Herramientas para estudiar el papel de la proteína HMGB1 arquitectónico en el procesamiento de la hélice causante de distorsión, de ADN específica de sitio enlaces cruzados
Summary
Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.
Abstract
cuadro de grupo de alta movilidad 1 proteína (HMGB1) es una proteína de arquitectura no histonas que está implicado en la regulación de muchas funciones importantes en el genoma, tales como la transcripción, la replicación del ADN, y la reparación del ADN. HMGB1 se une al ADN estructuralmente distorsionado con mayor afinidad que a B-DNA canónica. Por ejemplo, se encontró que la HMGB1 se une al ADN enlaces cruzados (ICL), que enlazan covalentemente las dos hebras del ADN, provocar una distorsión de la hélice, y si se deja sin reparar puede causar la muerte celular. Debido a su potencial citotóxico, varios agentes inductores de ICL se utilizan actualmente como agentes quimioterapéuticos en la clínica. Mientras que los agentes formadores de ICL muestran preferencias por determinadas secuencias de bases (por ejemplo, 5'-TA-3 'es el sitio preferido para la reticulación de psoraleno), inducen daños en el ADN en gran medida de forma indiscriminada. Sin embargo, acoplando covalentemente el agente ICL-inducir a un oligonucleótido formador de triplex-(TFO), que se une al ADN en una secuencia específicamanera, el daño del ADN objetivo se puede lograr. Aquí, nosotros usamos una TFO conjugado covalentemente en 'extremo a un 4'-hidroximetil-4,5 '5 el psoraleno trimetilpsoraleno-8, (HMT) para generar una ICL específica de sitio en un plásmido reportero mutación para su uso como una herramienta de para estudiar la modificación de arquitectura, el procesamiento, y la reparación de las lesiones del ADN complejos por HMGB1 en las células humanas. Se describen las técnicas experimentales para preparar ICL dirigidas-TFO en plásmidos informadores, y para interrogar a la asociación de HMGB1 con los dirigidos ICL-TFO en un contexto celular utilizando ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina. Además, se describen ensayos de superenrollamiento del ADN para evaluar la modificación de arquitectura específica del ADN dañado mediante la medición de la cantidad de vueltas superhelical introducidas en el plásmido psoraleno reticulado por HMGB1. Estas técnicas se pueden utilizar para estudiar los papeles de otras proteínas implicadas en el procesamiento y la reparación de ICL dirigidas-TFO u otros daños en el ADN objetivo en cualquier línea celular de interés.
Introduction
Triplex de formación de oligonucleótidos (TFOs) de ADN se unen dúplex de una manera específica de secuencia a través de enlaces Hoogsteen-hidrógeno para formar estructuras de triple helicoidal 1-5. Tecnología Triplex se ha utilizado para interrogar a una variedad de mecanismos biomoleculares, tales como la transcripción, daño en el DNA de reparación, y la orientación de genes (revisado en las referencias 6-8). TFOs se han utilizado ampliamente para inducir daño de sitio específico en plásmidos informadores 9,10. Nuestro laboratorio y otros han utilizado previamente un TFO, GA30, atado a una molécula de psoraleno para inducir reticulaciones entre cadenas de ADN específicas de sitio (ICL) en el gen su p F en el plásmido pSupFG1 5,10-12. ICL son altamente citotóxicos ya que estas lesiones se entrecruzan covalentemente las dos hebras de ADN, y si se deja sin reparar, puede bloquear la transcripción de genes e impedir la maquinaria de replicación del ADN 13,14. Debido a su potencial citotóxico, agentes inductores de ICL-han sido utilizados como fármacos quimioterapéuticos en el tratamientode cáncer y otras enfermedades 15. Sin embargo, el tratamiento y la reparación de ICL en las células humanas no se entiende bien. Por lo tanto, una mejor comprensión de los mecanismos implicados en el procesamiento de ICL en las células humanas puede ayudar a mejorar la eficacia de los regímenes quimioterapéuticos basados en ICL. ICL inducidos por TFO y sus intermedios de reparación tienen el potencial de causar distorsiones estructurales importantes para la hélice de ADN. Estas distorsiones son objetivos probables para las proteínas de arquitectura, que se unen a ADN distorsionada con mayor afinidad que a forma canónica B dúplex de ADN 16-20. Aquí, se estudió la asociación de una proteína de arquitectura muy abundante, HMGB1 con ICL en las células humanas a través de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) ensayos en plásmidos de psoraleno-reticulada y se identificaron un papel para la HMGB1 en la modulación de la topología del ADN plasmídico psoraleno reticulado en humanos lisados celulares de cáncer.
