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Immunology and Infection

Medição de Inibição da Neuraminidase Influenza títulos de anticorpos por Enzyme-linked Lectina Ensaio

Published: September 06, 2016
doi:
10.3791/54573
, ,
1Division of Viral Products, CBER,Food and Drug Administration

Summary

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Abstract

Os anticorpos para neuraminidase (NA), a segunda proteína de superfície mais abundante no vírus da gripe, contribuem para a proteção contra a gripe. Os métodos tradicionais para medir inibição de NA (NI) títulos de anticorpos não são práticos para serologia rotina. Este protocolo descreve o ensaio ligado a enzima lectina (ELLA), um método alternativo é prático para medir títulos NI que é realizado em placas de 96 poços revestidas com um substrato de grande glicoproteína, fetuina. NA cliva ácidos siálicos terminais de fetuina, expondo o penúltimo açúcar, galactose. aglutinina de amendoim (PNA) é uma lectina com especificidade para galactose e, por conseguinte, a extensão da desialylation pode ser quantificada utilizando-se um conjugado de peroxidase de rábano-PNA, seguido pela adição de um substrato cromogénico da peroxidase. A densidade óptica, que é medida é proporcional à actividade de NA. Para medir títulos de anticorpos NI, diluições em série de soros são incubadas a 37 ° CO / N em placas revestidas com fetuína com uma quantidade fixa of NA. O recíproco da diluição mais elevada do soro que resulta na inibição ≥50% da actividade de NA é designado como o título de anticorpo NI. A ELLA fornece um formato prático para avaliação de rotina de respostas de anticorpos humanos após infecção por influenza ou vacinação.

Introduction

Neuraminidase (NA) é uma glicoproteína expressa na superfície de viriões da influenza. A sua actividade enzima é essencial para a libertação de partículas de vírus recentemente formadas a partir de células infectadas 1,2. Os anticorpos que inibem a actividade de NA reduzir os títulos de vírus e os sintomas da doença em modelos de animais 3 e correlacionam-se com a resistência contra a doença em seres humanos 4. Um aumento na inibição NA (NI) títulos após a vacinação pode, portanto, servir um indicador da eficácia da vacina, no entanto muitos estudos de imunogenicidade da gripe passado não incluir este ponto final, porque o ensaio tradicional para medir títulos de anticorpos NI é impraticável para sorologia de rotina.

O método tradicional para medir títulos de Ni é ​​baseada na quantificação da quantidade de ácido siálico que é clivado a partir de glicoconjugados por NR 1. Este método, muitas vezes referido como o método de ácido tiobarbitúrico (TBA), utiliza produtos químicos perigosos para converter AC siálicoID de um cromóforo que pode ser quantificada por espectrometria. O ensaio não é apropriado para testar grandes números de amostras, porque os tubos de vidro individuais são utilizados, tornando o ensaio pesado. A miniaturização do ensaio para a placas de 96 poços fornece um formato mais prático 5, no entanto, este ensaio requer ainda o uso de produtos químicos tóxicos e, por conseguinte, não é o ideal.

Um ensaio alternativo para medir títulos de anticorpos NI foi desenvolvido por Lambre et al. 6. Este ensaio quantifica a actividade da enzima medindo a quantidade de açúcar a penúltima de glicoproteínas, galactose, que fica exposta quando o ácido siálico é libertado pela NA. Desde amendoim-aglutinina (PNA) se liga especificamente a galactose, a uma peroxidase de rábano-PNA (HRPO) conjugado pode ser usado para obter uma leitura colorimétrica-out. A densidade óptica, que é medido é portanto proporcional à actividade de NA na amostra. Os títulos de NI são medidos determinando-se a diluição mais elevadade soro que inibe, pelo menos, 50% da actividade de NA. Este ensaio de lectina ligada a enzima (ELLA) é realizada em placas de 96 poços revestidas com fetuína, uma proteína de soro altamente glicosilada, tal como o substrato para NA.

