-12 induceren. ICLs zijn zeer cytotoxisch die laesies covalent verknopen de twee DNA-strengen, en indien niet gerepareerd kunnen gentranscriptie blokkeren en belemmeren de DNA-replicatiemachinerie 13,14. Vanwege hun cytotoxische potentieel hebben ICL-inducerende middelen gebruikt als chemotherapeutische middelen bij de behandelingkanker en andere ziekten 15. Echter, de verwerking en reparatie van ICL in menselijke cellen niet goed begrepen. Aldus kan een beter begrip van de bij de verwerking van ICL in menselijke cellen mechanismen bijdragen tot de werkzaamheid van ICL-gebaseerde chemotherapeutische regimes verbeteren. TFO-geïnduceerde ICLs met reparatie tussenproducten kan aanzienlijke structurele verstoringen veroorzaken aan de DNA helix. Dergelijke vervormingen zijn waarschijnlijk doelstellingen voor architecturale eiwitten, die binden aan vervormde DNA met een hogere affiniteit dan aan canonieke B-vorm duplex DNA 16-20. Hier hebben we de associatie van een veel voorkomt architecturaal eiwit, HMGB1 met ICL in humane cellen via chromatine immunoprecipitatie (ChIP) assays op psoraleen-verknoopte plasmiden en die een rol HMGB1 bij het moduleren van de topologie van het psoraleen-verknoopte nucleïnezuren in humane kanker cellysaten.
HMGB1 is een veel voorkomt en alomtegenwoordig tot expressie non-histone architectonische eiwit dat aan beschadigde DNA en als alternatief gestructureerde DNA substraten bindt met een hogere affiniteit dan canonieke B-vorm DNA 17-20. HMGB1 is betrokken bij diverse DNA metabole processen zoals transcriptie, DNA-replicatie, DNA herstel en 16,21-23. We hebben eerder aangetoond dat HMGB1 TFO bindt aan gerichte ICLs in vitro met een hoge affiniteit 20. Verder hebben we aangetoond dat gebrek aan HMGB1 verhoogde de mutagene behandeling van TFO-gerichte ICL en geïdentificeerd HMGB1 als NER (NER) cofactor 23,24. Onlangs hebben we gevonden dat HMGB1 is gekoppeld TFO-gerichte ICLs in humane cellen en de rekrutering van deze laesies is afhankelijk van de NER eiwit, XPA 16. Negatieve supercoiling van DNA is aangetoond dat het effectief verwijderen van DNA-laesies bevorderen door NER 25, en we hebben gevonden dat HMGB1 induceert negatieve supercoiling voorkeur op TFO-gerichte ICL-bevattende plasmid substraten (ten opzichte van niet-beschadigde plasmiden substraten) 16, een beter inzicht in de mogelijke rol (s) van HMGB1 als NER cofactor. De verwerking van ICL is niet volledig bekend in menselijke cellen; Zo kunnen de technieken en assays ontwikkeld op basis van de moleculaire methoden hierin beschreven leiden tot de identificatie van additionele eiwitten betrokken bij ICL herstel, waardoor farmacologische doelen die kunnen worden benut om de effectiviteit van chemotherapie regiems verbeteren dienen.
Hier wordt een effectieve benadering om de efficiëntie van TFO-gerichte vorming ICL in plasmide DNA beoordelen aan denaturerende agarose gelelektroforese werd besproken. Verder gebruik van de plasmiden die de TFO-gerichte ICL, technieken is bij HMGB1 met ICL-beschadigde plasmiden bepalen een cellulaire context modified ChIP assays zijn beschreven. Daarnaast is er een gemakkelijke methode om topologische wijzigingen die bij th bestuderene architecturaal eiwit HMGB1, specifiek op ICL-beschadigde plasmide substraten in menselijke cellysaten werd bepaald door het uitvoeren van assays supercoiling via tweedimensionale agarosegelelektroforese. De beschreven technieken kunnen worden gebruikt voor het begrip van de rol van DNA herstel en architecturale eiwitten in de verwerking van target DNA schade aan plasmiden in menselijke cellen bevorderen.
We beschrijven gedetailleerde protocollen voor de vorming van TFO-gerichte plaatsspecifieke psoraleen ICLs op plasmide-DNA, gevolgd plasmide chip en supercoiling assays voor eiwitten die associëren met de letsels en eiwitten die de DNA-topologie te veranderen identificeren, respectievelijk. Deze testen kunnen worden gemodificeerd te voeren met andere DNA beschadigende agentia, TFOs plasmide substraten en zoogdiercellijnen plaats. In feite hebben we aangetoond dat er ten minste één potentiële unieke hoge affiniteit TFO-bindingsplaats binnen elke geannoteerde genen in het menselijke genoom 26. Hoeooit, voor de duidelijkheid, beschreven deze technieken voor het gebruik van een specifieke psoraleen-geconjugeerd TFO (pAG30) op een specifieke mutatie-reporterplasmide (pSupFG1) in humane cellen als U2OS we Mukherjee & Vasquez, 2016 16 hebben gebruikt.
