Enzim-linked Lektin Testi tarafından Grip Nöraminidaz İnhibisyon antikor titreleri Ölçme

Kuş bileşenleri ile tüm canlı yeniden düzenlenmiş virüsler biyogüvenlik düzeyi Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı (USDA) ve kurumsal biyogüvenlik komitesi tarafından kullanım için onaylanmıştır bir laboratuvarda -Gelişmiş uygulamaları 2 (BSL2) kullanılarak ele alınması gerekir. Reaktifler ve başlangıç ​​materyalinin hazırlanması 1. Not: Tüm reaktiflerin kaynağını elde etmek için malzemeler Tablo bakın. Fetuin kaplı plakalar 90 ml 10 mi 10x kaplama tampon karıştırarak kaplama tamponu hazırlayın H2O deiyonize -20 ° C'de 500 ul alikolar içinde 1x kaplama tamponu ve mağaza 25 mg / ml'de fetuin bir stok çözelti hazırlayın. 1x kaplama tamponu içinde 1000 kat stok çözelti seyreltilerek kaplama hemen Plakalar, önceden fetuin (25 ug / ml) bir çalışma çözeltisi hazırlayın. al içine fetuin çalışma çözeltisi 100 ul dağıtmak için bir çok kanallı pipet kullanınyüksek protein bağlama kapasitesine sahip 96 oyuklu bir plakanın l kuyu. Daha sonra 10 kişilik gruplar halinde plakaları yığını ve folyo sarın bir plaka kapatıcı ile her plaka örtün. bir deney yapmadan önce bir buzdolabına (2-8 ° C) en az 18 saat tabak yerleştirin. Not: Levhalar önceden kaplandı ve 2 aya kadar 2-8 ° C'de kaplama çözeltisi ile depolanabilir. Dilüentler 94.2 ml karıştırın virüsü ve Numune seyreltileri (2- (N-morfolino) etansülfonik asit (MES), pH 6.5, 20 mM CaCl2,% 1 sığır serumu albümini (BSA) ve% 0.5 Tween 20) yapmak için seyreltici hazırlamak 1X MES, 2 mi CaCl2 (10 mg / ml) ile pH 6.5, 3.3 ml% 30 BSA ve 0.5 ml Tween 20. 2 mi CaCl2 (10 mg / ml) ile 94.7 mi 1 x MES, pH 6.5 karışımı, PNA-HRPO (MES, 20 mM CaCl2 ve% 1 BSA ile pH 6.5) seyreltici hazırlamak ve 3.3 ml% 30 BSA . Nöraminidaz (NA) Not: H6Nx virüsü reassyayınlanan yöntemler 5,10 aşağıdaki ortants (bu H6 alt tipi HA ve ilgi NA var), oluşturulur. onlar in-house mevcut değilse bir ortak çalışan inaktive reassortant virüsü şişeleri talep edin. inaktif virüs kullanırken, hazırlık inaktivasyonu süreci NA aktivitesi üzerinde önemli bir etkisi yoktu gösteri yoluyla ELLA kullanıma uygun olduğunu teyit etmektedir. Kültür, bir embriyo halindeki tavuk yumurtalarının 11 H6Nx Virüsün stok ve -80 ° C'de susuz alantoik akışkan, 0.5 ml lik kısımlar halinde saklayın. Her bir deney için yeni bir virüs kısım kullanın. dondurmak ve alikotları çözülme etmeyin. Serum numuneleri ve Kontroller Tüm serum Isı inaktive (test örnekleri, örneğin, ön ve son aşılama serumlar, hem de kontrol, örneğin, bilinen NI titeri ile, örnek) 45-60 dakika boyunca 56 ° C'de bir su banyosu içinde. ısıl işlem öncesi veya sonrasında -20 -70 ° C 'de sera saklayın. samp Eğerles defalarca test edilmiş numune Tekrar tekrar dondurulup çözülmüş değildir, böylece dondurmadan önce birkaç