Uma consideração importante para ensaios que medem títulos de NI, é a fonte de NA. Isto é porque o soro de indivíduos vacinados ou infectados conter anticorpos contra a hemaglutinina (HA), bem como anticorpos para NA. Os anticorpos que se ligam a HA pode interferir com a actividade de NA e, por conseguinte, para evitar inibição não-específica por anticorpos específicos de HA-, purificado NA ou vírus inteiros contendo um HA antigenicamente desemparelhado deve ser usado no ensaio. Estes vírus podem ser geradas por rearranjo clássica ou por genética reversa; o objectivo é resgatar um vírus que contém HA de um subtipo que não está relacionada com a estirpe alvo, e NA do vírus que está a ser estudado. O ensaio descrito neste artigo emprega vírus A da gripe, que são gerados pelo revERSE genética para conter HA de H6 subtipo ea NA alvo de vírus influenza A, subtipos H1N1 e H3N2 5.

Os resultados gerados por ELLA e ensaios TBA miniaturizados mostrar esses métodos são comparáveis, com especificidade subtipo semelhante e sensibilidade 7. O ELLA não exigem a utilização de produtos químicos perigosos, pelo que é o método preferido para medir títulos de NI. É fácil de executar, com apenas alguns passos (Figura 1): As amostras são diluídas e transferido para uma placa revestida com fetuína para o qual o vírus (a fonte de NA) é adicionado. A placa é incubada S / N e lavou-se antes da adição de PNA-HRPO. Após uma incubação de 2 horas, a placa foi lavada e o substrato da peroxidase é adicionado; a reacção de cor é parado e finalmente, a densidade óptica é medida e o recíproco da diluição da amostra, que resultou em% de inibição, pelo menos, 50 da actividade de NA é relatada como o ponto final de titulação de 50%. Um estudo intra-laboratório para avaliar reproducibiliTy do ELLA, mostraram que a variabilidade da placa-a-placa é mínima e repetibilidade operador-a-operador não resultou em diferenças mais do que duas vezes no título 7. Um estudo subsequente inter-laboratórios de ELLA variabilidade mostrou que o ensaio tem uma boa reprodutibilidade quando realizado em laboratórios diferentes e que a inclusão de um padrão pode reduzir ainda mais a variabilidade nos resultados 8. O ELLA é adequado para a medição de títulos de anticorpos NI em painéis de soro a partir de estudos sobre a vacina da gripe pré-clínicos e 7 e também pode ser usado para avaliar diferenças antigénicas entre as AN 9 de vírus da gripe.

