Des outils pour étudier le rôle de l'architecture Protein HMGB1 dans le traitement des Helix effets de distorsion, l'ADN spécifique du site InterStrand Crosslinks
Summary
Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.
Abstract
Boîte de high mobility group 1 (HMGB1) protéine est une protéine non-histone architecturale qui est impliquée dans la régulation de nombreuses fonctions importantes dans le génome, tels que la transcription, la réplication de l'ADN et la réparation d'ADN. HMGB1 se lie à l'ADN structurellement déformée avec une affinité supérieure à celle de l'ADN-B canonique. Par exemple, nous avons constaté que la HMGB1 se lie à l'ADN (reticulations interbrins CIST), qui lient de manière covalente les deux brins de l'ADN, provoquent la déformation de l'hélice, et si on les laisse non réparée peut provoquer la mort cellulaire. En raison de leur potentiel cytotoxique, plusieurs agents ICL-inductrices sont actuellement utilisés comme agents chimiothérapeutiques dans la clinique. Alors que les agents ICL formant montrent des préférences pour certaines séquences de base (par exemple, 5'-TA-3 'est le site de réticulation préféré pour psoralène), ils induisent en grande partie des dommages de l' ADN d'une manière aveugle. Cependant, en couplant de façon covalente l'agent induisant la LSC à un oligonucléotide formant triplex (TFO), qui se lie à l'ADN dans une séquence spécifiqueAinsi, des dommages de l'ADN cible peut être atteint. Ici, nous utilisons un TFO conjugué de manière covalente sur 'extrémité à un 4'-hydroxyméthyl-4,5' 5 (HMT) psoralène, 8-triméthylpsoralène pour générer un ICL site spécifique sur un plasmide mutation-reporter pour l'utiliser comme un outil pour étudier la modification architecturale, le traitement et la réparation des lésions de l'ADN complexes par HMGB1 dans les cellules humaines. Nous décrivons les techniques expérimentales pour préparer ICL TFO dirigés sur des plasmides rapporteurs et d'interroger l'association de HMGB1 avec les ICL TFO dirigées dans un contexte cellulaire en utilisant des tests chromatine immunoprécipitation. En outre, nous décrivons des tests de surenroulement de l'ADN pour évaluer la modification d'architecture spécifique de l'ADN endommagé en mesurant la quantité de tours superhélices introduits sur le psoralène réticulé plasmide par HMGB1. Ces techniques peuvent être utilisées pour étudier les rôles des autres protéines impliquées dans le traitement et la réparation des ICL TFO dirigées ou d'autres dommages à l'ADN ciblé dans toute lignée cellulaire d'intérêt.
Introduction
Formant des triplex d' oligonucléotides (OFT) un ADN duplex se lient d'une manière spécifique d' une séquence via une liaison de Hoogsteen d'hydrogène pour former des structures en triple hélice 1-5. La technologie triplex a été utilisé pour interroger une variété de mécanismes biomoléculaires, tels que la transcription, la réparation des dommages de l' ADN et le ciblage génique (passé en revue dans les références 6-8). OFT ont été largement utilisés pour induire des dommages spécifiques au site sur les plasmides rapporteurs 9,10. Notre laboratoire et d' autres ont déjà utilisé un TFO, AG30, attaché à une molécule de psoralène pour induire l' ADN interbrins réticulations spécifiques du site (de ICL) dans le gène supF sur le pSupFG1 plasmidique 5,10-12. ICL sont hautement cytotoxique que ces lésions réticulent de manière covalente les deux brins d'ADN, et si elle unrepaired, peut bloquer la transcription des gènes et empêcher la réplication des machines d'ADN 13,14. En raison de leur potentiel cytotoxique, des agents induisant ICL ont été utilisés comme médicaments chimiothérapeutiques dans le traitementdu cancer et d' autres maladies 15. Cependant, le traitement et la réparation des ICL dans les cellules humaines ne sont pas bien comprises. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le traitement des ICL dans les cellules humaines peut aider à améliorer l'efficacité des régimes chimiothérapeutiques à base d'ICL. ICL TFO-induits et leurs intermédiaires de réparation ont le potentiel de provoquer des distorsions structurelles importantes à l'hélice de l'ADN. De telles distorsions sont des cibles probables pour les protéines d' architecture, qui se lient à l' ADN déformé avec une affinité supérieure à canonique B-forme duplex ADN 16-20. Ici, nous avons étudié l'association d'une protéine architecturale très abondante, HMGB1 avec ICL dans les cellules humaines par l'intermédiaire d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) essais sur des plasmides de psoralène-réticulé et identifié un rôle pour HMGB1 dans la modulation de la topologie de l'ADN plasmidique psoralène réticulé chez l'homme des lysats de cellules cancéreuses.
