JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

מדידת טיטר נוגדנים עיכוב Neuraminidase שפעת ידי enzyme-linked Assay לקטינים

Published: September 06, 2016
doi:
10.3791/54573
, ,
1Division of Viral Products, CBER,Food and Drug Administration

Summary

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Abstract

נוגדני נורמינידאז (NA), חלבון המשטח השני בשכיחותו על נגיף שפעת, ותורמים להגנה מפני שפעת. שיטות מסורתיות למדידת NA עיכוב (NI) טיטר נוגדנים אינו מעשי סרולוגיה שיגרתי. פרוטוקול זה מתאר את assay לקטינים enzyme-linked (ELLA), שיטת חלופה מעשית למדוד טיטר NI כי מתבצע 96 צלחות גם מצופות מצע גליקופרוטאין גדול, fetuin. NA המסלקת חומצות sialic מסוף מ fetuin, חשיפת סוכר הלפני האחרון, גלקטוז. agglutinin בוטנים (PNA) היא לקטינים עם סגוליות עבור גלקטוז ולכן מידת desialylation ניתן לכמת באמצעות המצומד peroxidase PNA-חזרת, ואחריו תוספת של מצע peroxidase chromogenic. הצפיפות האופטית נמדדה עומדת ביחס לפעילות אנ-האיים. כדי למדוד טיטר נוגדני NI, דילולים סידוריים של סרה מודגרת ב 37 ° CO / N על צלחות מצופות fetuin עם סכום קבוע of NA. ההופכי של הדילול בסרום הגבוה ביותר שתוצאתו עיכוב ≥50% מהיקף פעילות NA הוא יועד כייל נוגדני NI. ELLA מספק בפורמט מעשי להערכה שיגרתית של תגובות נוגדן אנושיות בעקבות זיהום שפעת או חיסון.

Introduction

Neuraminidase (NA) הוא גליקופרוטאין ביטוי על פני השטח של virions שפעת. פעילות האנזים שלה חיונית לשחרורו של חלקיקי נגיף חדש שנוצרו מתאים נגועים 1,2. נוגדנים המעכבים NA פעילות להפחית titers וירוס תסמיני המחלה במודלים של בעלי חיים 3 ו לתאם עם התנגדות נגד מחלות בבני אדם 4. גידול עיכוב NA (NI) titers החיסון הבא עשוי ולכן לשרת אינדיקטור היעילות של החיסון, אולם מחקרים רבים חיסוני שפעת בעבר לא כללו קצה בנקודה זו משום assay המסורתית למדוד טיטר נוגדני NI אינו מעשי עבור סרולוגיה שיגרתית.

השיטה המסורתית למדוד טיטר NI מבוסס על כימות הסכום של חומצה sialic כי הוא ביקע מן glycoconjugates ידי NA 1. שיטה זו, המכונה לעתים קרובות את החומצה thiobarbituric (TBA) שיטה, משתמשת בכימיקלים מסוכנים להמיר ac sialicid על כרומופור שניתן לכמת ידי ספקטרומטריית. Assay הוא לא מתאים לבדיקת מספר רב של דגימות בגלל צינורות זכוכית בודדים משמשים, מה שהופך את assay מסורבלת. מזעור של assay על 96 צלחות גם מספק פורמט 5 מעשי יותר, עם זאת assay זה עדיין דורש את השימוש בכימיקלים רעילים ולכן אינו אידיאלי.

ב assay חלופי למדידת טיטר נוגדני NI פותח על ידי Lambré et al. 6. assay זה מכמת פעילות אנזים על ידי מדידת כמות סוכר הלפני האחרון של גליקופרוטאינים, גלקטוז, אשר הופכת חשוף כאשר חומצת sialic הוא שוחרר על ידי NA. מאז בוטנים agglutinin (PNA) נקשר באופן ספציפי גלקטוז, peroxidase PNA-חזרת (HRPO) המצומד יכול לשמש כדי להשיג לקריאה מתוך colorimetric. הצפיפות האופטית נמדדת לכן פרופורציונלית פעילות NA במדגם. טיטר NI נמדד על ידי קביעת הדילול הגבוה ביותרסרום זה מעכב לפחות 50% מפעילות NA. האנזים צמוד זו assay לקטינים (ELLA) מתבצעת 96-גם צלחות מצופות fetuin, חלבון בסרום glycosylated מאוד, כמו המצע עבור NA.

שיקול חשוב עבור מבחני המודדים טיטר NI, הוא המקור של אנ-איי. הסיבה לכך היא כי סר מיחידים מחוסנים או נגועים המכיל נוגדני hemagglutinin (HA) וכן נוגדנים לאנ-האיים. נוגדנים הנקשרים HA יכול להפריע לפעילות NA ולכן, כדי למנוע עיכוב הלא ספציפית על ידי נוגדנים HA-ספציפי, NA מטוהרים או וירוס שלם המכיל HA antigenically-תואמים צריך להיות בשימוש assay. וירוסים אלה יכולים להיווצר על ידי reassortment קלאסי או על ידי גנטיקה הפוכה; המטרה היא להציל וירוס המכיל HA של תת-סוג שאינו קשור לזן היעד, ו NA של הנגיף נלמד. Assay המתואר במאמר זה מעסיק וירוסי שפעת אשר מופקים על ידי reverse גנטיקה להכיל HA של H6 תת סוג ואת NA הממוקד מפני וירוסי השפעת A, תת H1N1 ו- H3N2 5.