Protocol

Todos os vírus recombinantes vivos com componentes aviárias devem ser tratadas usando nível de biossegurança 2 (BSL2) práticas Enhanced em um laboratório aprovado para uso pelo Departamento de Agricultura dos EUA (USDA) e da comissão de biossegurança institucional. 1. Preparação de Material de Partida e Reagentes Nota: Consulte a Tabela de Materiais para obter a fonte de todos os reagentes. Placas revestidas com fetuína Preparar tampão de revestimento por mistura de 10 ml de 10x tampão de revestimento com 90 ml de H2O desionizada Prepara-se uma solução estoque de fetuina a 25 mg / ml em tampão de revestimento 1x e armazenar em alíquotas de 500 uL a -20 ° C. Preparar uma solução de trabalho de fetuina (25 ug / ml) imediatamente antes de placas de revestimento por diluição da solução stock de 1000 vezes em 1x tampão de revestimento. Usar uma pipeta de canais múltiplos para dispensar 100 ul da solução de trabalho de fetuína para all poços de uma placa de 96 poços que tem elevada capacidade de ligação de proteína. Cobrir cada placa com o selador de placa, em seguida, empilhar as placas em grupos de 10 e envolvê-los em papel alumínio. Colocar as placas num frigorífico (2-8 ° C) durante pelo menos 18 horas antes de executar um ensaio. Nota: As placas podem ser revestidas com antecedência e guardadas com a solução de revestimento a 2-8 ° C durante até 2 meses. diluentes Para preparar o diluente para fazer diluições de vírus e de amostra (2- (N-morf olino) etanossulfónico (MES), pH 6,5, CaCl 2 20 mM, 1% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,5% de Tween 20), 94,2 ml de misturar 1X MES, pH 6,5 com 2 ml de CaCl2 (10 mg / ml), 3,3 ml 30% de BSA e 0,5 ml de Tween 20. Para preparar o diluente para PNA-HRPO (MES, pH 6,5 com 20 mM de CaCl2 e 1% de BSA), mistura 94,7 mL de 1x de MES, pH 6,5 com 2 ml de CaCl2 (10 mg / ml) e 3,3 ml 30% de BSA . Neuraminidase (NA) Nota: H6Nx reass vírusortants (estes têm HA de H6 subtipo ea NA de interesse), são gerados seguintes métodos publicados 5,10. Solicitar frascos de vírus recombinante inactivada de um colaborador se eles não estão disponíveis em casa. Quando se utiliza vírus inactivado, confirmar que a preparação é apropriada para utilização na ELLA através da demonstração de que o processo de inactivação não têm um impacto significativo sobre a actividade de NA. Cultura um estoque de vírus H6Nx em ovos de galinha embrionados 11 e armazenar alíquotas de 0,5 ml de líquido alantóico puro à temperatura de -80 ° C. Use uma nova alíquota de vírus para cada ensaio. Não congelar e descongelar as alíquotas. As amostras de soro e Controles Calor-inactivar todos os soros (por exemplo, amostras de ensaio, os soros pré-vacinação e pós, bem como controlos, por exemplo, com a amostra conhecida título NI) num banho de água a 56 ° C durante 45-60 min. Armazenar o soro a -20 a -70 ° C antes ou depois do tratamento térmico. Se o SAMPles estão a ser testado várias vezes, fazer várias alíquotas antes do congelamento de modo que a amostra não é repetidamente congeladas e descongeladas. Use o ELLA para medir os títulos NI de soros humanos que estão disponíveis em quantidade suficiente (> 5 ml) para identificar pelo menos um com baixo título e outro com um título elevado. Armazenar aliquotas de 100 ul como ≤-20 ° C, de modo que a mesma amostra pode ser utilizado como um controlo em muitos ensaios, a fim de controlar o desempenho do ensaio. Aglutinina de amendoim (PNA) de rábano peroxidase (HRPO) Prepara-se o diluente PNA-HRPO (MES, pH 6,5 com CaCl2 e 1% de BSA). Prepara-se uma solução estoque de PNA-HRPO dissolvendo 1 mg de PNA-HRPO em 1 ml de diluente. Armazenar 20-200 mL alíquotas a -20 ° C. Antes de utilizar um novo lote de PNA-HRPO, teste 1: 500, 1: 750, 1: 1000 e 1: 2000 diluições deste reagente para identificar a quantidade que resulta em OD máximo com o controlo positivo (vírus só) e um fundo ( nenhum vírus) tchapéu é <10% do sinal positivo. Fazer diluições de vírus quadruplicado como descrito na seção 2.1. Transferir as diluições para uma placa revestida com fetuína, tal como descrito na secção 2.2 e Incubar a placa a 37 ° C. Lava-se a placa de 16-18 horas mais tarde e adicionar 1: 500, 1: 750, 1: 1000 e 1: 2000 diluições