Protocol
Representative Results
Discussion
De efficiënte vorming van TFO-gerichte ICL is afhankelijk van twee belangrijke factoren: Ten eerste, goede buffercomponenten (bijv MgCl 2) en de incubatietijd van de TFO met een doel-DNA-substraat (afhankelijk van de bindingsaffiniteit van de TFO zijn doelstelling duplex, en de gebruikte concentraties); en ten tweede de juiste dosis UVA (365 nm) bestraling psoraleen verknopingen efficiënt vormen. Optimale triplex vorming kan worden bereikt door HPLC of gel gezuiverd TFOs. Onzuiverheden verontreinig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag de leden van Vasquez laboratorium bedanken voor nuttige discussies. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA097175, CA093279 om KMV]; en de Cancer Prevention and Research Institute van Texas [RP101501]. Financiering voor open access kosten: National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA093279 om KMV].
Materials
| 5'HMT Psoralen-AG30 | Midland Certified Reagent Co., Midland, TX | Custom order | HPLC (or gel) purified |
| Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit | Cell signaling Inc. | 9003 | Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer. |
| GoTaq Green | Promega | M7122 | PCR master mix |
| HMGB1 antibody | Abcam | Ab18256 | |
| Wizard Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9281 | |
| Chloroquine-diphosphate salt | Sigma | C6628-50G | For two-dimensional agarose gel electrophoresis |
| EcoRI | New England BioLabs | R0101S | |
| GenePORTER transfection reagent | Genlantis | T201015 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Invitrogen | 38042-024 | |
| Blak-Ray long wave ultraviolet lamp | Upland, CA | B 100 AP | UVA lamp |
| EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 | Epigentek | EQC-1100 | Water bath sonicator |
| Mylar filter | GE Healthcare Life Sciences | 80112939 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6111 | |
| BIO-RAD Chemidoc | BIO-RAD | XRS+ system | DNA imaging system |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| 37% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775-25ML | Used for crosslinking |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | Cell culture media |
| PBS | ThermoFisher | 70013073 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 | Cell culture |
| Bromocresol green | Sigma-Aldrich | 114-359 | DNA loading dye |
| Siliconized tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | Low retention microfuge tube |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A74-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP24731 | |
| Photometer | InternationalLight Technologies | ILT1400-A | UVA dose measurement |
| Cell lines | |||
| Human U2OS osteosarcoma | ATCC | ATCC HTB-96 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Human cervical adenocarcinoma HeLa | ATCC | ATCC-CCL-2 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Proximal forward primer | 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac | ||
| Proximal reverse primer | 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg | ||
| Distal forward primer | 5′-aat acc gcg cca cat agc ag | ||
| Distal reverse primer | 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc |
References
- Moser, H. E., Dervan, P. B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation. Science. 238, 645-650 (1987).
- Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro. Science. 241, 456-459 (1988).
- Beal, P. A., Dervan, P. B. Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation. Science. 251, 1360-1363 (1991).
- Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides. J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).
- Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).
- Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis. Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).
- Chin, J. Y., Glazer, P. M. Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides. Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).
- Seidman, M. M., Glazer, P. M. The potential for gene repair via triple helix formation. J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).
- Vasquez, K. M. Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks. Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).
- Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation. Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).
- Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair. Science. 271, 802-805 (1996).
- Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis. Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).
- Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner. Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).
- Vare, D., et al. DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells. DNA repair. 11, 976-985 (2012).
- Huang, Y., Li, L. DNA crosslinking damage and cancer – a tale of friend and foe. Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).
- Mukherjee, A., Vasquez, K. M. HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells. Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).
- Bidney, D. L., Reeck, G. R. Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins. Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).
- Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1. Science. 243, 1056-1059 (1989).
- Jung, Y., Lippard, S. J. Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA. Biochemistry. 42, 2664-2671 (2003).
- Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA. Biochemistry. 44, 4188-4195 (2005).
- Das, D., Scovell, W. M. The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex. J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).
- Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA. Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).
- Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).
- Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks. DNA repair. 8, 865-872 (2009).
- Park, J. Y., Ahn, B. Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo. FEBS letters. , 174-178 (2000).
- Wu, Q., et al. High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes. Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).
- Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA. Biochemistry. 28, 5658-5664 (1989).
- Betous, R., et al. Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells. Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).
- Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).
- Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).
- Puri, N., et al. Minimum number of 2′-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides. Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).
- Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy. Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).
- Boulware, S. B., et al. Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer. Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).
