Strumenti per studiare il ruolo di architettura HMGB1 proteine nella lavorazione di Helix deformante, DNA specifiche per sito interstrand Crosslinks
Summary
Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.
Abstract
casella di gruppo ad alta mobilità 1 proteine (HMGB1) è una proteina di architettura non-istone che è coinvolto nella regolazione di molte funzioni importanti nel genoma, come la trascrizione, la replicazione del DNA, e la riparazione del DNA. HMGB1 si lega al DNA strutturalmente distorto con maggiore affinità rispetto alla canonica B-DNA. Ad esempio, abbiamo scoperto che HMGB1 si lega al DNA interstrand legami crociati (ICL), che collegano covalentemente i due filamenti del DNA, causa la distorsione dell'elica, e se non riparati può causare la morte delle cellule. A causa della loro potenziale citotossico, diversi agenti ICL-inducono sono attualmente utilizzati come agenti chemioterapici in clinica. Mentre gli agenti ICL-formatura mostrano preferenze per alcune sequenze di base (ad esempio, 5'-TA-3 'è il sito di reticolazione preferito per psoraleni), che in gran parte inducono danni al DNA in modo indiscriminato. Tuttavia, covalentemente accoppiando l'agente ICL induce ad un oligonucleotide triplex-formatura (TFO), che si lega al DNA in una sequenza specificamodo, il danno al DNA mirato può essere raggiunto. Qui, usiamo un TFO covalente coniugata sulla 'fine a una 4'-idrossimetil-4,5' la 5 (HMT) psoralen, 8-trimethylpsoralen per generare un ICL site-specific su un plasmide mutazione giornalista da utilizzare come strumento di per studiare la modifica architettonica, trasformazione e riparazione delle lesioni del DNA complessi HMGB1 in cellule umane. Descriviamo tecniche sperimentali per preparare ICL TFO-dirette sui plasmidi reporter, e di interrogare l'associazione di HMGB1 con le ICL TFO-orientate in un contesto cellulare utilizzando saggi di immunoprecipitazione della cromatina. Inoltre, descriviamo saggi superavvolgimento DNA per valutare specifica modifica architettonica del DNA danneggiato misurando la quantità di giri superelica introdotte sul plasmide psoralen-reticolato da HMGB1. Queste tecniche possono essere utilizzate per studiare i ruoli di altre proteine coinvolte nella trasformazione e riparazione di ICL TFO-dirette o altri danni al DNA mirato in qualsiasi linea cellulare di interesse.
Introduction
Triplex di formazione oligonucleotidi (TFOS) DNA legano duplex in modo specifico per la sequenza tramite incollaggio Hoogsteen-idrogeno per formare strutture a tripla elica 1-5. La tecnologia Triplex è stata usata per interrogare una varietà di meccanismi biomolecolari, come la trascrizione, il DNA riparazione dei danni, e gene targeting (rivisto in riferimenti 6-8). TFOS sono stati ampiamente utilizzati per indurre un danno site-specific su plasmidi reporter 9,10. Il nostro laboratorio e altri hanno utilizzato in precedenza un TFO, AG30, legato ad una molecola psoraleni per indurre site-specific legami crociati interstrand DNA (ICL) nel gene supF sul plasmide pSupFG1 5,10-12. ICL sono altamente citotossico come queste lesioni reticolazione covalente i due filamenti di DNA, e se non riparati, possono bloccare la trascrizione del gene e impedire il meccanismo di replicazione del DNA 13,14. A causa della loro potenziale citotossico, agenti ICL-induttori sono stati utilizzati come farmaci chemioterapici nel trattamentodi cancro e altre malattie 15. Tuttavia, la trasformazione e la riparazione di ICL in cellule umane non è ben compreso. Così, una migliore comprensione dei meccanismi coinvolti nella trasformazione di ICLs in cellule umane può contribuire a migliorare l'efficacia dei regimi chemioterapici ICL-base. ICL TFO-indotte e dei loro intermedi di riparazione hanno il potenziale di causare notevoli distorsioni strutturali per l'elica del DNA. Tali distorsioni sono obiettivi probabili per le proteine di architettura, che si legano al DNA distorto con maggiore affinità rispetto a B-forma canonica duplex DNA 16-20. Qui, abbiamo studiato l'associazione di una proteina architettonica altamente abbondanti, HMGB1 con ICL in cellule umane tramite immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) saggi su plasmidi psoraleni reticolato e identificato un ruolo per HMGB1 nel modulare la topologia del DNA plasmide psoralen-reticolato in umana lisati cellulari di cancro.