de ANP-HRPO (100 ul / poço) para duplicar as linhas da placa. Completar o ensaio como descrito nos passos 2.3.4 a 2.3.9. Avaliar os dados para seleccionar a diluição que resultou num sinal máximo que é> 10 vezes o fundo. Imediatamente antes da utilização, preparar a diluição óptima de PNA-HRPO identificada em 1.5.3. Prepara-se uma grande volume de tampão de lavagem (0,01 M de tampão fosfato salino (PBS), pH 7,4, 0,05% de Tween 20 (PBS-T)). Armazenar à temperatura ambiente. Prepara-se o substrato de peroxidase (dicloridrato de o-fenilenodiamina (OPD)): Nota: os substratos de peroxidase alternativos, tais como 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), podem ser utilizados Preparar tampão fosfato-citrato dissolvendo uma cápsula em 100 mL de dH2O no dia do ensaio. Dissolver 1 comprimido de OPD (10 mg) em 20 ml de tampão fosfato-citrato imediatamente antes da utilização. Preparar a solução de paragem (1 NH 2 SO 4): adicionar 27,2 ml de estoque de 98% de H 2 SO 4-973 ml de dH 2 O. Misture e, em seguida, armazenar à temperatura ambiente. 2. A determinação da quantidade de Na usar em ELLA Preparar diluições de vírus numa placa de 96 poços Dispense 120 ul diluente da amostra (ponto 1.2) em colunas 1-11 da placa de diluição. Para coluna 1, adicione um diluente adicional amostra de 96 mL. Descongelar e, em seguida, vortex o frasco do vírus antes de adicionar 24 mL de duplicar poços na coluna 1. Isto dá uma diluição do vírus 1:10. Fazer diluições em série de 2 vezes de vírus em diluente da amostra, através da transferência120 mL de um bem para os próximos utilizando pontas de pipeta limpas para cada diluição. Transferir diluições do virus para uma placa revestida com fetuína Lave as revestidas de fetuína placa 3 vezes com PBS-T (secção 1.6) e, em seguida, seque cada placa sobre papel absorvente para remover qualquer tampão de lavagem em excesso. Adicionar 50 ul de diluente de amostra (1.2.1) a cada poço nas colunas 1 a 11 da placa revestida com fetu�a. Adicionar 100? L de diluente de amostra à coluna 12 (estes poços são o controlo negativo). Transferir 50 ul de vírus diluído a partir de colunas 1-11 da placa de diluição às cavidades correspondentes da placa revestida com fetuína. Cobrir a placa com um vedante de placa e, em seguida, coloca-se numa incubadora humidificada a 37 ° C. Adicione nota do momento em que restantes passos será realizada (16-18 hr mais tarde). Complete a Determinação NA Quando a incubação estiver completa (16-18 h), transferir oplaca para o banco e retirar o vedante de placa. Lava-se a placa 6 vezes com PBS-T (secção 1.7) e, em seguida, inverter e pat em toalhas de papel absorvente para assegurar que todo o líquido foi removido dos poços. Adicionam-se 100 ul / poço solução de PNA-HRPO (na diluição determinada em 1.5.3) a todos os poços e incubar a placa durante 2 horas à temperatura ambiente. Menos do que 15 minutos antes da incubação é a extremidade, preparar a solução de OPD como descrito na secção 1.7. Lavam-se as placas de teste 3 vezes para remover o PNA-HRPO e secar antes da adição de 100 ul de substrato OPD a cada poço. Incubar a placa durante exactamente 10 min à temperatura ambiente. Parar a reacção por adição de 100 ul / poço de ácido sulfúrico 1N. Usar um leitor de placas para medir a densidade óptica (DO) a 490 nm, durante 0,1 seg. Salvar e exportar todos os arquivos de dados. Seleccione a diluição de vírus que será usada para Sorologia Desenhar um gráfico que traça OD 490nm </sub> valores em cada diluição do vírus. Inspeccionar a curva de titulação para identificar o sinal máximo (isto é, normalmente o sinal que corresponde a um patamar no início da curva de titulação), o sinal mínimo (poços que não contêm nenhum vírus na coluna 12 da placa de fornecer o controlo de fundo), e as diluições de vírus que resultam em OD que é proporcional à diluição de entrada (isto é, região linear da curva). Marque a diluição do vírus que dá, aproximadamente, 90% do sinal máximo e está dentro do intervalo linear. Confirmar que o diâmetro externo na diluição seleccionado é pelo menos 10 vezes maior do que o sinal de fundo. Use a diluição do vírus selecionado para todos os ensaios que empregam esse estoque vírus em particular. Nota: Em