תוצאות שנוצרו על ידי ELLA מבחנים יפורסמו מיניאטורי להראות שיטות אלה ניתנות להשוואה, עם סגוליות תת סוג דומים ורגישות 7. ELLA אינו מחייב את השימוש בכימיקלים מסוכנים ולכן היא השיטה המועדפת למדוד טיטר NI. קל לבצע, עם רק כמה צעדים (איור 1): דוגמאות מדוללות והועברו צלחת fetuin מצופה שאליה וירוס (מקור NA) מתווספת. הצלחת היא מודגרות O / N ורחצה לפני הוספת PNA-HRPO. לאחר דגירת hr 2, הצלחת היא שטף מצע peroxidase מתווסף; תגובת צבע מופסק ולבסוף את הצפיפות האופטית נמדדת ההופכי של הדילול שנדגמו עיכוב 50% לפחות של פעילות NA הוא כפי שדווח כייל נקודת סיום 50%. מחקר תוך מעבדה כדי להעריך reproducibility של אלה, הראה כי השתנות צלחת אל צלחת היא מינימלית ואת הדירות מפעיל אל המפעיל הביא לא יותר מאשר הבדלים של פי 2 ב כייל 7. מחקר שלאחר מכן הבינה-מעבדה של השתנות ELLA הראה כי assay יש שחזור טוב כאשר היא מבוצעת במעבדות שונות והכלה של תקן יכולה לצמצם עוד יותר השתנות בתוצאות 8. ELLA הוא מתאים למדידת טיטר נוגדנים NI בפאנלים בסרום ממחקרים חיסון שפעת פרה-קליניים וקליניים 7 והוא יכול לשמש גם כדי להעריך הבדלים אנטיגני בין NAS של נגיפי שפעת 9.