HMGB1 est une très abondante et ubiquitaire non sonton protéine architecturale qui se lie à l' ADN endommagé et les substrats d'ADN alternativement structurés avec une affinité supérieure canonique forme B de l' ADN 17-20. HMGB1 est impliqué dans plusieurs processus ADN métaboliques, tels que la transcription, la réplication de l' ADN et la réparation d' ADN 16,21-23. Nous avons déjà démontré que HMGB1 se lie à ICL TFO dirigées in vitro avec une grande affinité 20. De plus, nous avons démontré que le manque de HMGB1 a augmenté le traitement mutagène de ICL TFO dirigées et HMGB1 identifié comme une réparation nucleotide excision (NER) co-facteur 23,24. Récemment, nous avons constaté que HMGB1 est associée à ICL TFO dirigées dans les cellules humaines et son recrutement à ces lésions dépend de la protéine NER, XPA 16. Surenroulement négatif de l' ADN a été montré pour favoriser l'élimination efficace des lésions de l' ADN par NER 25, et nous avons constaté que HMGB1 induit surenroulement négatif préférentiellement sur plas ICL contenant TFO dirigéessubstrats milieu ( par rapport aux plasmides substrats non endommagés) 16, fournissant une meilleure compréhension du rôle (s) potentiel de HMGB1 comme un co-facteur de NER. Le traitement des ICL est pas entièrement comprise dans les cellules humaines; ainsi, les techniques et les analyses développées sur la base des outils moléculaires décrits ici pourraient conduire à l'identification de protéines supplémentaires impliquées dans la réparation ICL, qui peut à son tour servir de cibles pharmacologiques qui peuvent être exploitées pour améliorer l'efficacité des traitements de chimiothérapie du cancer.
Ici, une approche efficace pour évaluer l'efficacité de la formation ICL TFO dirigée dans l'ADN plasmidique par électrophorèse sur gel dénaturant d'agarose a été discuté. En outre, en utilisant les plasmides contenant les ICL TFO dirigées, des techniques pour déterminer l'association de HMGB1 avec des plasmides ICL endommagés dans un contexte cellulaire en utilisant des essais ChIP modifiés ont été décrits. En outre, une méthode facile pour étudier les modifications topologiques introduites par ee protéine HMGB1 architecturale, en particulier sur des substrats de plasmide ICL endommagés dans les lysats de cellules humaines a été déterminée en effectuant des essais de surenroulement par électrophorèse sur gel d'agarose à deux dimensions. Les techniques décrites peuvent être utilisées pour favoriser la compréhension de l'implication de la réparation de l'ADN et des protéines d'architecture dans le traitement des lésions de l'ADN ciblé sur des plasmides dans les cellules humaines.
Nous décrivons des protocoles détaillés pour la formation d'ICL psoralène spécifiques au site TFO dirigés sur l'ADN de plasmide et le plasmide subséquent ChIP et surenroulement des dosages pour identifier des protéines qui associent les lésions et les protéines qui modifient la topologie de l'ADN, respectivement. Ces dosages peuvent être modifiés pour produire avec d'autres agents endommageant l'ADN, OFT, des substrats de plasmide et des lignées de cellules de mammifères présentant un intérêt. En fait, nous avons montré qu'il existe au moins un site potentiel TFO affinité de liaison unique et élevé au sein de chaque gène annoté dans le génome humain 26. Commentjamais, pour plus de clarté, nous avons décrit ces techniques pour l'utilisation d'un TFO spécifique psoralène-conjugué (pAG30) sur un plasmide mutation-rapporteur spécifique (pSupFG1) dans les cellules U2OS humaines que nous avons utilisé dans Mukherjee & Vasquez 2016 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
La formation efficace des ICL TFO dirigés dépend de deux facteurs essentiels: premièrement, des composants tampons appropriée (par exemple, MgCl 2) et le temps d'incubation de la TFO avec son substrat d'ADN cible ( en fonction de l'affinité de liaison de l'TFO à sa cible recto-verso, et que les concentrations utilisées); et deuxièmement, la dose appropriée des UVA (365 nm), l'irradiation pour former des reticulations de psoralène de manière efficace. la formation d'…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire Vasquez pour des discussions utiles. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé / Institut national du cancer [CA097175, CA093279 à KMV]; et la prévention du cancer et de l'Institut de recherche du Texas [RP101501]. Le financement des frais d'accès ouvert: National Institutes of Health / National Cancer Institute [de CA093279 à KMV].
Materials
| 5'HMT Psoralen-AG30 | Midland Certified Reagent Co., Midland, TX | Custom order | HPLC (or gel) purified |
| Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit | Cell signaling Inc. | 9003 | Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer. |
| GoTaq Green | Promega | M7122 | PCR master mix |
| HMGB1 antibody | Abcam | Ab18256 | |
| Wizard Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9281 | |
| Chloroquine-diphosphate salt | Sigma | C6628-50G | For two-dimensional agarose gel electrophoresis |
| EcoRI | New England BioLabs | R0101S | |
| GenePORTER transfection reagent | Genlantis | T201015 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Invitrogen | 38042-024 | |
| Blak-Ray long wave ultraviolet lamp | Upland, CA | B 100 AP | UVA lamp |
| EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 | Epigentek | EQC-1100 | Water bath sonicator |
| Mylar filter | GE Healthcare Life Sciences | 80112939 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6111 | |
| BIO-RAD Chemidoc | BIO-RAD | XRS+ system | DNA imaging system |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| 37% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775-25ML | Used for crosslinking |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | Cell culture media |
| PBS | ThermoFisher | 70013073 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 | Cell culture |
| Bromocresol green | Sigma-Aldrich | 114-359 | DNA loading dye |
| Siliconized tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | Low retention microfuge tube |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A74-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP24731 | |
| Photometer | InternationalLight Technologies | ILT1400-A | UVA dose measurement |
| Cell lines | |||
| Human U2OS osteosarcoma | ATCC | ATCC HTB-96 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Human cervical adenocarcinoma HeLa | ATCC | ATCC-CCL-2 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Proximal forward primer | 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac | ||
| Proximal reverse primer | 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg | ||
| Distal forward primer | 5′-aat acc gcg cca cat agc ag | ||
| Distal reverse primer | 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc |
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