We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.
נוגדני נורמינידאז (NA), חלבון המשטח השני בשכיחותו על נגיף שפעת, ותורמים להגנה מפני שפעת. שיטות מסורתיות למדידת NA עיכוב (NI) טיטר נוגדנים אינו מעשי סרולוגיה שיגרתי. פרוטוקול זה מתאר את assay לקטינים enzyme-linked (ELLA), שיטת חלופה מעשית למדוד טיטר NI כי מתבצע 96 צלחות גם מצופות מצע גליקופרוטאין גדול, fetuin. NA המסלקת חומצות sialic מסוף מ fetuin, חשיפת סוכר הלפני האחרון, גלקטוז. agglutinin בוטנים (PNA) היא לקטינים עם סגוליות עבור גלקטוז ולכן מידת desialylation ניתן לכמת באמצעות המצומד peroxidase PNA-חזרת, ואחריו תוספת של מצע peroxidase chromogenic. הצפיפות האופטית נמדדה עומדת ביחס לפעילות אנ-האיים. כדי למדוד טיטר נוגדני NI, דילולים סידוריים של סרה מודגרת ב 37 ° CO / N על צלחות מצופות fetuin עם סכום קבוע of NA. ההופכי של הדילול בסרום הגבוה ביותר שתוצאתו עיכוב ≥50% מהיקף פעילות NA הוא יועד כייל נוגדני NI. ELLA מספק בפורמט מעשי להערכה שיגרתית של תגובות נוגדן אנושיות בעקבות זיהום שפעת או חיסון.
Neuraminidase (NA) הוא גליקופרוטאין ביטוי על פני השטח של virions שפעת. פעילות האנזים שלה חיונית לשחרורו של חלקיקי נגיף חדש שנוצרו מתאים נגועים 1,2. נוגדנים המעכבים NA פעילות להפחית titers וירוס תסמיני המחלה במודלים של בעלי חיים 3 ו לתאם עם התנגדות נגד מחלות בבני אדם 4. גידול עיכוב NA (NI) titers החיסון הבא עשוי ולכן לשרת אינדיקטור היעילות של החיסון, אולם מחקרים רבים חיסוני שפעת בעבר לא כללו קצה בנקודה זו משום assay המסורתית למדוד טיטר נוגדני NI אינו מעשי עבור סרולוגיה שיגרתית.
השיטה המסורתית למדוד טיטר NI מבוסס על כימות הסכום של חומצה sialic כי הוא ביקע מן glycoconjugates ידי NA 1. שיטה זו, המכונה לעתים קרובות את החומצה thiobarbituric (TBA) שיטה, משתמשת בכימיקלים מסוכנים להמיר ac sialicid על כרומופור שניתן לכמת ידי ספקטרומטריית. Assay הוא לא מתאים לבדיקת מספר רב של דגימות בגלל צינורות זכוכית בודדים משמשים, מה שהופך את assay מסורבלת. מזעור של assay על 96 צלחות גם מספק פורמט 5 מעשי יותר, עם זאת assay זה עדיין דורש את השימוש בכימיקלים רעילים ולכן אינו אידיאלי.
ב assay חלופי למדידת טיטר נוגדני NI פותח על ידי Lambré et al. 6. assay זה מכמת פעילות אנזים על ידי מדידת כמות סוכר הלפני האחרון של גליקופרוטאינים, גלקטוז, אשר הופכת חשוף כאשר חומצת sialic הוא שוחרר על ידי NA. מאז בוטנים agglutinin (PNA) נקשר באופן ספציפי גלקטוז, peroxidase PNA-חזרת (HRPO) המצומד יכול לשמש כדי להשיג לקריאה מתוך colorimetric. הצפיפות האופטית נמדדת לכן פרופורציונלית פעילות NA במדגם. טיטר NI נמדד על ידי קביעת הדילול הגבוה ביותרסרום זה מעכב לפחות 50% מפעילות NA. האנזים צמוד זו assay לקטינים (ELLA) מתבצעת 96-גם צלחות מצופות fetuin, חלבון בסרום glycosylated מאוד, כמו המצע עבור NA.
שיקול חשוב עבור מבחני המודדים טיטר NI, הוא המקור של אנ-איי. הסיבה לכך היא כי סר מיחידים מחוסנים או נגועים המכיל נוגדני hemagglutinin (HA) וכן נוגדנים לאנ-האיים. נוגדנים הנקשרים HA יכול להפריע לפעילות NA ולכן, כדי למנוע עיכוב הלא ספציפית על ידי נוגדנים HA-ספציפי, NA מטוהרים או וירוס שלם המכיל HA antigenically-תואמים צריך להיות בשימוש assay. וירוסים אלה יכולים להיווצר על ידי reassortment קלאסי או על ידי גנטיקה הפוכה; המטרה היא להציל וירוס המכיל HA של תת-סוג שאינו קשור לזן היעד, ו NA של הנגיף נלמד. Assay המתואר במאמר זה מעסיק וירוסי שפעת אשר מופקים על ידי reverse גנטיקה להכיל HA של H6 תת סוג ואת NA הממוקד מפני וירוסי השפעת A, תת H1N1 ו- H3N2 5.