Protocol

כל נגיפי השפעת reassortant חיו עם רכיבי עופות חייבים להיות מטופלים באמצעות biosafety ברמה 2 (BSL2) שיטות -enhanced במעבדה המאושרת לשימוש על ידי ארצות הברית מח' חקלאות (USDA) ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית. 1. הכנת ריאגנטים חומר המוצא הערה: עיין בטבלת החומרים כדי להשיג את מקור כל החומרים כימיים. צלחות Fetuin מצופה הכן חיץ ציפוי על ידי ערבוב 10 מ"ל 10x חיץ ציפוי עם 90 מ"ל deionized H 2 O. הכן פתרון המניות של fetuin ב 25 מ"ג / מ"ל ​​במאגר ולאחסן ציפוי 1x ב 500 aliquots μl ב -20 ° C. הכן פתרון עבודה של fetuin (25 מיקרוגרם / מ"ל) מיד לפני צלחות ציפוי על ידי דילול פתרון המניות 1,000 פי חיץ ציפוי 1x. השתמש פיפטה רב לוותר 100 μl של פתרון העבודה של fetuin לתוך אלl בארות צלחת 96-היטב כי יש קיבולת מחייב חלבון גבוהה. כיסוי כל צלחת עם אוטם צלחת מכן הנח את הצלחות בקבוצות של 10 ועוטפים אותם בנייר כסף. מניחים את הצלחות במקרר (2-8 מעלות צלזיוס) במשך לפחות 18 שעות לפני ביצוע assay. הערה: צלחות עשויות להיות מצופות מראש ולאחסן עם פתרון הציפוי ב 2-8 מעלות צלזיוס עד 2 חודשים. מדלל כדי להכין את diluent לעשות דילולים וירוס מדגם (2- (-morpholino N) חומצה ethanesulfonic (MES), pH 6.5, 20 מ"מ 2 CaCl, 1% אלבומין בסרום שור (BSA) ו -0.5% Tween 20), לערבב 94.2 מ"ל 1X MES, pH 6.5 עם 2 מ"ל CaCl 2 (10 מ"ג / מ"ל), 3.3 מ"ל 30% BSA ו -0.5 מ"ל Tween 20. כדי להכין את diluent עבור PNA-HRPO (MES, pH 6.5 עם 20 מ"מ CaCl 2 ו 1% BSA), לערבב MES 94.7 מ"ל 1x, pH 6.5 עם 2 מ"ל CaCl 2 (10 מ"ג / מ"ל), ו -3.3 מ"ל 30% BSA . Neuraminidase (NA) הערה: reass וירוס H6Nxortants (יש אלה HA של תת-סוג H6 ואת NA עניין), נוצרים בעקבות שיטות שפורסמו 5,10. בקש בקבוקונים של וירוס reassortant מומת מן משתף פעולה אם הם אינם זמינים ללא צורך במיקור חוץ. בעת שימוש וירוס מומת, לאשר, כי ההכנה מתאימה לשימוש ELLA באמצעות הפגנה שתהליך האיון לא היה השפעה מהותית על פעילות אנ-האיים. תרבות מלאה של וירוס H6Nx ב ביצי תרנגולת embryonated 11 ולאחסן 0.5 מיליליטר aliquots של נוזל allantoic מסודר ב -80 מעלות צלזיוס. השתמש aliquot חדש של וירוס עבור כל assay. אין להקפיא ולהפשיר את aliquots. דגימות סרום ובקרות מחמם להשבית כל הסרה (דגימות מבחן למשל, סר לפני ואחרי חיסון, כמו גם שולט, למשל, מדגם עם כייל ידוע NI) באמבט מים ב 56 מעלות צלזיוס במשך 45-60 דקות. אחסן את סרה ב -20 עד -70 ° C לפני או אחרי טיפול בחום. אם samples הם להיבדק שוב ושוב, לבצע מספר aliquots לפני ההקפאה כך המדגם אינו קפוא שוב ושוב מופשר. השתמש ELLA למדוד את טיטר NI של סרה אדם הזמינים בכמות סבירה (> 5 מ"ל) לזהות לפחות אחד עם כייל נמוך ואחר עם כייל גבוה. אחסן 100 aliquots μl כמו ≤-20 ° C, כך מדגם זהה יכול לשמש כביקורת מבחני רבים כדי לעקוב אחר ביצועי assay. בוטנים agglutinin (PNA) -Horseradish Peroxidase (HRPO) הכן את diluent PNA-HRPO (MES, pH 6.5 עם CaCl 2 ו 1% BSA). הכן פתרון המניות PNA-HRPO ידי המסת 1 מ"ג של PNA-HRPO ב 1 מ"ל של diluent. אחסן 20-200 aliquots μl ב -20 ° C. לפני השימוש הרבה PNA-HRPO חדש, מבחן 1: 500, 1: 750, 1: 1,000 ו 1: 2000 דילולים של מגיב זה כדי לזהות את הכמות שתוצאתו OD המקסימלי עם השליטה החיובית (וירוס בלבד) רקע ( לא וירוס) tכובע הוא <10% של האיתות החיובית. הפוך את דילולים וירוס ארבע פעמים כמתואר בסעיף 2.1. מעבירים את דילולים לצלחת מצופה fetuin כמפורט בסעיף 2.2 ו דגירה את הצלחת ב 37 ° C. לשטוף