alternativa, medir a actividade de NA do vírus e usar ~ 15-20 mU de actividade de NA / ml no ELLA. 3. Enzyme-linked Lectina Ensaio Nota: A Figura 2 Shows a instalação das placas de diluição e de ensaio. Fazer diluições de amostras Coloque as amostras inactivadas por calor em gelo. Nota: 8 soros pode ser diluído em cada placa. Para uma criada utilizando diluições a partir de 01:10 ao longo da placa, adicione 120 mL de diluente de amostra para todos os poços das colunas 3-11. Para a coluna 2, adicionar 216 uL de diluente de amostra e 24 ul de cada amostra. Misturar a amostra no poço por pipetagem cima e para baixo 3 vezes e, em seguida, transferir 120 ul para a próxima coluna. Depois de mudar as pontas das pipetas, misturar o conteúdo do poço pipetando cima e para baixo e, em seguida, transferir 120 ul para a próxima coluna. Repita o passo 3.1.4 até que a amostra foi transferida para a coluna 11 e os restantes 120 ul descartado. Adicionar as amostras e vírus à placa revestida com fetu�a Descongelar uma ampola de vírus, de vórtice e ressuspender o vírus no diluente (secção 1.2) na diluição que foi seleccionado no passo 2.4.2. Preparar pelo menos 5 ml de vírus por cada placa de ensaio. Manter o vírus diluído em gelo até que as placas foram lavadas e amostras de soro foram adicionados à placa. Decidir sobre o número de placas revestidas com fetuína que são necessários para o ensaio (geralmente se aplicam 4 soros por placa). Lavar os revestidos por fetuína placa 3 vezes com PBS-T e, em seguida, inverter cada placa e secar sobre papel absorvente para remover o excesso de tampão de lavagem. Usar uma pipeta de canais múltiplos para transferir 50 ul de cada diluição de soro de controlo ou amostra a partir da placa de diluição em poços em duplicado nas colunas 2-11. Adicionar 50 ul de vírus diluído a todos os poços excepto o controlo negativo (coluna 12). Adicionar 50 ul de diluente de amostra aos poços na coluna 1 e adicione 100 ml de diluente de amostra para a coluna 12. Cubra os poços com o selador de placa e, em seguida, misture batendo suavemente os lados da placa ou colocar num agitador de placas a uma velocidade moderada durante 10 segundos. Colocar a placa num humidifIED incubadora a 37 ° C durante 16-18 hr. Adicionar PNA-HRPO e completar o ensaio, tal como descrito na secção 2.3 Análise 4. Dados Determinar a validade dos resultados do ensaio Confirmar que os valores de fundo (sem vírus) são inferiores a 10% do controlo positivo (vírus e sem soro). Confirmar que os títulos de soros de controlo de execução em ensaios diferentes utilizando as mesmas condições estão dentro de 2 vezes do título médio. Confirmar que as medições de OD de poços de controlo são consistentes (≤20% diferente) e que as medições de OD de poços de amostras duplicadas são consistentes (≤10% diferente). Determinar a causa raiz de resultados inválidos e repita o ensaio se os critérios enumerados no 4.1.1, 4.1.2 ou 4.1.3, não são cumpridas. Considerar os fatores apresentados na Tabela 1 ao tentar solucionar problemas. Atribuir um título de ponto-End 50% Para cada placa de ensaio, subtract o fundo médio (sem antigénio adicionado aos poços) a partir de todas as leituras. Calcular a percentagem de inibição em cada diluição do soro utilizando a fórmula: 100 x (vírus OD único controle – amostra de teste OD) / vírus OD único controle. Identificar a diluição mais elevada que resultou em% de inibição do máximo de sinal, pelo menos, 50. Relatam o recíproco desta diluição como o ponto final de titulação de 50%. Nota: Se uma inibição de 50% não foi conseguida em qualquer diluição, o título é menor do que a primeira diluição testada, por exemplo, <10 quando 01:10 é a primeira diluição testada. Calcula-se a concentração de 50% de inibição (IC50) Use quatro regressões logísticas de parâmetros para determinar o IC 50 título da seguinte forma: subtrair o fundo da média de todas as leituras e depois transferir os resultados para um programa que executa análise de regressão. Use regressão não-linear, com o conjunto máximopara o vírus apenas controlam e o mínimo definido para zero, para determinar a diluição que corresponde exactamente com a inibição de 50%. Relatam o recíproco desta diluição como a IC50 título.