תוצאות שנוצרו על ידי ELLA מבחנים יפורסמו מיניאטורי להראות שיטות אלה ניתנות להשוואה, עם סגוליות תת סוג דומים ורגישות 7. ELLA אינו מחייב את השימוש בכימיקלים מסוכנים ולכן היא השיטה המועדפת למדוד טיטר NI. קל לבצע, עם רק כמה צעדים (איור 1): דוגמאות מדוללות והועברו צלחת fetuin מצופה שאליה וירוס (מקור NA) מתווספת. הצלחת היא מודגרות O / N ורחצה לפני הוספת PNA-HRPO. לאחר דגירת hr 2, הצלחת היא שטף מצע peroxidase מתווסף; תגובת צבע מופסק ולבסוף את הצפיפות האופטית נמדדת ההופכי של הדילול שנדגמו עיכוב 50% לפחות של פעילות NA הוא כפי שדווח כייל נקודת סיום 50%. מחקר תוך מעבדה כדי להעריך reproducibility של אלה, הראה כי השתנות צלחת אל צלחת היא מינימלית ואת הדירות מפעיל אל המפעיל הביא לא יותר מאשר הבדלים של פי 2 ב כייל 7. מחקר שלאחר מכן הבינה-מעבדה של השתנות ELLA הראה כי assay יש שחזור טוב כאשר היא מבוצעת במעבדות שונות והכלה של תקן יכולה לצמצם עוד יותר השתנות בתוצאות 8. ELLA הוא מתאים למדידת טיטר נוגדנים NI בפאנלים בסרום ממחקרים חיסון שפעת פרה-קליניים וקליניים 7 והוא יכול לשמש גם כדי להעריך הבדלים אנטיגני בין NAS של נגיפי שפעת 9.
את assay לקטינים enzyme-linked היא שיטה מעשית למדוד טיטר נוגדנים NI ב סרה. למרות ELLA תואר על ידי Lambre et al., בשנת 1990, וקבלתה assay סרולוגית סטנדרטית כבר יותר אחרונה, עם מעבדות רבות ביצוע assay למדוד טיטר נוגדני NI דגימות קליניות 12-16. שינויים מסוימים ניתן לבצע צעדי פרוטוקול ללא השפעה גדולה על טיטר NI נמדדים. לדוגמה, PBS יכול לשמש diluent, לעומת זאת, זה מאוד עוזר להשוות את עקומות טיטרציה וירוס למאגר מומלץ (MES, pH 6.5) ו PBS לפני שמתקבלת החלטה, כמו כמה תת NA צמצמו פעילות האנזים משמעותית pH> 7.0. כאשר החומציות האופטימלית אינה משמשת, את האות של וירוס המרבית עשויה להיות מופחתת, כך שנעשה השימוש של כמות מוגזמת של אנטיגן (כלומר, וירוס) ב assay; בתנאים אלה, עלולה לקבל את assay רגישה מופחתת.
חלק לאn ספציפי עיכוב הוא ציין כאשר סר מטופל נבדקים אלה. זה נעלם באמצעות טיפול בחום (56 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות), המעידים על נוכחות של thermolabile מעכבי β. מעכבים שאינם ספציפיים אחרים (α ו ממדרגת γ) של שפעת HA תוארו, במיוחד ביחס hemagglutination ו infectivity וירוס H3N2. ואכן, עיכוב הלא ספציפי הוא ציין גם ELLA כאשר וירוסי H3N2 משמשים כמקור לא ידוע; עיכוב זה הוסר על ידי טיפול של דגימות סרום עם כמות קטנה של sialidase 9.
באשר מבחן סרולוגית אחר, שולט שלילי וחיובי צריך להיכלל כל assay לספק אמצעי כדי להעריך את ביצועי assay. כאשר assay לא עמד בקריטריונים לקבלה, הסיבה צריכה להיות מזוהה. טבלה 1 מספקת שורה של צעדים פוטנציאליים assay שיכול להיות ממוען לפתור בעיות.
Prov פרוטוקול ELLAided בדוח זה משתמש וירוסים reassortant המכילים את המקור HA מנגיף העופות, כמקור של אנ-איי. מצב זה מציב הגבלת ביצוע assay כי נדרש היתר לעבוד עם וירוסי עופות פתוגניים נמוכים. ניתן לשתף וירוסי H6Nx reassortant בין מעבדות אחרי שהם כבר מומתים. לכן assay יכול להתנהל באמצעות שיתופי פעולה פעם במעבדה ליצירת נגיף reassortant הוכיחה כי האיון יושלם וההכנה שמרת פעילות NA שלה. האילוץ של שימוש H6Nx וירוסים reassortant ניתן להתגבר על ידי שימוש במקורות שאינם מדבקים של אנ-איי. לדוגמה, מעבדות כמה השתמשו מטוהרים רקומביננטי NA 17, בעוד שאחרים השתמשו חלקיקים דמויי וירוס (VLPs) 15. עם זאת, לא רקומביננטי NA ולא VLPs זמין ולכן אנו ממשיכים להשתמש נגיפי שפעת עם HA עופות antigenically-תואם.