את הצלחת 16-18 שעות מאוחר יותר ולהוסיף 1: 500, 1: 750, 1: 1,000 ו 1: 2,000 דילולים של PNA-HRPO (100 μl / טוב) לשכפל שורות של הצלחת. השלם את assay כמתואר 2.3.4 צעדים 2.3.9. בדוק את הנתונים כדי לבחור את הדילול שכתוצאה ממנה אות מקסימלי היא> 10 פעמים ברקע. מייד לפני השימוש, להכין את הדילול האופטימלי של PNA-HRPO המזוהה 1.5.3. הכינו כמות גדולה של חיץ לשטוף (0.01 M פוספט בופר (PBS), pH 7.4, 0.05% Tween 20 (PBS-T)). חנות ב RT. מכינים את המצע peroxidase (dihydrochloride o-phenylenediamine (OPD)): הערה: מצעים peroxidase חלופיים כגון 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB), ניתן להשתמש הכן חיץ ציטראט-פוספט על ידי המסת 1 כמוסה 100 מ"ל DH 2 O ביום assay. ממיסים 1 טבליה OPD (10 מ"ג) ב 20 מ"ל של חיץ פוספט-ציטראט מיד לפני השימוש. הכן את הפתרון להפסיק (1 NH 2 SO 4): להוסיף 27.2 מ"ל המניה 98% H 2 SO 4 כדי 973 מ"ל DH 2 O. מערבבים ולאחר מכן לאחסן ב RT. 2. קביעת הסכום של NA להשתמש ב ELLA כן דילולי וירוס בצלחת 96-היטב לוותר 120 diluent מדגם μl (סעיף 1.2) לתוך עמודות 1-11 של צלחת דילול. לעמודה 1, להוסיף diluent מדגם תוספות 96 μl. להפשיר ואז מערבולת הבקבוקון של וירוס לפני הוספת 24 μl לשכפל בארות בעמודה 1. זה נותן 1:10 דילול של וירוס. הפוך את דילולים של פי 2 הסידורי של וירוס ב diluent מדגם, על ידי העברת120 μl מאחד היטב עד קצות פיפטה הבאים באמצעות נקיים עבור כל דילול. העבר וירוס דילולים לצלחת Fetuin מצופה שטוף את פעמי צלחת 3 מצופה fetuin עם PBS-T (סעיף 1.6) ולאחר מכן למחוק כל צלחת על מגבת נייר סופגת כדי להסיר כל חיץ לשטוף עודף. הוסף 50 μl של מדגם diluent (סעיף 1.2.1) זה טוב בטורים 1 עד 11 מתוך צלחת מצופה fetuin. הוספת 100 μl של המדגם diluent לעמודת 12 (בארות אלה הן השליטה השלילית). העברה 50 μl של נגיף בדילול מעמודות 1-11 של צלחת הדילול על הבארות המקבילות של צלחת מצופה fetuin. מכסים את הצלחת עם אוטם צלחת ואז למקם אותו בתוך חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס. רשום לעצמך את הזמן שבו השלבים הנותרים יבוצע (16-18 שעות מאוחר יותר). השלם את קביעת NA כאשר הדגירה תושלם (16-18 שעות), להעביר אתהצלחת אל הספסל ולהסיר את אוטם צלחת. לשטוף את הצלחת 6 פעמים עם PBS-T (סעיף 1.7) ולאחר מכן להפוך ו טפיחה על מגבות נייר סופגות על מנת להבטיח את כל הנוזל הוסר מהבארות. הוספת 100 μl / גם פתרון PNA-HRPO (בדילול שנקבע 1.5.3) לכל בארות דגירה צלחת עבור שעה 2 ב RT. פחות מ -15 דקות לפני הדגירה היא בסופו של דבר, להכין את פתרון OPD כמפורט בסעיף 1.7. שטפו את צלחות הבדיקה 3 פעמים כדי להסיר את PNA-HRPO כתם יבש לפני הוספת 100 μl של המצע OPD היטב כל אחד. דגירה את הצלחת למשך 10 דקות בדיוק ב RT. עצור את התגובה על ידי הוספת 100 μl / טוב של חומצה גופרתית 1N. שימוש בקורא צלחת למדוד את הצפיפות האופטית (OD) ב 490 ננומטר עבור 0.1 שניות. לשמור ולייצא את כל קבצי הנתונים. בחר את דילול הווירוס אשר ישמש עבור סרולוגיה ציירו גרף, חלקות 490nm OD </sUB> ערכים בכל דילול וירוס. בדוק את עקומת טיטרציה לזהות את האות המרבי (זה בדרך כלל את האות המתאים רמה בתחילת עקומת טיטרציה), האות המינימלי (בארות שאינם מכילים וירוסים בטור 12 של הצלחת לספק שליטה רקע), ואת הדילולים של נגיף לגרום OD כי הוא יחסי דילול הקלט (כלומר, באזור הליניארי של העקומה). בחר את דילול וירוס שנותן כ 90% של האות מקסימלית נמצא בטווח ליניארי. ודא OD ב הדילול הנבחר הוא לפחות פי 10 יותר מאשר אות הרקע. השתמש דילול