قياس الأنفلونزا النورامينيداز تثبيط الجسم المضاد التتر من قبل انزيم مرتبط كتين الفحص
Summary
We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.
Abstract
الأجسام المضادة لالنورامينيداز (NA)، والثاني الأكثر وفرة بروتين على سطح فيروس الانفلونزا، تساهم نحو حماية ضد الانفلونزا. الطرق التقليدية لقياس NA تثبيط (NI) التتر الضد ليست عملية لالأمصال الروتينية. يصف هذا البروتوكول كتين فحص انزيم مرتبط (إيلا)، وهي طريقة بديلة العملي لقياس التتر NI التي يتم تنفيذها في 96 لوحات جيدة المغلفة مع الركيزة بروتين سكري كبيرة، فتوين. يشق NA الأحماض محطة اللعابي من فتوين، وفضح السكر قبل الأخير، الجلاكتوز. الفول السوداني راصة (السلطة الوطنية الفلسطينية) هي كتين مع خصوصية لسكر اللبن، وبالتالي مدى desialylation يمكن قياسها كميا باستخدام المترافقة البيروكسيديز والسلطة الوطنية الفجل، تليها إضافة الركيزة البيروكسيداز اللونية. الكثافة البصرية التي يقاس يتناسب مع النشاط NA. لقياس NI التتر الأجسام المضادة، يتم تحضين التخفيفات المسلسل من الأمصال في 37 ° CO / N على لوحات المغلفة فتوين مع مبلغ ثابت سو NA. يعين متبادلة من أعلى تخفيف المصل الذي ينتج في ≥50٪ تثبيط النشاط NA باسم عيار الأضداد NI. يوفر إيلا شكل عملي لتقييم الروتيني للاستجابات الأجسام المضادة البشرية بعد الإصابة بالأنفلونزا أو التطعيم.
Introduction
النورامينيداز (NA) هو بروتين سكري أعرب على سطح virions الأنفلونزا. نشاط انزيم لها أمر ضروري لإطلاق جزيئات الفيروس شكلت حديثا من الخلايا المصابة 1،2. الأجسام المضادة التي تمنع NA النشاط يقلل التتر فيروس واعراض المرض في النماذج الحيوانية 3 وترتبط مع المقاومة ضد المرض لدى البشر (4). ولذلك قد زيادة في NA تثبيط (NI) التتر التطعيم التالية تكون مؤشرا على فعالية اللقاح، ولكن العديد من الدراسات المناعية أنفلونزا الماضي لم يتضمن هذه نقطة النهاية لأن الفحص التقليدي لقياس NI التتر الضد هو غير عملي لالأمصال الروتينية.
وتستند هذه الطريقة التقليدية لقياس التتر NI على قياس كمية الحامض اللعابي الذي المشقوق من غليكوكونجوغاتيس التي كتبها NA 1. هذه الطريقة، وغالبا ما يشار إليها على أنها طريقة thiobarbituric حمض (TBA)، يستخدم المواد الكيميائية الخطرة لتحويل التيار المتردد اللعابيمعرف لحامل اللون التي يمكن قياسها كميا بواسطة مطياف. الفحص غير مناسب لاختبار عدد كبير من العينات لأنه يتم استخدام أنابيب زجاجية الفردية، مما يجعل فحص مرهقة. التصغير للمقايسة ل96 لوحات جيدة يوفر شكل عملي أكثر 5، ولكن هذا الاختبار لا يزال يتطلب استخدام المواد الكيميائية السامة، وبالتالي ليست مثالية.