המסורתישיטה למדידת טיטר נוגדנים NI אינה מעשית מכמה סיבות; הבעייתי ביותר הם הכימיקלים המזיקים כי יש צורך לייצר תגובת צבע. בנוסף, כמויות גדולות של מדגם נדרשות ואת assay מסורבל לבצע. לעומת זאת, אלה הן קלות לביצוע היא בפורמט המאפשר טיטרציה של מספר סביר של דגימות. נתונים ממחקרים שבדקו להראות השתנות ELLA כי תשואות assay לשחזור 7,8 תוצאות. ELLA יש וכתוצאה מכך גרם מדידה שגרתית של טיטר נוגדנים NI אפשרי, ויש להניח כי הוא ישמש בתדירות גבוהה יותר על ידי מעבדות עורכים מחקרים סרולוגית.
ישנם מספר שלבים קריטיים כי צריך להילקח בחשבון בעת ביצוע אלה. ראשית, מעכבים הלא ספציפיים של פעילות NA יש להסיר. מעכבים אלה הם בדרך כלל thermolabile ו נהרסים על ידי טיפול בחום ב 56 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. עיבוד תרמי מספיק לבטל-ספציפי שאינוFIC מעכבי ממדגמים כאשר וירוסים reassortant H6 משמשים כמקור NA, לעומת זאת, כאשר וירוסים H3N2 משמשים ELLA, גורמים בסרום אשר נקלטות על ידי hemagglutinin גם להפריע ELLA וצריך להסירו באמצעות טיפול עם כמות קטנה של sialidase לפני טיפול בחום 9. שנית, כמות מוגזמת של אנטיגן, כלומר, וירוס H6Nx reassortant, לא אמור לשמש כמו זה מקטין את הרגישות של assay. טיטרציה של וירוס זהירות היא אפוא צעד חיוני; כמות האנטיגן המשמשת כל assay חייבת לספק אות כי הוא הרבה מעל הרקע, והוא חייב להיות בטווח הליניארי של עקומת טיטרציה, כלומר, האות (צפיפות אופטית) חייבת להיות פרופורציונלית דילול הווירוס.
בנוסף סרולוגיה שגרתי, ELLA ניתן להשתמש כדי להעריך הבדלים אנטיגני בין NAS של נגיפי שפעת עונתית. מידע זה עשוי להיות מועיל מאוד בעת בחירת זני וירוס עבור הכללהים מועמדי חיסון יקל הבנה טובה יותר של לחצים חיסוניים הגורמות להיסחף אנטיגני של אנ-איים. בנוסף, ניתוח אנטיגני של NAS מפני וירוסי שפעת חזירים או עופות עשוי לספק מידע קריטי בקביעת הפוטנציאל המגיף של זנים מתעוררים.
The authors have nothing to disclose.
This project was funded by intramural PanFlu funds from the Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Plasmids used to prepare reassortant viruses were kindly provided by Robert Webster, St Jude Children’s Research Hosptial, Memphis, TN. We are indebted to Ewan Plant and Haruhiko Murata for critical review of the manuscript.
coating buffer | KPL | 50-84-01 |
fetuin | Sigma | F3385 |
5X MES, pH 6.5 | KD-Medical | PBS-0134 |
CaCl2 | Sigma | C7902 |
30% BSA | Sigma | A8327 |
Tween 20 | Sigma | P1379 |
Lectin PNA-HRPO | Sigma | L7759 |
PBS-T | Sigma | P3563-10PAK |
o-Phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 |
phosphate-citrate buffer | Sigma | P4922 |
Sulfuric acid | Sigma | 258105 |
96-well Maxisorp plates | NUNC | 439454 |
96-well round bottom well plates | NUNC | 267245 |
Plate sealers | Thermo Scientific | 14-245-192B |
chicken eggs | Charles River Laboratories | 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs |
multichannel pipette | Variety of suppliers e.g., Rainin, Eppendorf | 8 or 12 channel manual pipettem 50-250 µl volume |
Pipette tips | Depends on pipettor brand | Depends on pipettor brand |
Plate reader, with 490 nm filter | Perkin Elmer | Victor V |
water bath set to 37 °C | Variety of suppliers | Variety of models |
water bath set to 56 °C | Variety of suppliers | Variety of models |
refrigerator set to 4 °C | Variety of suppliers | Variety of models |
incubator set to 37 °C | Variety of suppliers | Variety of models |