וירוס שנבחרו עבור כל מבחני המעסיקות מניות וירוס המסוים הזה. הערה: לחלופין, למדוד את פעילות NA של הנגיף ולהשתמש ~ 15-20 μU NA פעילות / מ"ל ​​ב ELLA. 3. Enzyme-linked Assay לקטינים הערה: איור 2 shoWS ההתקנה של צלחות דילול assay. הפוך את דילולים לדוגמא מניחים את דגימות חום מומת על הקרח. הערה: 8 סרה יכולה להיות מדוללת כל צלחת. במשך להגדיר באמצעות דילולים החל בשעה 1:10 פני הצלחת, להוסיף 120 μl diluent מדגם לכל בארות בטורים 3-11. לעמודה 2, להוסיף 216 μl של diluent מדגם ו -24 μl של כל דגימה. מערבבים את הדוגמה גם על ידי pipetting למעלה ולמטה 3 פעמים ולאחר מכן להעביר 120 μl לעמודה הבאה. לאחר שינוי עצות פיפטה, לערבב את התכולה היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה ולאחר מכן להעביר 120 μl לעמודה הבאה. חזור על שלב 3.1.4 עד המדגם הועבר עמודת 11 ואת מושלך 120 μl הנותרים. להוסיף דוגמאות וירוס על רפידת Fetuin מצופה להפשיר בקבוקון של וירוס, מערבולת resuspend נגיף diluent (סעיף 1.2) בשעת הדילול כי נבחר בשלב 2.4.2. הכן לפחות 5 מ"ל של וירוס עבור כל צלחת assay. שמור את הנגיף מדולל על קרח עד הצלחות נשטפות דגימות סרום נוספו הצלחת. החלט על מספר הצלחות המצופה fetuin כי יש צורך עבור assay (בדרך כלל להחיל 4 סרו לכל צלחת). שטוף את פעמי צלחת 3 מצופה fetuin עם PBS-T ולאחר מכן להפוך כל צלחת כתם על מגבת נייר סופגת כדי להסיר חיץ לשטוף עודף. השתמש פיפטה רבה להעביר 50 μl של כל פקד בסרום או דילול מדגם מהצלחת הדילול לתוך בארות כפולות בטורי 2-11. הוסף 50 μl של הנגיף בדילול לכל בארות למעט הביקורת השלילית (עמודה 12). הוסף 50 μl של מדגם diluent לבארות בטור 1 ולהוסיף 100 μl של diluent מדגם לעמודה 12. מכסים את הבארות עם אוטם צלחת ואז לערבב ידי הקשה צידי הצלחת או הצבת בעדינות על צלחת שייקר במהירות בינונית במשך 10 שניות. מניחים את צלחת humidifחממת מטען ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16-18 שעות. להוסיף PNA-HRPO ולהשלים את assay, כמתואר בסעיף 2.3 ניתוח 4. נתונים קבע את תוקפן של תוצאות Assay אשר שערך הרקע (לא וירוס) נמצאים במרחק של פחות מ -10% של שליטה החיובית (וירוס ואין נסיוב). ודא טיטר של ריצת סרה שליטת מבחנים שונים באמצעות אותם התנאים נמצא במרחק של פי 2 של כייל החציוני. אשר שמדידות OD של בארות שליטה הנן עקביות (≤20% אחרים) וכי מדידות OD של בארות מדגם כפולות עולות בקנה אחד (≤10% שונה). לקבוע את סיבת השורש של תוצאות לא חוקיים וחזור על assay אם הקריטריונים המפורטים 4.1.1, 4.1.2 או 4.1.3, לא ייענו. בחשבון את הגורמים מוצגים בלוח 1 כאשר מנסים לפתור. קצה כייל סוף נקודות 50% עבור כל צלחת assay, סוbtract ברקע הממוצע (לא אנטיגן הוסיף לבארות) מכל הקריאות. חשב את עיכוב אחוז בכל דילול בסרום באמצעות הנוסחה: 100 x (וירוס OD רק שליטה – מדגם הבדיקה OD) / וירוס OD רק שליטה. זהה את הדילול הגבוה ביותר שכתוצאה ממנה לפחות עיכוב 50% של האות המרבי. דווח ההופכי של דילול זה כמו כייל נקודת הסיום 50%. הערה: אם עיכוב 50% לא הושג בכל דילול, כייל הוא פחות הדילול הראשון שנבדק, למשל, <10 כאשר 1:10 הוא הדילול הראשון שנבדק. חשבתי את הריכוז המעכב 50% (IC 50) השתמש ארבע רגרסיות לוגיסטיות פרמטר לקביעה כייל 50 IC כדלקמן: להפחית את הרקע הממוצע מכל הקריאות ולאחר מכן להעביר את תוצאות תכנית מבצעת ניתוח רגרסיה. השתמש רגרסיה שאינו ליניארי, עם סט המרבילנגיף רק לשלוט ואת המינימום נקבע לאפס, כדי לקבוע את הדילול מתאים עיכוב 50% בדיוק. דווח ההופכי של דילול זה כמו כייל 50 IC.