Representative Results

O ensaio apresentado neste trabalho é mostrado esquematicamente na Figura 1. A Figura 2 mostra a disposição da placa de 96 poços, e indica que as diluições em série de amostras de soro são preparadas de uma placa de diluição antes da transferência para a placa revestida com fetuína. Um parâmetro crítico do ensaio é a quantidade de neuraminidase que é utilizado no ensaio; isto é determinado através da titulação do vírus recombinante natural. Exemplos de H6N1 e H6N2 titulações de vírus estão apresentados na Figura 3. A 1:10, 1:20 e 1:40 diluições de H6N1, a densidade óptica foi semelhante, indicando que as condições eram tais que uma leitura máxima foi obtida. Numa diluição de 1:80, o read-out foi de aproximadamente 90% do máximo e, por conseguinte, esta diluição do vírus foi usada em ensaios subsequentes. Exemplos de titulações de soro são mostrados na Figura 4. A figura mostra uma amostra de soro humano que era titrados contra o H6N1 e os vírus H6N2. Cada ponto de dados mostra a percentagem de inibição da actividade de NA, que foi obtida por diluições em série de soro; a primeira diluição do soro no ensaio foi de 1:80 H6N1; a primeira diluição de soro no ensaio foi H6N2 5. Uma vez que a diluição mais elevada que resulta em inibição ≥50% é o título de anticorpo NI, o título do soro mostrado neste exemplo é de 640 contra a NA de NC / 99 (N1) e 160 contra o nA de WI / 05 (N2). . Figura 1. Um esquema do protocolo ELLA (A) Determinação da diluição de antigénio (vírus) para usar no ensaio (passo 2 do protocolo): diluições de vírus são adicionados a uma placa revestida de fetuina e a actividade medida por NA quantificação de resíduos de galactose terminais de ligação através de PNA-HRPO como descrito na etapa 2.3 do protocolo; (B </stron g>) Determinação de títulos de anticorpos séricos NI (passo 3 do protocolo). As amostras são diluídas e, em seguida, transferido para uma placa revestida com fetuína em que o vírus é adicionado. A placa é incubada O / N antes de adicionar PNA-HRPO e completando os passos necessários para gerar uma reação de cor. Finalmente, a reacção de coloração é parada e a densidade óptica é medida. O recíproco da diluição da amostra que resulta em pelo menos 50% de inibição da actividade NA é relatado como o ponto final título 50%. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2. Diagrama para mostrar a placa ELLA definido acima. As diluições em série de amostras de soro são feitos em uma placa de diluição e, em seguida, transferido para uma placa revestida com fetuína. 3fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3. Exemplos de H6N1 e H6N2 titulações de vírus. Diluições em série de H6N1 BR / 07 (NA de A / Brisbane / 59/2007 (H1N1) apresentados na símbolos azuis) e H6N2 UR / 07 (NA de A / Uruguai / 716 / 2007 (H3N2) mostrado na símbolos vermelhos) foram incubadas durante 18 h em placas revestidas com fetuína e a reactividade com PNA-HRPO determinada como descrito. Média OD 490 nm de 2 poços é representada graficamente contra o recíproco da diluição do vírus. A diluição de H6N1 seleccionado para utilização no ELLA foi de 1:80 e uma diluição de 1:40 foi seleccionado H6N2 porque estas diluições resultou em aproximadamente 90% da densidade óptica máxima e estavam dentro do intervalo linear.3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4. A titulação de soro contra NA de N1 (símbolos vermelhos) e N2 (símbolos azuis) subtipos. Títulos de inibição de NA foram medidos contra vírus recombinantes H6N1 NC / 99 (contém o NA de A / New Caledonia / 20/1999 (H1N1) ) e H6N2 WI / 05 (contém o nA de a / Wisconsin / 67/2005 (H3N2)). inibição da enzima por cento por diluições em série de soro é demonstrado com a linha horizontal tracejada indica uma inibição de 50%. Os títulos de inibição de NA contra as AN de A / New Caledonia / 20/1999 (H1N1) (NC / 99) e A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2) (WI / 05) foram 2 9.3 (640) e 2 7.3 ( 160), respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma maior version desta figura. Problema Causas possíveis) Solução Sinal fraco ou nenhum patamar alcançado em titulação do vírus i) atividade da enzima baixo NA ii) Stock vírus não armazenados em condições ideais i) confirmar que o diluente tem de pH que é óptimo para a actividade de NA; se o pH é óptima, preparar um novo estoque de vírus ou se concentrar vírus ii) crescerem e da alíquota; frascos snap-congelamento de gelo seco antes de armazenar a -80 ° C Fraca ou nenhuma cor em poços de controlo de células positivas i) diluição Virus atribuída incorretamente ii) frasco-para-ampola variabilidade em alíquotas de vírus congeladas iii) PNA- HRPO desnaturado ou muito diluído iv) OPD preparado de forma incorrecta Eu); titulação do vírus Repita ii) Titula-se vários frascos do mesmo lote para assegurar que não há variabilidade. Se variabilidade significativa, prepare alíquotas frescas iii) Use diluição do vírus ideal para retitrate PNA- HRPO iv) Repita com a preparação fresca de OPD Fraca ou nenhuma inibição por soros de controlo positivo i) O excesso de vírus utilizado no ensaio ii) Soro deteriorou i) titulação do vírus Repita ii) obter novas condições de armazenamento anti-soros Verifique Inibição por soros de controlo negativo i) tratamento térmico inadequado de soro ii) É muito pouco usado no ensaio de vírus i) Repete-inactivação de calor de soro ii) titulação do vírus Repita fundo de alta i) a possível contaminação de placas ii) a concentração PNA- HRPO muito alta / muito baixa i) Repita usando placas revestidas de fresco ii) Titular PNA-HRPO para identificar a diluição correta para usar titulação do vírus mostra aparente inibição da atividade da NA em baixas diluições i) fluido alantóico podem conter substrato para NA ii) a utilização de vírus que foi sedimentado através de uma almofada de sacarose Tabela 1. A análise de causa raiz de ensaios que não satisfazem os critérios de desempenho. Esta tabela fornece as possíveis causas e soluções para problemas que podem ocorrer durante a execução do ELLA.