وقد تم تطوير مقايسة بديل لقياس NI التتر الضد من Lambré وآخرون. 6. هذا الاختبار يقيس نشاط انزيم عن طريق قياس كمية من السكر قبل الأخير من بروتينات سكرية، اللبن، التي تصبح مكشوفة عندما يتم تحريرها الحامض اللعابي التي كتبها NA. منذ الفول السوداني راصة (PNA) يربط على وجه التحديد إلى اللبن، والبيروكسيديز السلطة الوطنية الفلسطينية، الفجل (HRPO) المترافقة يمكن استخدامها للحصول على اللونية للقراءة خارج. الكثافة البصرية التي تقاس بالتالي تتناسب مع النشاط NA في العينة. يتم قياس التتر NI من خلال تحديد أعلى تخفيفمن المصل الذي يمنع 50٪ على الأقل من النشاط NA. يتم إجراء هذا الاختبار كتين انزيم مرتبط (إيلا) في لوحات 96-جيدا المغلفة مع فتوين، وهو بروتين مصل الغليكوزيلاتي للغاية، والركيزة لNA.
وهو عامل مهم لفحوصات لقياس التتر NI، هو مصدر NA. وذلك لأن الأمصال من الأفراد المحصنة أو المصاب يحتوي على أجسام مضادة لهيماغلوتينين (HA) وكذلك الأجسام المضادة لNA. الأجسام المضادة التي تربط إلى HA يمكن أن تتداخل مع نشاط NA، وبالتالي، لتجنب تثبيط غير محدد من الأجسام المضادة HA-محددة، تنقية NA أو فيروس كله يحتوي على HA مستضديا-متطابقة ينبغي أن تستخدم في الفحص. هذه الفيروسات يمكن توليدها عن طريق إعادة التشكيل الكلاسيكي أو عن طريق الوراثة العكسية. والهدف من ذلك هو انقاذ الفيروس الذي يحتوي على HA من نوع فرعي أن لا علاقة لسلالة الهدف، وNA من الفيروس التي يتم دراستها. الفحص الموضحة في هذه المقالة يستخدم فيروسات الأنفلونزا A التي يتم إنشاؤها من قبل القسERSE الوراثة لاحتواء HA من H6 النوع الفرعي وNA المستهدفة من فيروسات الأنفلونزا A، الأنواع الفرعية H1N1 و H3N2 5.
وأظهرت النتائج التي تم إنشاؤها بواسطة إيلا والمقايسات TBA المنمنمة هذه الأساليب قابلة للمقارنة، مع خصوصية سلالة مماثلة، وحساسية 7. إيلا لا تتطلب استخدام المواد الكيميائية الخطرة، وبالتالي هو الأسلوب المفضل لقياس التتر NI. فمن السهل القيام بها، مع خطوات قليلة فقط (الشكل 1): يتم تخفيفه العينات ونقلها إلى لوحة المغلفة فتوين التي فيروس (مصدر NA) يضاف. وحضنت لوحة O / N وغسلها قبل أن يضيف السلطة الوطنية الفلسطينية-HRPO. بعد حضانة 2 ساعة، لوحة يتم غسلها ويضاف البيروكسيديز الركيزة. توقفت رد فعل اللون، وأخيرا يتم قياس الكثافة البصرية وذكرت مقلوب التخفيف العينة التي أسفرت عن 50٪ على الأقل تثبيط النشاط NA مثل 50٪ عيار نقطة النهاية. دراسة داخل المختبر لتقييم reproducibiliأظهر تاي من إيلا أن تقلب لوحة إلى لوحة هو الحد الأدنى وأدى تكرار مشغل إلى مشغل في عدم وجود اختلافات أكثر من 2 أضعاف في عيار 7. وأظهرت دراسة أجريت بين المختبرات لاحقة من تقلب إيلا أن فحص ديه استنساخ جيدة عندما أجريت في مختبرات مختلفة، ويمكن أن إدراج معيار زيادة خفض التباين في النتائج 8. وإيلا مناسبة لقياس NI التتر الأجسام المضادة في مصل الدم لوحات من الدراسات لقاح الإنفلونزا قبل السريرية والسريرية (7) ويمكن أن تستخدم أيضا لتقييم الاختلافات المستضدات بين الجديدات فيروسات الأنفلونزا 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