Representative Results

את assay הציג בכתב היד הזה מוצג בתרשים באיור 1. איור 2 מראה 96 הפריסה צלחת יפה, ומציין כי דילולים סדרתי של דגימות סרום ערוכים צלחת דילול לפני העברת אותם לצלחת מצופה fetuin. פרמטר קריטי של assay הוא כמות נורמינידאז המשמש ב assay; זו נקבעת באמצעות טיטרציה של הנגיף reassortant. דוגמאות titrations וירוס H6N1 ו- H6N2 מוצגות באיור 3. בשעת 1:10, 1:20 1:40 דילולים של H6N1, הצפיפות האופטית דומה, המציין כי התנאים היו כאלה שקריאה מקסימלי הושגה. בדילול 1:80, הבא מחוץ לקרוא היה כ 90% של לכל היותר ולכן דילול זה של וירוס שמש מבחנים הבאים. דוגמאות titrations בסרום מוצגות באיור 4. האיור מציג מדגם בסרום אדם כי היה titrated נגד H6N1 ווירוסים H6N2. כל נקודת נתונים מציגה את עיכוב אחוז מפעילויות NA שהושגה על ידי דילולים סדרתי של בסרום; דילול בסרום הראשון assay H6N1 היה 1:80; הדילול של הסרום הראשון assay H6N2 היה 5. מאז הדילול הגבוה ביותר שתוצאתו עיכוב ≥50% הוא כייל נוגדני NI, כייל של הסרום שניתן לראות בדוגמא זו היא 640 נגד NA של NC / 99 (N1) ו -160 נגד NA של WI / 05 (N2). . באיור 1. סכמטי של פרוטוקול ELLA (א) קביעת דילול של אנטיגן (וירוס) להשתמש ב assay (שלב 2 לפרוטוקול): דילולים וירוס מתווספים צלחת fetuin מצופה ואת פעילות NA נמדדת לכימות שאריות גלקטוז מסוף דרך המחייב של PNA-HRPO כמתואר בשלב 2.3 של פרוטוקול; (B </stron קביעת g>) של טיטר נוגדנים NI בסרום (שלב 3 לפרוטוקול). דוגמאות מדוללות ולאחר מכן הועברו צלחת fetuin מצופה שבו וירוס הוא הוסיף. הצלחת היא מודגרות O / N לפני הוספת PNA-HRPO והשלים את הצעדים הדרושים כדי ליצור תגובת צבע. לבסוף, תגובת הצבע הוא עצר את הצפיפות האופטית נמדדת. ההופכי של דילול המדגם שתוצאתו לפחות עיכוב 50% מהיקף פעילות NA הוא כפי שדווח כייל נקודת סיום 50%. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2. תרשים להראות הצלחת ELLA להגדיר. דילולים סידוריים של דגימות סרום מתקבלים צלחת דילול ולאחר מכן הועברו צלחת מצופה fetuin. 3fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3. דוגמאות של titrations וירוס H6N1 ו- H6N2. דילולים סידוריים של H6N1 BR / 07 (NA של A / Brisbane / 59/2007 (H1N1) המוצג בסמלים כחולים) H6N2 UR / 07 (NA של A / אורוגוואי / 716 / 2007 (H3N2) המוצג בסמלים אדומים) הודגרו במשך 18 שעות צלחות מצופות fetuin ואת תגובתיות עם PNA-HRPO נקבעה כמתואר. מְמוּצָע 490nm OD של 2 בארות זמם נגד הגומלין של דילול הווירוס. הדילול של H6N1 שנבחר לשימוש ELLA היה 1:80 ואת הדילול של H6N2 שנבחר היה 1:40 כי דילולים אלה הביאו כ 90% של הצפיפות האופטית מקסימלית היו בטווח ליניארי.3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 4. טיטרציה של נסיוב נגד NA של N1 (סמלים אדומים) ו- N2 (סימנים כחולים) תת. טיטר עיכוב NA נמדדו מפני וירוסים reassortant H6N1 NC / 99 (מכיל את NA של A / ניו קלדוניה / 20/1999 (H1N1) ) ו WI / 05 H6N2 (מכיל את NA של A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2)). עיכוב האנזים באחוזים עבור דילולים סדרתי של סרום מוצג עם קו אופקי מקווקו המציין עיכוב 50%. את titers עיכוב NA נגד NAS של A / ניו קלדוניה / 20/1999 (H1N1) (NC / 99) ו- A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2) (WI / 05) היו 2 9.3 (640) ו -2 7.3 ( 160), בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גדול version של נתון זה. בְּעָיָה גורמים אפשרים) פִּתָרוֹן אות חלש או לא רמה הגיעה ב טיטרציה וירוס i) פעילות NA האנזים נמוכה ii) מניות וירוס אינו מאוחסן בתנאים אופטימליים i) מאשרת כי diluent יש pH כי הוא אופטימלי עבור פעילות לא ידועה; אם pH הוא אופטימלי, להכין מלאי וירוס חדש או להתרכז וירוס ii) Regrow ומלאה aliquot; בקבוקוני Snap-הקפאת קרח יבש לפני האחסון ב -80 ° C צבע חלש או לא בבארות מלאות תא חיוביות i) דילול וירוס שהוקצה באופן שגוי ii) ויאל אל בקבוקון השתנות aliquots וירוס קפוא iii) PNA- HRPO מפוגל או מדולל יותר מדי iv) OPD שגוי הכין אני); טיטרציה וירוס חזור ii) לכיל כמה בקבוקונים מאותו אצווה כדי להבטיח שאין השתנות. אם שונה משמעותי, להכין aliquots הטרי iii) השתמש דילול וירוס אופטימלי retitrate PNA- HRPO iv) חזור עם הכנה טריה של OPD חלש או לא עיכוב על ידי סרה בקרה חיובית i) מדי וירוס המשמש assay ii) סרום התדרדר i) טיטרציה וירוס חזור ii) השג תנאי האחסון בדוק נסיובי חדש עיכוב על ידי סרה בקרה שלילית i) טיפול בחום לקוי של סרום ii) וירוס מעט מדי המשמש assay i) חזור חום-איון של סרום ii) טיטרציה וירוס חזור רקע גבוה i) זיהום אפשרי של צלחות ii) PNA- HRPO ריכוז גבוה מדי / נמוך מדי i) חזור באמצעות צלחות מצופות טרי ii) לכיל PNA-HRPO לזהות דילול נכון להשתמש טיטרציה וירוס מראה עיכוב ניכר של הפעילות NA ב דילולים נמוכים i) allantoic נוזל עשוי להכיל מצע עבור NA ii) וירוס השתמש כבר pelleted באמצעות כרית סוכרוז טבלת 1. ניתוח שורש בעיה של מבחנים שאינם עומדים בקריטריוני ביצועים. טבלה זו מספקת סיבות ופתרונות אפשריים לבעיות שעלולות להתרחש בעת ביצוע אלה.

Discussion

את assay לקטינים enzyme-linked היא שיטה מעשית למדוד טיטר נוגדנים NI ב סרה. למרות ELLA תואר על ידי Lambre et al., בשנת 1990, וקבלתה assay סרולוגית סטנדרטית כבר יותר אחרונה, עם מעבדות רבות ביצוע assay למדוד טיטר נוגדני NI דגימות קליניות 12-16. שינויים מסוימים ניתן לבצע צעדי פרוטוקול ללא השפעה גדולה על טיטר NI נמדדים. לדוגמה, PBS יכול לשמש diluent, לעומת זאת, זה מאוד עוזר להשוות את עקומות טיטרציה וירוס למאגר מומלץ (MES, pH 6.5) ו PBS לפני שמתקבלת החלטה, כמו כמה תת NA צמצמו פעילות האנזים משמעותית pH> 7.0. כאשר החומציות האופטימלית אינה משמשת, את האות של וירוס המרבית עשויה להיות מופחתת, כך שנעשה השימוש של כמות מוגזמת של אנטיגן (כלומר, וירוס) ב assay; בתנאים אלה, עלולה לקבל את assay רגישה מופחתת.

