ツールは、Helix歪曲、部位特異的DNA鎖間架橋の処理に建築タンパク質HMGB1の役割を研究するために
Summary
Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.
Abstract
高移動度グループボックス1（HMGB1）タンパク質は、転写、DNA複製、DNA修復などのゲノム中の多くの重要な機能を調節することに関与する非ヒストン建築タンパク質です。 HMGB1は、標準的なB-DNAへのより高い親和性を有する構造的に歪んだDNAに結合します。例えば、我々は、HMGB1がDNAに結合することがわかった共有結合、DNAの2本鎖をリンクらせんの歪みを引き起こし、未修復のままの場合は細胞死を引き起こす可能性が架橋（のICL）を、インター。それらの細胞毒性ポテンシャルを、いくつかのICL誘導剤は、現在臨床での化学療法剤として使用されます。 ICL形成剤は、特定の塩基配列の環境（ 例えば、5'-TA-3 'ソラレンのための好ましい架橋部位である）を示すが、それらは主に無差別様式でDNA損傷を誘発します。しかし、共有結合的に配列特異的にDNAに結合する三重鎖形成オリゴヌクレオチド（TFO）、にICL誘導剤を結合することにより、方法は、標的DNAの損傷を達成することができます。ここでは、ツールとして使用するために変異レポータープラスミド上のサイト固有のICLを生成するために、共有結合、8トリメチルソラレン（HMT）ソラレン5 '、4'-ヒドロキシメチル-4,5-へ'末端に結合させTFOを使用しますアーキテクチャの変更、処理、およびヒト細胞におけるHMGB1による複雑なDNA損傷の修復を研究します。私たちは、レポータープラスミドにTFO指向のICLを調製するための、およびクロマチン免疫沈降アッセイを用いて、細胞の状況にTFO指向のICLとHMGB1の関連を調べるために実験技術について説明します。また、我々はHMGB1によってソラレン架橋プラスミドに導入超らせん巻きの量を測定することにより、損傷を受けたDNAの特定の建築変更を評価するために、DNAの超らせんのアッセイが記載されています。これらの技術は、TFO指向のICLまたは目的の任意の細胞株における他の標的DNA損傷処理および修復に関与する他のタンパク質の役割を研究するために使用することができます。
Introduction
三重らせん構造1-5を形成するためのトリプレックス形成オリゴヌクレオチドフーグスティーン水素結合を介した配列特異的様式で（のTFO）結合二本鎖DNA。三重技術は、転写、DNA損傷修復、ならびに遺伝子ターゲティング（参考文献6-8に概説）などの生体分子メカニズムの多様を調べるために使用されています。 TFOは、レポータープラスミド9,10-の部位特異的な損傷を誘導するために広く使用されています。私たちの研究室などは以前に、プラスミドpSupFG1 5,10-12にsupF遺伝子に部位特異的なDNAの間架橋（のICL）を誘導するためにソラレン分子につながTFO、AG30を、使用しています。これらの病変は、共有結合で2本のDNA鎖を架橋として、および未修復のままの場合のICLは、遺伝子の転写を阻止し、DNA複製機構13,14を妨げることができ、非常に細胞毒性です。なぜなら、それらの細胞毒性ポテンシャルを、ICL誘導剤は、治療において化学療法剤として使用されています癌やその他の病気15の。しかしながら、ヒト細胞中でのICLの加工及び修復は十分に理解されていません。したがって、ヒト細胞中のICLの処理に関与するメカニズムのより良い理解は、ICLベースの化学療法レジメンの有効性を改善するのに役立ち得ます。 TFO誘発性のICLとその修復中間体は、DNAヘリックスに有意な構造的歪みを引き起こす可能性を持っています。このような歪みは、標準的なB型二重鎖DNA 16-20よりも高い親和性で歪んだDNAに結合建築タンパク質、その考えられる標的です。ここでは、クロマチン免疫沈降（チップ）ソラレン架橋のプラスミド上のアッセイによって、ヒト細胞中でのICLと非常に豊富な建築タンパク質の結合、HMGB1を学び、ヒトにおいてソラレン架橋プラスミドDNAのトポロジーを調節することでHMGB1の役割を同定し癌細胞溶解物。
HMGB1は非常に豊富かつ普遍的に発現された非彼損傷したDNAに結合するトーン建築タンパク質および標準的なB型DNA 17-20よりも高い親和性を持つ代わりに構造化されたDNA基質。 HMGB1は、転写、DNA複製、DNA修復16,21-23などのいくつかのDNA代謝過程に関与しています。我々は以前HMGB1は高親和性20でインビトロで TFO指向のICLに結合することを実証しています。さらに、我々は、HMGB1の欠如はTFO指向のICLの変異原処理を増加し、ヌクレオチド除去修復（NER）補因子23,24としてHMGB1を同定していることを実証しました。最近、我々は、HMGB1がヒト細胞においてTFO向けのICLに関連付けられており、このような病変への募集はNERタンパク質、XPA 16に依存していることを発見しました。 DNAの負の超らせんをNER 25によりDNA損傷の効率的な除去を促進することが示されており、我々は、HMGB1はTFO指向ICL含有のPLAに優先的に負の超らせん形成を誘導することを発見しました（非損傷プラスミド基質に対して）、中間基板16、NER補因子としてHMGB1の潜在的な役割（複数可）のより良い理解を提供します。 ICLの処理は、完全ヒト細胞では理解されていません。このように、本明細書中に記載の分子ツールに基づいて開発された技術およびアッセイは、順番に、がん化学療法レジメンの有効性を改善するために利用することができる薬理学的標的として役立つ可能性がある、ICL修復に関与する追加のタンパク質の同定につながる可能性があります。
ここでは、アガロースゲル電気泳動を変性させることによって、プラスミドDNAでTFO指向ICL形成の効率を評価するための効果的なアプローチが検討されています。さらに、TFO指向のICLを含むプラスミドを用いて、修飾のChIPアッセイを用いて細胞の文脈でICL損傷プラスミドでHMGB1の結合を決定するための技術が記載されています。また、容易な方法は、番目によって導入されたトポロジカル修正を研究します特にヒト細胞溶解物中のICL損傷プラスミド基板上の電子建築タンパク質HMGB1は、二次元のアガロースゲル電気泳動を介して、スーパーコイルアッセイを実施することによって決定されています。説明される技術は、ヒト細胞中でのプラスミドの標的DNA損傷の処理において、DNA修復および建築タンパク質の関与の理解を促進するために使用することができます。