وكتين فحص انزيم مرتبط هو طريقة عملية لقياس NI التتر الأجسام المضادة في مصل الدم. وعلى الرغم من وصف إيلا التي كتبها Lambre آخرون، في عام 1990، وقد تم قبولها باعتبارها فحص مصل الدم القياسية أكثر حداثة، مع العديد من المختبرات إجراء فحص لقياس NI التتر الضد من العينات السريرية 12-16. بعض التعديلات يمكن إجراء الخطوات بروتوكول دون تأثير كبير على التتر NI التي يتم قياسها. على سبيل المثال، في برنامج تلفزيوني ويمكن استخدام مخفف، ومع ذلك، فإنه من المفيد جدا لمقارنة منحنيات المعايرة الفيروس في المخزن المؤقت موصى بها (MES، ودرجة الحموضة 6.5) وبرنامج تلفزيوني قبل أن يتم اتخاذ قرار، وبعض أنواع فرعية NA خفضت بشكل كبير من نشاط انزيمي في الرقم الهيدروجيني> 7.0. عندما لا يتم استخدام الرقم الهيدروجيني الأمثل، وربما يتم تخفيض إشارة القصوى من الفيروسات، مما أدى إلى استخدام كمية زائدة من المستضد (أي فيروس) في مقايسة. في ظل هذه الظروف، قد يكون الفحص انخفاض حساسية.
بعض لالوحظ تثبيط ن معين عندما يتم اختبار المصل غير المعالجة في إيلا. تتم إزالة هذا عن طريق العلاج للحرارة (56 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة)، مشيرا إلى وجود بالحرارة β-مثبطات. وقد وصفت مثبطات غير محددة أخرى (α ومن الدرجة γ) من انفلونزا HA، ولا سيما فيما يتعلق التراص فيروس H3N2 والعدوى. في الواقع، لوحظ تثبيط غير محددة أيضا في إيلا عندما تستخدم فيروسات H3N2 كمصدر من غير متيسر. تتم إزالة هذا تثبيط عن طريق العلاج من عينات المصل مع كمية صغيرة من سياليداز 9.
أما بالنسبة للفحوصات مصلية أخرى، ينبغي إدراج ضوابط السلبية والإيجابية في كل فحص لتوفير وسيلة لتقييم أداء الفحص. عندما الفحص لم استيفاء معايير القبول، وينبغي تحديد السبب. ويقدم الجدول 1 قائمة من الخطوات المحتملة في مقايسة التي يمكن أن تكون موجهة إلى استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
في سفر الأمثال بروتوكول إيلاعيديد في هذا التقرير يستخدم الفيروسات اندماج تضاعفي التي تحتوي على منشؤها HA من فيروس انفلونزا الطيور، كمصدر للNA. وهذا يمثل الحد لإجراء فحص لأنه مطلوب على تصريح للعمل مع الفيروسات المسببة للأمراض الطيور منخفضة. يمكن أن تكون مشتركة H6Nx الفيروسات اندماج تضاعفي بين المختبرات بعد أن تم المعطل. لذلك الفحص يمكن أن تتم من خلال التعاون مرة المختبر توليد فيروس اندماج تضاعفي أثبتت أن تعطيل اكتمال وإعداد احتفظت النشاط NA لها. القيد من استخدام H6Nx الفيروسات اندماج تضاعفي يمكن التغلب عليها باستخدام مصادر غير المعدية من NA. على سبيل المثال، استخدمت بعض المختبرات المنقى المؤتلف NA 17، في حين أن آخرين قد استخدمت جزيئات الفيروسات مثل (VLPs) 15. ومع ذلك، ليسوا NA المؤتلف ولا VLPs متاحة بسهولة، وبالتالي فإننا نواصل استخدام فيروسات الأنفلونزا مع HA الطيور مستضديا-متطابقة.