חלק לאn ספציפי עיכוב הוא ציין כאשר סר מטופל נבדקים אלה. זה נעלם באמצעות טיפול בחום (56 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות), המעידים על נוכחות של thermolabile מעכבי β. מעכבים שאינם ספציפיים אחרים (α ו ממדרגת γ) של שפעת HA תוארו, במיוחד ביחס hemagglutination ו infectivity וירוס H3N2. ואכן, עיכוב הלא ספציפי הוא ציין גם ELLA כאשר וירוסי H3N2 משמשים כמקור לא ידוע; עיכוב זה הוסר על ידי טיפול של דגימות סרום עם כמות קטנה של sialidase 9.

באשר מבחן סרולוגית אחר, שולט שלילי וחיובי צריך להיכלל כל assay לספק אמצעי כדי להעריך את ביצועי assay. כאשר assay לא עמד בקריטריונים לקבלה, הסיבה צריכה להיות מזוהה. טבלה 1 מספקת שורה של צעדים פוטנציאליים assay שיכול להיות ממוען לפתור בעיות.

Prov פרוטוקול ELLAided בדוח זה משתמש וירוסים reassortant המכילים את המקור HA מנגיף העופות, כמקור של אנ-איי. מצב זה מציב הגבלת ביצוע assay כי נדרש היתר לעבוד עם וירוסי עופות פתוגניים נמוכים. ניתן לשתף וירוסי H6Nx reassortant בין מעבדות אחרי שהם כבר מומתים. לכן assay יכול להתנהל באמצעות שיתופי פעולה פעם במעבדה ליצירת נגיף reassortant הוכיחה כי האיון יושלם וההכנה שמרת פעילות NA שלה. האילוץ של שימוש H6Nx וירוסים reassortant ניתן להתגבר על ידי שימוש במקורות שאינם מדבקים של אנ-איי. לדוגמה, מעבדות כמה השתמשו מטוהרים רקומביננטי NA 17, בעוד שאחרים השתמשו חלקיקים דמויי וירוס (VLPs) 15. עם זאת, לא רקומביננטי NA ולא VLPs זמין ולכן אנו ממשיכים להשתמש נגיפי שפעת עם HA עופות antigenically-תואם.

המסורתישיטה למדידת טיטר נוגדנים NI אינה מעשית מכמה סיבות; הבעייתי ביותר הם הכימיקלים המזיקים כי יש צורך לייצר תגובת צבע. בנוסף, כמויות גדולות של מדגם נדרשות ואת assay מסורבל לבצע. לעומת זאת, אלה הן קלות לביצוע היא בפורמט המאפשר טיטרציה של מספר סביר של דגימות. נתונים ממחקרים שבדקו להראות השתנות ELLA כי תשואות assay לשחזור 7,8 תוצאות. ELLA יש וכתוצאה מכך גרם מדידה שגרתית של טיטר נוגדנים NI אפשרי, ויש להניח כי הוא ישמש בתדירות גבוהה יותר על ידי מעבדות עורכים מחקרים סרולוגית.

ישנם מספר שלבים קריטיים כי צריך להילקח בחשבון בעת ​​ביצוע אלה. ראשית, מעכבים הלא ספציפיים של פעילות NA יש להסיר. מעכבים אלה הם בדרך כלל thermolabile ו נהרסים על ידי טיפול בחום ב 56 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. עיבוד תרמי מספיק לבטל-ספציפי שאינוFIC מעכבי ממדגמים כאשר וירוסים reassortant H6 משמשים כמקור NA, לעומת זאת, כאשר וירוסים H3N2 משמשים ELLA, גורמים בסרום אשר נקלטות על ידי hemagglutinin גם להפריע ELLA וצריך להסירו באמצעות טיפול עם כמות קטנה של sialidase לפני טיפול בחום 9. שנית, כמות מוגזמת של אנטיגן, כלומר, וירוס H6Nx reassortant, לא אמור לשמש כמו זה מקטין את הרגישות של assay. טיטרציה של וירוס זהירות היא אפוא צעד חיוני; כמות האנטיגן המשמשת כל assay חייבת לספק אות כי הוא הרבה מעל הרקע, והוא חייב להיות בטווח הליניארי של עקומת טיטרציה, כלומר, האות (צפיפות אופטית) חייבת להיות פרופורציונלית דילול הווירוס.

בנוסף סרולוגיה שגרתי, ELLA ניתן להשתמש כדי להעריך הבדלים אנטיגני בין NAS של נגיפי שפעת עונתית. מידע זה עשוי להיות מועיל מאוד בעת בחירת זני וירוס עבור הכללהים מועמדי חיסון יקל הבנה טובה יותר של לחצים חיסוניים הגורמות להיסחף אנטיגני של אנ-איים. בנוסף, ניתוח אנטיגני של NAS מפני וירוסי שפעת חזירים או עופות עשוי לספק מידע קריטי בקביעת הפוטנציאל המגיף של זנים מתעוררים.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This project was funded by intramural PanFlu funds from the Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Plasmids used to prepare reassortant viruses were kindly provided by Robert Webster, St Jude Children’s Research Hosptial, Memphis, TN. We are indebted to Ewan Plant and Haruhiko Murata for critical review of the manuscript.