我々は、プラスミドDNA、及びその後のプラスミドチップそれぞれ、DNAのトポロジーを改変病変と会合するタンパク質、およびタンパク質を同定するためのアッセイをスーパーコイルのTFO-部位特異的ソラレンのICLを形成するための詳細なプロトコルを記述する。これらのアッセイは、他のDNA損傷剤、のTFO、プラスミド基質、および目的の哺乳動物細胞株を使用して実行するように変更することができます。実際に、我々はヒトゲノム26内のすべての注釈付き遺伝子内の少なくとも一つの潜在的な固有かつ高親和性のTFO結合部位が存在することを示しています。どうやって我々はムカジー＆バスケス、2016年16で利用してきたように、これまで、分かりやすくするために、我々は人間のU2OS細胞に特異的な変異レポータープラスミド（pSupFG1）上の特定のソラレン共役TFO（pAG30）を使用するためにこれらの技術を説明しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
そのターゲットに依存TFOの結合親和性に応じて、その標的DNA基質（とまず、適切な緩衝成分（ 例えば 、 塩化マグネシウム）とTFOのインキュベーション時間：TFO指向のICLの効率的な形成は、二つの重要な要因に依存していますデュプレックス、および使用される濃度）。第二、UVA（365 nm）の照射の適切な用量は、効率的にソラレン架橋を形成します。最適な三重らせん形成は?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、有用な議論のためにバスケスの研究室のメンバーに感謝したいと思います。この作品は、健康/国立癌研究所【KMVにCA097175、CA093279]の国立研究所によってサポートされていました。がん予防テキサス州の研究所[RP101501]と。健康/国立がん研究所の国立研究所[KMVにCA093279]：オープンアクセスチャージのための資金。
Materials
| 5'HMT Psoralen-AG30 | Midland Certified Reagent Co., Midland, TX | Custom order | HPLC (or gel) purified |
| Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit | Cell signaling Inc. | 9003 | Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer. |
| GoTaq Green | Promega | M7122 | PCR master mix |
| HMGB1 antibody | Abcam | Ab18256 | |
| Wizard Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9281 | |
| Chloroquine-diphosphate salt | Sigma | C6628-50G | For two-dimensional agarose gel electrophoresis |
| EcoRI | New England BioLabs | R0101S | |
| GenePORTER transfection reagent | Genlantis | T201015 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Invitrogen | 38042-024 | |
| Blak-Ray long wave ultraviolet lamp | Upland, CA | B 100 AP | UVA lamp |
| EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 | Epigentek | EQC-1100 | Water bath sonicator |
| Mylar filter | GE Healthcare Life Sciences | 80112939 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6111 | |
| BIO-RAD Chemidoc | BIO-RAD | XRS+ system | DNA imaging system |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| 37% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775-25ML | Used for crosslinking |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | Cell culture media |
| PBS | ThermoFisher | 70013073 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 | Cell culture |
| Bromocresol green | Sigma-Aldrich | 114-359 | DNA loading dye |
| Siliconized tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | Low retention microfuge tube |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A74-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP24731 | |
| Photometer | InternationalLight Technologies | ILT1400-A | UVA dose measurement |
| Cell lines | |||
| Human U2OS osteosarcoma | ATCC | ATCC HTB-96 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Human cervical adenocarcinoma HeLa | ATCC | ATCC-CCL-2 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Proximal forward primer | 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac | ||
| Proximal reverse primer | 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg | ||
| Distal forward primer | 5′-aat acc gcg cca cat agc ag | ||
| Distal reverse primer | 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc |
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