التقليديةطريقة لقياس NI التتر الضد هو غير عملي لعدة أسباب. الأكثر إثارة للقلق هي المواد الكيميائية الضارة التي يتم اللازمة لإنتاج رد فعل اللون. وبالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة إلى كميات كبيرة من العينات والفحص هو مرهق للأداء. في المقابل، فإن إيلا هو السهل القيام بها، وهي في شكل يسمح المعايرة من عدد معقول من العينات. البيانات من الدراسات التي فحصت إيلا تقلب تبين أن النتائج غلة فحص استنساخه 7،8. جعلت إيلا بالتالي القياس الروتيني لالتتر NI الأجسام المضادة المحتملة، ومن المتوقع أن يتم استخدامها بشكل متكرر أكثر من قبل مختبرات إجراء دراسات مصلية.
هناك العديد من الخطوات الهامة التي يجب أخذها في الاعتبار عند تنفيذ إيلا. أولا، يجب إزالة مثبطات غير محددة من النشاط NA. هذه المثبطات عادة بالحرارة ودمرت من قبل المعالجة الحرارية عند 56 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. المعالجة الحرارية كافية لإزالة غير SPECI-المرورية مثبطات من عينات عندما تستخدم H6 الفيروسات اندماج تضاعفي كمصدر للNA، ولكن عندما تستخدم فيروسات H3N2 في إيلا، والعوامل المصل التي تربط لهيماغلوتينين تتدخل أيضا مع إيلا ويجب أن يتم التوقف عن العلاج مع كمية صغيرة من سياليداز قبل المعالجة الحرارية 9. ثانيا، كمية زائدة من المستضد، أي فيروس H6Nx اندماج تضاعفي، لا ينبغي أن تستخدم هذا يقلل من حساسية مقايسة. لذا المعايرة حذرا من فيروس هي خطوة أساسية. كمية المستضد المستخدمة في كل تجربة يجب أن يقدم إشارة إلى أن أعلى بكثير من الخلفية، ويجب أن يكون ضمن مجموعة خطية من منحنى المعايرة، أي يجب أن يكون إشارة (الكثافة البصرية) يتناسب مع تخفيف الفيروس.
بالإضافة إلى الأمصال الروتينية، وإيلا يمكن استخدامها لتقييم الاختلافات المستضدات بين الجديدات فيروسات الأنفلونزا الموسمية. قد تكون هذه المعلومات مفيدة جدا عند اختيار سلالات الفيروس لإدراجها فيالصورة المرشحين لقاح وسيسهل فهم أكبر من الضغوط المناعية التي تؤدي إلى انجراف الأنتيجين من NA. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يوفر تحليل الأنتيجين من ناس من فيروسات إنفلونزا الخنازير أو الطيور المعلومات الهامة في تحديد القدرة على إحداث جائحة من سلالات الناشئة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was funded by intramural PanFlu funds from the Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Plasmids used to prepare reassortant viruses were kindly provided by Robert Webster, St Jude Children’s Research Hosptial, Memphis, TN. We are indebted to Ewan Plant and Haruhiko Murata for critical review of the manuscript.
Materials
| coating buffer | KPL | 50-84-01 |
| fetuin | Sigma | F3385 |
| 5X MES, pH 6.5 | KD-Medical | PBS-0134 |
| CaCl2 | Sigma | C7902 |
| 30% BSA | Sigma | A8327 |
| Tween 20 | Sigma | P1379 |
| Lectin PNA-HRPO | Sigma | L7759 |
| PBS-T | Sigma | P3563-10PAK |
| o-Phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 |
| phosphate-citrate buffer | Sigma | P4922 |
| Sulfuric acid | Sigma | 258105 |
| 96-well Maxisorp plates | NUNC | 439454 |
| 96-well round bottom well plates | NUNC | 267245 |
| Plate sealers | Thermo Scientific | 14-245-192B |
| chicken eggs | Charles River Laboratories | 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs |
| multichannel pipette | Variety of suppliers e.g., Rainin, Eppendorf | 8 or 12 channel manual pipettem 50-250 µl volume |
| Pipette tips | Depends on pipettor brand | Depends on pipettor brand |
| Plate reader, with 490 nm filter | Perkin Elmer | Victor V |
| water bath set to 37 °C | Variety of suppliers | Variety of models |
| water bath set to 56 °C | Variety of suppliers | Variety of models |
| refrigerator set to 4 °C | Variety of suppliers | Variety of models |
| incubator set to 37 °C | Variety of suppliers | Variety of models |
References
- Kilbourne, E. D., Laver, W. G., Schulman, J. L., Webster, R. G. Antiviral activity of antiserum specific for an influenza virus neuraminidase. J Virol. 2 (4), 281-288 (1968).