HMGB1 es un muy abundantes y de expresión ubicua no suarquitectónico de proteínas tono que se une al ADN dañado y sustratos de ADN, alternativamente, estructurados con mayor afinidad que forma canónica B ADN 17-20. HMGB1 participa en varios procesos metabólicos de ADN, tales como la transcripción, la replicación del ADN, y la reparación del ADN 16,21-23. Hemos demostrado previamente que la HMGB1 se une a ICL dirigidas-TFO in vitro con alta afinidad 20. Además, hemos demostrado que la falta de HMGB1 aumenta el procesamiento mutagénico de ICL dirigidas-TFO y HMGB1 identificado como una reparación por escisión de nucleótidos (NER) co-factor 23,24. Recientemente, hemos encontrado que la HMGB1 se asocia con ICL dirigidas-TFO en las células humanas y su reclutamiento a tales lesiones depende de la proteína NER, XPA 16. Superenrollamiento negativo del ADN se ha demostrado que la promoción de la eliminación eficaz de las lesiones del ADN por NER 25, y hemos encontrado que HMGB1 induce superenrollamiento negativo preferentemente en plas ICL contienen dirigidas-TFOmediados de sustratos (en relación con los plásmidos sustratos no dañado) 16, que proporcionan una mejor comprensión de la función (s) potencial de HMGB1 como un co-factor de NER. El procesamiento de ICL no se entiende completamente en las células humanas; por lo tanto, las técnicas y ensayos desarrollados en base a las herramientas moleculares descritos en este documento podrían conducir a la identificación de nuevas proteínas implicadas en la reparación ICL, que a su vez pueden servir como dianas farmacológicas que pueden ser explotados para mejorar la eficacia de los regímenes de quimioterapia del cáncer.
Aquí, un enfoque eficaz para evaluar la eficacia de la formación dirigida ICL-TFO en el ADN plásmido mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante se ha discutido. Además, el uso de los plásmidos que contienen las ICL dirigidas-TFO, las técnicas para determinar la asociación de HMGB1 con plásmidos dañadas-ICL en un contexto celular utilizando ensayos de chip modificados se han descrito. Además, un método fácil para el estudio de modificaciones topológicas introducidas por THe proteína HMGB1 arquitectónico, específicamente en sustratos plásmido dañados-ICL en lisados de células humanas se ha determinado mediante la realización de ensayos de superenrollamiento a través de electroforesis en gel de agarosa de dos dimensiones. Las técnicas descritas se pueden utilizar para favorecer la comprensión de la implicación de la reparación del ADN y las proteínas de arquitectura en el procesamiento de daño del ADN objetivo en los plásmidos en las células humanas.
Describimos protocolos detallados para la formación de ICL de psoraleno específicas de sitio dirigidas-TFO en el ADN plásmido, y la posterior ChIP plásmido y superenrollamiento ensayos para identificar proteínas que se asocian con las lesiones, y proteínas que alteran la topología del ADN, respectivamente. Estos ensayos pueden ser modificados para llevar a cabo con otros agentes que daña el ADN, TFOs, sustratos de plásmidos, y las líneas de células de mamíferos de interés. De hecho, hemos demostrado que hay al menos un potencial afinidad único y de alta sitio TFO vinculante dentro de cada gen anotado en el genoma humano 26. Cómonunca, para mayor claridad, describimos estas técnicas para el uso de un conjugado TFO-psoraleno específico (pAG30) en un plásmido reportero mutación específica (pSupFG1) en células U2OS humanas como hemos utilizado en Mukherjee y Vasquez, 2016 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
La formación eficiente de ICL dirigidas-TFO depende de dos factores cruciales: En primer lugar, los componentes del tampón adecuado (por ejemplo, MgCl 2) y el tiempo de incubación de la TFO con su sustrato de ADN diana (depende de la afinidad de unión del TFO a su diana dúplex y las concentraciones se utiliza); y segundo, la dosis apropiada de UVA (365 nm) de irradiación para formar entrecruzamientos de psoraleno de manera eficiente. la formación de triplex óptimo se puede lograr mediante el …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio Vásquez útil para los debates. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud / Instituto Nacional del Cáncer [CA097175, CA093279 a KMV]; y la Prevención del Cáncer y el Instituto de Investigación de Tejas [RP101501]. La financiación de cargo de acceso abierto: Institutos Nacionales de Salud / Instituto Nacional del Cáncer [CA093279 a KMV].
Materials
| 5'HMT Psoralen-AG30 | Midland Certified Reagent Co., Midland, TX | Custom order | HPLC (or gel) purified |
| Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit | Cell signaling Inc. | 9003 | Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer. |
| GoTaq Green | Promega | M7122 | PCR master mix |
| HMGB1 antibody | Abcam | Ab18256 | |
| Wizard Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9281 | |
| Chloroquine-diphosphate salt | Sigma | C6628-50G | For two-dimensional agarose gel electrophoresis |
| EcoRI | New England BioLabs | R0101S | |
| GenePORTER transfection reagent | Genlantis | T201015 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Invitrogen | 38042-024 | |
| Blak-Ray long wave ultraviolet lamp | Upland, CA | B 100 AP | UVA lamp |
| EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 | Epigentek | EQC-1100 | Water bath sonicator |
| Mylar filter | GE Healthcare Life Sciences | 80112939 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6111 | |
| BIO-RAD Chemidoc | BIO-RAD | XRS+ system | DNA imaging system |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| 37% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775-25ML | Used for crosslinking |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | Cell culture media |
| PBS | ThermoFisher | 70013073 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 | Cell culture |
| Bromocresol green | Sigma-Aldrich | 114-359 | DNA loading dye |
| Siliconized tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | Low retention microfuge tube |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A74-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP24731 | |
| Photometer | InternationalLight Technologies | ILT1400-A | UVA dose measurement |
| Cell lines | |||
| Human U2OS osteosarcoma | ATCC | ATCC HTB-96 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Human cervical adenocarcinoma HeLa | ATCC | ATCC-CCL-2 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Proximal forward primer | 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac | ||
| Proximal reverse primer | 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg | ||
| Distal forward primer | 5′-aat acc gcg cca cat agc ag | ||
| Distal reverse primer | 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc |
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