HMGB1 è altamente abbondante e ubiquitariamente espresso non suatono proteina architettonica che si lega al DNA danneggiato e substrati di DNA in alternativa strutturati con affinità maggiore di B-forma canonica DNA 17-20. HMGB1 è coinvolta in numerosi processi metabolici del DNA, come la trascrizione, la replicazione del DNA, e la riparazione del DNA 16,21-23. Abbiamo precedentemente dimostrato che HMGB1 si lega al ICL TFO-diretti in vitro con alta affinità 20. Inoltre, abbiamo dimostrato che la mancanza di HMGB1 aumentato il trattamento mutageno di ICL TFO-diretti e HMGB1 identificato come una riparazione per escissione di nucleotidi (NER) co-fattore 23,24. Recentemente, abbiamo scoperto che HMGB1 è associata con ICL TFO-diretti nelle cellule umane e la sua assunzione di tali lesioni dipende dalla proteina NER, XPA 16. Superavvolgimento negativo del DNA ha dimostrato di promuovere la rimozione efficiente di lesioni del DNA da NER 25, e abbiamo scoperto che HMGB1 induce superavvolgimento negativo preferenzialmente su TFO-diretti plas ICL contenentisubstrati metà (relativi ai substrati non danneggiati plasmidi) 16, fornendo una migliore comprensione del ruolo potenziale (s) di HMGB1 come cofattore NER. Il trattamento dei ICLs non è pienamente compresa in cellule umane; in tal modo, le tecniche e le analisi sviluppate sulla base degli strumenti molecolari qui descritte potrebbe portare all'identificazione di proteine supplementari coinvolte nella riparazione ICL, che a loro volta possono servire come bersagli farmacologici che possono essere sfruttate per migliorare l'efficacia dei regimi chemioterapici cancro.
Qui, un approccio efficace per valutare l'efficienza della formazione ICL TFO-diretto nel DNA plasmidico da denaturazione agarosio elettroforesi su gel è stato discusso. Inoltre, utilizzando i plasmidi contenenti le ICL TFO-diretti, le tecniche per determinare l'associazione di HMGB1 con plasmidi ICL-danneggiati in un contesto cellulare utilizzando saggi ChIP modificati sono stati descritti. Inoltre, un metodo facile per studiare modifiche topologiche introdotte da the HMGB1 proteine architettonico, in particolare su substrati plasmide ICL-danneggiati in lisati cellulari umane è stata determinata eseguendo saggi superavvolgimento tramite elettroforesi bidimensionale agarosio. Le tecniche descritte possono essere utilizzate per favorire la comprensione del coinvolgimento di riparazione del DNA e delle proteine architetturali nel trattamento dei danni DNA mirate su plasmidi in cellule umane.
Descriviamo protocolli dettagliati per la formazione di TFO-diretti ICLs psoraleni sito-specifici sul DNA plasmidico, e successiva ChIP plasmid e superavvolgimento saggi per identificare le proteine che associano con le lesioni e proteine che alterano la topologia DNA, rispettivamente. Questi test possono essere modificati per eseguire con altri agenti che danneggiano il DNA, TFOS, substrati plasmidi, e linee cellulari di mammiferi di interesse. Infatti, abbiamo dimostrato che non vi è almeno un potenziale unico e ad alta affinità sito TFO vincolante all'interno di ogni gene annotata nel genoma umano 26. Comemai, per chiarezza, abbiamo descritto queste tecniche per l'uso di un TFO specifica psoralen-coniugato (pAG30) su uno specifico plasmide mutazione giornalista (pSupFG1) in cellule umane U2OS abbiamo utilizzato in Mukherjee & Vasquez 2016 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
La formazione efficiente ICLs TFO-diretti dipende da due fattori fondamentali: in primo luogo, i componenti corretta tampone (per esempio, MgCl 2) e il tempo di incubazione del TFO con il suo substrato DNA bersaglio (dipende l'affinità di legame del TFO al suo obiettivo duplex, e le concentrazioni utilizzate); e in secondo luogo, la corretta dose di UVA (365 nm) irradiazione per formare legami crociati psoraleni efficiente. formazione triplex ottimale può essere ottenuto utilizzando HPLC o gel …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio Vasquez per le discussioni utili. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA097175, CA093279 per KMV]; e la prevenzione del cancro e Research Institute del Texas [RP101501]. Il finanziamento per la carica di accesso aperto: National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA093279 per KMV].
Materials
| 5'HMT Psoralen-AG30 | Midland Certified Reagent Co., Midland, TX | Custom order | HPLC (or gel) purified |
| Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit | Cell signaling Inc. | 9003 | Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer. |
| GoTaq Green | Promega | M7122 | PCR master mix |
| HMGB1 antibody | Abcam | Ab18256 | |
| Wizard Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9281 | |
| Chloroquine-diphosphate salt | Sigma | C6628-50G | For two-dimensional agarose gel electrophoresis |
| EcoRI | New England BioLabs | R0101S | |
| GenePORTER transfection reagent | Genlantis | T201015 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Invitrogen | 38042-024 | |
| Blak-Ray long wave ultraviolet lamp | Upland, CA | B 100 AP | UVA lamp |
| EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 | Epigentek | EQC-1100 | Water bath sonicator |
| Mylar filter | GE Healthcare Life Sciences | 80112939 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6111 | |
| BIO-RAD Chemidoc | BIO-RAD | XRS+ system | DNA imaging system |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| 37% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775-25ML | Used for crosslinking |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | Cell culture media |
| PBS | ThermoFisher | 70013073 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 | Cell culture |
| Bromocresol green | Sigma-Aldrich | 114-359 | DNA loading dye |
| Siliconized tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | Low retention microfuge tube |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A74-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP24731 | |
| Photometer | InternationalLight Technologies | ILT1400-A | UVA dose measurement |
| Cell lines | |||
| Human U2OS osteosarcoma | ATCC | ATCC HTB-96 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Human cervical adenocarcinoma HeLa | ATCC | ATCC-CCL-2 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Proximal forward primer | 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac | ||
| Proximal reverse primer | 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg | ||
| Distal forward primer | 5′-aat acc gcg cca cat agc ag | ||
| Distal reverse primer | 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc |
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