Tools, um die Rolle der Architektur-Protein HMGB1 zur Untersuchung bei der Verarbeitung von Helix verzerrenden, ortsspezifische DNA-Quervernetzungen zwischen

Triplex Forming Oligonucleotide (TFOs) bind duplex DNA in einer sequenzspezifischen Art und Weise via Hoogsteen-Wasserstoffbrückenbindung tripelhelicalen ^1-5 Strukturen zu bilden. Triplex – Technologie verwendet, um eine Vielzahl von biomolekularen Mechanismen, wie Transkription, DNA – Schäden zu reparieren, und Gen – Targeting ( zusammengefasst in Referenzen ^6-8) zu befragen. TFOs wurden ^9,10 ausgiebig zu induzieren ortsspezifische Schäden an Reporter – Plasmide verwendet. Unser Labor und andere haben bislang auf einer TFO, AG30, gebunden an ein Psoralen Molekül ^5,10-12 ortsspezifische DNA – Quervernetzungen zwischen (ICL) im supF – Gen auf dem Plasmid pSupFG1 zu induzieren. ICLs sind hochcytotoxisch wie diese Läsionen kovalente Verknüpfung der beiden DNA – Stränge zu vernetzen, und wenn nicht repariert, kann Gen – Transkription blockieren und die DNA – Replikationsmaschinerie ^13,14 behindern. Wegen ihres zytotoxischen Potentials ICL-induzierende Mittel wurden als chemotherapeutische Wirkstoffe in der Behandlung verwendetvon Krebs und anderen Krankheiten , ^15. Jedoch ist die Bearbeitung und die Reparatur von ICLs in menschlichen Zellen nicht gut verstanden. So kann ein besseres Verständnis der bei der Verarbeitung von ICLs Mechanismen in menschlichen Zellen helfen, die Wirksamkeit der ICL-basierten chemotherapeutischen Therapien zu verbessern. TFO-induzierte ICLs und deren Reparatur Zwischenprodukte haben das Potenzial, erhebliche strukturelle Verzerrungen bei der DNA-Helix zu verursachen. Solche Verzerrungen sind wahrscheinlich Ziele für architektonische Proteine, die mit einer höheren Affinität zu verzerrten DNA binden als an kanonischen B-Form Duplex – DNA – ^16-20. Hier untersuchten wir die Assoziation eines hoch reichlich architektonischen Protein HMGB1 mit ICLs in menschlichen Zellen durch Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) Assays auf Psoralen netzten Plasmiden und identifiziert eine Rolle für HMGB1 in Modulieren der Topologie des Psoralen netzten Plasmid DNA in menschlichen Krebs Zelllysaten.

HMGB1 ist ein sehr reichlich vorhanden und ubiquitär exprimiert nicht seinTon architektonischen Protein , das als ^17-20 DNA kanonischen B-Form , um beschädigte DNA und alternativ strukturierten DNA – Substrate mit einer höheren Affinität bindet. HMGB1 ist ^16,21-23 in mehreren DNA – Stoffwechselprozesse, wie beispielsweise Transkription, DNA – Replikation und DNA – Reparatur beteiligt. Wir haben zuvor gezeigt , dass HMGB1 bindet an TFO-directed ICLs in vitro mit hoher Affinität ^20. Gerichtet TFO-ICLs und identifiziert HMGB1 als Nukleotidexzisionsreparatur (NER) Cofaktor ^23,24 weiteren haben wir gezeigt , dass der Mangel an HMGB1 des mutagenen Verarbeitung erhöht. Vor kurzem haben wir festgestellt , dass mit HMGB1 TFO-directed ICLs in menschlichen Zellen und ihre Einstellung auf solche Läsionen auf dem NER – Protein, XPA ¹⁶ abhängig zugeordnet ist. Negative Supercoiling von DNA wurde von NER ^25, und wir haben festgestellt , die effiziente Entfernung von DNA – Läsionen zu fördern gezeigt , dass HMGB1 negativen supercoiling induziert bevorzugt auf TFO-directed ICL enthaltenden plasmid Substrate (bezogen auf nicht-beschädigten Plasmiden Substrate) ^16, um ein besseres Verständnis der möglichen Rolle (n) von HMGB1 als NER Cofaktor bereitstellt. Die Verarbeitung von ICLs ist nicht vollständig in menschlichen Zellen zu verstehen; Somit entwickelt die Techniken und Assays auf der Basis der molekularen Werkzeugen hierin beschrieben könnte in ICL-Reparatur beteiligt zur Identifikation von zusätzlichen Proteinen führen, die wiederum dienen als pharmakologische Ziele, die ausgenutzt werden können, um die Wirksamkeit von Krebs-Chemotherapie zu verbessern.

Hierbei ist ein wirksamer Ansatz, die Effizienz der TFO-directed ICL Bildung in Plasmid-DNA zu beurteilen durch Agarosegelelektrophorese denaturierenden diskutiert. Ferner Techniken unter Verwendung der Plasmide, die die TFO-gerichtete ICLs enthält, die Assoziation von HMGB1 mit ICL geschädigten Plasmide in einem zellulären Kontext mit modifizierten ChIP Assays zu bestimmen, wurden beschrieben. Zusätzlich zu eine einfache Methode topologische Modifikationen durch th eingeführt studierene architektonischen Protein HMGB1, insbesondere on-ICL beschädigt Plasmid Substrate in menschlichen Zell-Lysaten wurde durch Durchführung supercoiling Assays über zweidimensionale Agarose-Gelelektrophorese bestimmt. Die beschriebenen Techniken können das Verständnis der Beteiligung von DNA-Reparatur und architektonischen Proteine ​​in der Verarbeitung von gezielten DNA-Schädigung auf Plasmiden in menschlichen Zellen zu fördern verwendet werden.

Wir beschreiben detaillierte Protokolle für die Bildung von TFO-gerichtete ortsspezifische Psoralen ICLs auf Plasmid-DNA und anschließende Plasmid ChIP und Supercoiling Assays Proteine ​​zu identifizieren, die mit den Läsionen assoziiert, und Proteine, die die DNA-Topologie zu verändern, respectively. Diese Assays können modifiziert werden, um mit anderen DNA-schädigenden Mitteln durchzuführen, TFOs Plasmid Substrate und Säugerzelllinien von Interesse. In der Tat haben wir gezeigt , dass es mindestens eine potentielle einzigartige und hochaffinen TFO-Bindungsstelle innerhalb jedes kommentierten Gen im menschlichen Genom ist ^26. Wiehaupt, aus Gründen der Klarheit beschrieben wir diese Techniken für die Verwendung eines spezifischen Psoralen-konjugiertes TFO (pAG30) auf einer spezifischen Mutation Reporterplasmid (pSupFG1) in menschlichen U2OS – Zellen , wie wir in Mukherjee & Vasquez 2016 ¹⁶ genutzt haben.