- Compans, R. W., Dimmock, N. J., Meier-Ewert, H. Effect of antibody to neuraminidase on the maturation and hemagglutinating activity of an influenza A2 virus. J Virol. 4 (4), 528-534 (1969).
- Schulman, J. L., Khakpour, M., Kilbourne, E. D. Protective effects of specific immunity to viral neuraminidase on influenza virus infection of mice. J Virol. 2 (8), 778-786 (1968).
- Murphy, B. R., Kasel, J. A., Chanock, R. M. Association of serum anti-neuraminidase antibody with resistance to influenza in man. N Engl J Med. 286 (25), 1329-1332 (1972).
- Sandbulte, M. R., Gao, J., Straight, T. M., Eichelberger, M. C. A miniaturized assay for influenza neuraminidase-inhibiting antibodies utilizing reverse genetics-derived antigens. Influenza Other Respi Viruses. 3 (5), 233-240 (2009).
- Lambre, C. R., Terzidis, H., Greffard, A., Webster, R. G. Measurement of anti-influenza neuraminidase antibody using a peroxidase-linked lectin and microtitre plates coated with natural substrates. J Immunol Methods. 135 (1-2), 49-57 (1990).
- Couzens, L., et al. An optimized enzyme-linked lectin assay to measure influenza A virus neuraminidase inhibition antibody titers in human sera. J Virol Methods. 210C, 7-14 (2014).
- Eichelberger, M. C., et al. Comparability of neuraminidase inhibition antibody titers measured by enzyme-linked lectin assay (ELLA) for the analysis of influenza vaccine immunogenicity. Vaccine. 34 (4), 458-465 (2016).
- Westgeest, K. B., et al. Optimization of an enzyme-linked lectin assay suitable for rapid antigenic characterization of the neuraminidase of human influenza A(H3N2) viruses. J Virol Methods. 217, 55-63 (2015).
- Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y., Hobom, G., Webster, R. G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 6108-6113 (2000).
- WHO. . Manual of Animal Influenza Diagnosis and Surveillance. , (2002).
- Cate, T. R., et al. A high dosage influenza vaccine induced significantly more neuraminidase antibody than standard vaccine among elderly subjects. Vaccine. 28 (9), 2076-2079 (2010).
- Couch, R. B., et al. Antibody correlates and predictors of immunity to naturally occurring influenza in humans and the importance of antibody to the neuraminidase. J Infect Dis. 207 (6), 974-981 (2013).
- Fritz, R., et al. Neuraminidase-Inhibiting Antibody Response to H5N1 Virus Vaccination in Chronically Ill and Immunocompromised Patients. Open Forum Infect Dis. 1 (2), (2014).
- Fries, L. F., Smith, G. E., Glenn, G. M. A recombinant viruslike particle influenza A (H7N9) vaccine. N Engl J Med. 369 (26), 2564-2566 (2013).
- Monto, A. S., et al. Antibody to Influenza Virus Neuraminidase: An Independent Correlate of Protection. J Infect Dis. 212 (8), 1191-1199 (2015).
- Fritz, R., et al. A vero cell-derived whole-virus H5N1 vaccine effectively induces neuraminidase-inhibiting antibodies. J Infect Dis. 205 (1), 28-34 (2012).