Discussion

O ensaio de lectina ligada a enzima é um método prático para avaliar os títulos de anticorpos no soro NI. Embora ELLA foi descrito por Lambre et al., Em 1990, a sua aceitação como um ensaio serológico padrão tem sido mais recente, com numerosos laboratórios da realização do ensaio para medir NI títulos de anticorpos de amostras clínicas 12-16. Algumas modificações podem ser feitas a passos de protocolo sem um grande impacto para as titulações da National Instruments que são medidos. Por exemplo, PBS podem ser utilizados como diluente, no entanto, é muito útil para comparar as curvas de vírus de titulação no tampão recomendado (MES, pH 6,5) e PBS antes de ser tomada uma decisão, como alguns subtipos de NA reduziram significativamente a actividade da enzima em pH> 7.0. Quando o pH óptimo não é usado, o sinal máximo de vírus pode ser reduzida, o que resulta na utilização de uma quantidade excessiva de antigénio (isto é, vírus) no ensaio; Sob estas condições, o ensaio pode ter sensibilidade reduzida.

alguns nãoinibição específica-N é observada quando os soros não tratados são testados no ELLA. Este é removido por tratamento térmico (56 ° C durante 45 min), indicando a presença de inibidores de p-termolábeis. Outros inibidores não-específicos (α e γ-classe) de gripe HA tem sido descrito, particularmente em relação ao vírus H3N2 hemaglutinação e de infecciosidade. Com efeito, a inibição não específica é também observada em ELLA quando vírus H3N2 são utilizados como a fonte de NA; Esta inibição é removido por tratamento das amostras de soro com uma pequena quantidade de sialidase 9.

Como para outros ensaios sorológicos, controlos negativos e positivos deve ser incluído em cada ensaio para proporcionar um meio para avaliar o desempenho do ensaio. Quando o ensaio não cumpriu os critérios de aceitação, a razão deve ser identificado. A Tabela 1 fornece uma lista de possíveis passos no ensaio que podem ser abordados para solucionar problemas.

A prov protocolo ELLAided neste relatório utiliza vírus recombinantes que contêm o HA proveniente de um vírus da gripe aviária, como a fonte de NA. Isto representa uma limitação para realizar o ensaio, porque é necessária uma licença para trabalhar com vírus aviária de baixa patogenicidade. vírus recombinantes H6Nx pode ser partilhada entre laboratórios depois de terem sido inactivados. Portanto, o ensaio pode ser realizado através da colaboração uma vez que o laboratório gerar o vírus recombinante natural demonstrou que a inactivação é completa e a preparação reteve a sua actividade de NA. A restrição de uso H6Nx vírus recombinantes podem ser reduzidas mediante a utilização de fontes não-infecciosas de NA. Por exemplo, alguns laboratórios têm utilizado purificada NA recombinante 17, enquanto outros usaram partículas semelhantes a vírus (VLPs) 15. No entanto, nem NA recombinante nem VLP estão prontamente disponíveis e, portanto, continuar a usar os vírus da gripe aviária com um HA antigenicamente-incompatíveis.