Materials

coating buffer  KPL 50-84-01
 fetuin Sigma F3385
5X MES, pH 6.5  KD-Medical PBS-0134
CaCl2 Sigma C7902
30% BSA Sigma A8327
Tween 20 Sigma P1379
Lectin PNA-HRPO Sigma  L7759
PBS-T Sigma P3563-10PAK
o-Phenylenediamine dihydrochloride Sigma P8287
phosphate-citrate buffer Sigma P4922
Sulfuric acid Sigma 258105
96-well  Maxisorp plates NUNC 439454
96-well round bottom well plates NUNC 267245
Plate sealers Thermo Scientific  14-245-192B
chicken eggs Charles River Laboratories 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs
multichannel pipette Variety of suppliers e.g., Rainin, Eppendorf 8 or 12 channel manual pipettem 50-250 µl volume
Pipette tips Depends on pipettor brand Depends on pipettor brand
Plate reader, with 490 nm filter Perkin Elmer Victor V
water bath set to 37 °C Variety of suppliers  Variety of models
water bath set to 56 °C Variety of suppliers  Variety of models
refrigerator set to 4 °C Variety of suppliers  Variety of models
incubator set to 37 °C Variety of suppliers  Variety of models
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kilbourne, E. D., Laver, W. G., Schulman, J. L., Webster, R. G. Antiviral activity of antiserum specific for an influenza virus neuraminidase. J Virol. 2 (4), 281-288 (1968).
  2. Compans, R. W., Dimmock, N. J., Meier-Ewert, H. Effect of antibody to neuraminidase on the maturation and hemagglutinating activity of an influenza A2 virus. J Virol. 4 (4), 528-534 (1969).
  3. Schulman, J. L., Khakpour, M., Kilbourne, E. D. Protective effects of specific immunity to viral neuraminidase on influenza virus infection of mice. J Virol. 2 (8), 778-786 (1968).
  4. Murphy, B. R., Kasel, J. A., Chanock, R. M. Association of serum anti-neuraminidase antibody with resistance to influenza in man. N Engl J Med. 286 (25), 1329-1332 (1972).
  5. Sandbulte, M. R., Gao, J., Straight, T. M., Eichelberger, M. C. A miniaturized assay for influenza neuraminidase-inhibiting antibodies utilizing reverse genetics-derived antigens. Influenza Other Respi Viruses. 3 (5), 233-240 (2009).
  6. Lambre, C. R., Terzidis, H., Greffard, A., Webster, R. G. Measurement of anti-influenza neuraminidase antibody using a peroxidase-linked lectin and microtitre plates coated with natural substrates. J Immunol Methods. 135 (1-2), 49-57 (1990).
  7. Couzens, L., et al. An optimized enzyme-linked lectin assay to measure influenza A virus neuraminidase inhibition antibody titers in human sera. J Virol Methods. 210C, 7-14 (2014).
  8. Eichelberger, M. C., et al. Comparability of neuraminidase inhibition antibody titers measured by enzyme-linked lectin assay (ELLA) for the analysis of influenza vaccine immunogenicity. Vaccine. 34 (4), 458-465 (2016).
  9. Westgeest, K. B., et al. Optimization of an enzyme-linked lectin assay suitable for rapid antigenic characterization of the neuraminidase of human influenza A(H3N2) viruses. J Virol Methods. 217, 55-63 (2015).
  10. Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y., Hobom, G., Webster, R. G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 6108-6113 (2000).
  11. WHO. . Manual of Animal Influenza Diagnosis and Surveillance. , (2002).
  12. Cate, T. R., et al. A high dosage influenza vaccine induced significantly more neuraminidase antibody than standard vaccine among elderly subjects. Vaccine. 28 (9), 2076-2079 (2010).
  13. Couch, R. B., et al. Antibody correlates and predictors of immunity to naturally occurring influenza in humans and the importance of antibody to the neuraminidase. J Infect Dis. 207 (6), 974-981 (2013).
  14. Fritz, R., et al. Neuraminidase-Inhibiting Antibody Response to H5N1 Virus Vaccination in Chronically Ill and Immunocompromised Patients. Open Forum Infect Dis. 1 (2), (2014).
  15. Fries, L. F., Smith, G. E., Glenn, G. M. A recombinant viruslike particle influenza A (H7N9) vaccine. N Engl J Med. 369 (26), 2564-2566 (2013).
  16. Monto, A. S., et al. Antibody to Influenza Virus Neuraminidase: An Independent Correlate of Protection. J Infect Dis. 212 (8), 1191-1199 (2015).
  17. Fritz, R., et al. A vero cell-derived whole-virus H5N1 vaccine effectively induces neuraminidase-inhibiting antibodies. J Infect Dis. 205 (1), 28-34 (2012).

Tags

InfluenzaNeuraminidaseAntibodyELLAEnzyme-linked Lectin AssayH6 Reassortant VirusFetuin-coated PlatePeanut AgglutininHRPVaccine

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gao, J., Couzens, L., Eichelberger, M. C. Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay. J. Vis. Exp. (115), e54573, doi:10.3791/54573 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image