O tradicionalMétodo para medir títulos de anticorpos NI não é prático por vários motivos; de maior preocupação são as substâncias químicas nocivas que são necessários para produzir uma reação de cor. Além disso, grandes volumes de amostra são necessários e o ensaio é complicado de realizar. Em contraste, o ELLA é fácil de realizar e é de um formato que permite a titulação de um número razoável de amostras. Os dados de estudos que examinaram ELLA variabilidade mostram que resultados os rendimentos de ensaio reproduzíveis 7,8. A ELLA tem, consequentemente, a medição de rotina de títulos de anticorpos NI possíveis, e prevê-se que ele será usado mais frequentemente por laboratórios que conduzem estudos sorológicos.

Há vários passos críticos que precisam ser considerados quando se realiza o ELLA. Em primeiro lugar, os inibidores não-específicos de actividade de NA tem que ser removido. Estes inibidores são geralmente termolábeis e são destruídas por um tratamento térmico a 56 ° C durante 45 min. O tratamento térmico é suficiente para eliminar não-especiFIC inibidores a partir de amostras em que os vírus recombinantes H6 são utilizados como a fonte de NA, no entanto, quando o vírus H3N2 são utilizados na ELLA, factores do soro que se ligam a hemaglutinina também interferir com a ELLA e deve ser removido por tratamento com uma pequena quantidade de sialidase antes do tratamento térmico 9. Em segundo lugar, uma quantidade excessiva de antigénio, isto é, vírus H6Nx recombinado, não deve ser utilizado como este reduz a sensibilidade do ensaio. titulação cuidadosa dos vírus é, por conseguinte, um passo essencial; a quantidade de antigénio utilizada em cada ensaio deve fornecer um sinal que está bem acima do fundo, e deve estar dentro da gama linear da curva de titulação, ou seja, o sinal (densidade óptica) deve ser proporcional à diluição do vírus.

Além de serologia de rotina, o ELLA pode ser usado para avaliar diferenças antigénicas entre NAS do vírus da gripe sazonal. Esta informação pode ser muito útil ao selecionar estirpes de vírus para a inclusão de ums candidatos a vacinas e facilitará uma maior compreensão das pressões imunes que resultam em variação antigénica de NA. Além disso, a análise antigênica do NAS, de vírus da gripe suína ou de aves pode fornecer informações cruciais para determinar o potencial de pandemia de estirpes emergentes.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This project was funded by intramural PanFlu funds from the Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Plasmids used to prepare reassortant viruses were kindly provided by Robert Webster, St Jude Children’s Research Hosptial, Memphis, TN. We are indebted to Ewan Plant and Haruhiko Murata for critical review of the manuscript.

Materials

coating buffer  KPL 50-84-01
 fetuin Sigma F3385
5X MES, pH 6.5  KD-Medical PBS-0134
CaCl2 Sigma C7902
30% BSA Sigma A8327
Tween 20 Sigma P1379
Lectin PNA-HRPO Sigma  L7759
PBS-T Sigma P3563-10PAK
o-Phenylenediamine dihydrochloride Sigma P8287
phosphate-citrate buffer Sigma P4922
Sulfuric acid Sigma 258105
96-well  Maxisorp plates NUNC 439454
96-well round bottom well plates NUNC 267245
Plate sealers Thermo Scientific  14-245-192B
chicken eggs Charles River Laboratories 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs
multichannel pipette Variety of suppliers e.g., Rainin, Eppendorf 8 or 12 channel manual pipettem 50-250 µl volume
Pipette tips Depends on pipettor brand Depends on pipettor brand
Plate reader, with 490 nm filter Perkin Elmer Victor V
water bath set to 37 °C Variety of suppliers  Variety of models
water bath set to 56 °C Variety of suppliers  Variety of models
refrigerator set to 4 °C Variety of suppliers  Variety of models
incubator set to 37 °C Variety of suppliers  Variety of models
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References

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Gao, J., Couzens, L., Eichelberger, M. C. Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay. J. Vis. Exp. (115), e54573, doi:10.3791/54573 (2016).
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