alikotları yapmak gerekmektedir. Burada inceliği yüksek olan en azından düşük titreye sahip bir başka tespit etmek (> 5 mi), uygun bir miktarda mevcuttur, insan serumlarının NI titrelerini ölçmek için Ella'yı kullanın. olarak 100 ul alikotları Mağaza ≤-20 ° C aynı örnek deney performansı izlemek için bir çok deneylerde bir kontrol olarak kullanılabilir, böylece. Yer fıstığı aglutinini (PNA) -Horseradish peroksidaz (HRPO) PNA-HRPO seyreltici (MES, CaCI2 ve% 1 BSA ile pH 6.5) hazırlayın. 1 ml seyreltici PNA-HRPO, 1 mg eriterek PNA-HRPO stok çözelti hazırlayın. -20 ° C'de 20-200 ul alikotları saklayın. (Pozitif kontrol ile maksimal OD sonuçlanan miktarını belirlemek için bu reaktifin 2000 dilüsyonları (virüs sadece) ve bir arka plan: 500, 1: 750, 1: 1000 ve 1 yeni PNA-HRPO çok test 1 kullanmadan önce Resim virüsü) tşapka <pozitif sinyal% 10. bölüm 2.1'de anlatıldığı gibi dörtlü virüs dilüsyonları olun. Bölüm 2.2'de tarif edildiği gibi, bir fetuin-kaplı plakaya dilüsyonları aktarın ve 37 ° C'de inkübe plakası. 16-18 saat sonra plaka yıkanır ve 1 ekleyin: plaka satır çoğaltmak için, PNA-HRPO 2.000 seyreltileri (100 ul / oyuk): 500, 1: 750, 1: 1,000 ve 1 ile. 2.3.9 adımları 2.3.4 anlatıldığı gibi tahlil tamamlayın. > 10 kez arka plan maksimum sinyal sonuçlandı seyreltme seçmek için verileri gözden geçirin. Kullanımdan hemen önce, 1.5.3 tanımlanan PNA-HRPO optimal dilüsyon hazırlanır. Yıkama tampon maddesi (0.01 M fosfat tamponlu tuz (PBS), pH 7.4,% 0.05 Tween 20 (PBS-T)) büyük hacim hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın. Peroksidaz substratı (o-fenilendiamin dihidroklorür (OPD)) hazırlanması: Not: 3,3 alternatif peroksidaz alt tabakalar 'Kullanılabilir,, 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) Deney gününde 100 mi dH 2 O 1 kapsül çözülmesiyle fosfat sitrat tamponu hazırlayın. Kullanımdan hemen önce, fosfat sitrat tamponu, 20 ml 1 OPD tablet (10 mg) içinde çözülür. Durdurma solüsyonu (1 NH 2 SO 4) hazırlayın: SO 4 973 ml dH 2 O. 27,2 ml stok% 98 H 2 eklemek Karıştırın ve daha sonra oda sıcaklığında saklayın. NA Miktarının Belirlenmesi 2. ELLA kullanın için 96 oyuklu bir plaka içerisinde virüs seyreltmeleri hazırlanması sütun seyreltme plaka 1-11 içine 120 ul numune seyreltici (bölüm 1.2) koyun. sütun 1 için ek 96 ul örnek seyreltici ekleyin. Çözülme ve sonra bu virüsün 1:10 seyreltme verir sütunda 1. kuyuları çoğaltmak için 24 ul eklemeden önce virüs şişesini vorteks. aktararak, örnek seyreltici içinde virüs seri 2 kat seyreltileri yapmakbirinden her iyi seyreltme için bir sonraki kullanarak temiz pipet uçları 120 ul. Bir Fetuin kaplı Plate virüs seyreltmeleri aktarın PBS-T (bölüm 1.6) ile fetuin kaplı plaka 3 kere yıkayın ve daha sonra herhangi bir aşırı yıkama tamponu çıkarmak için emici kağıt havlu üzerine her plaka kurulayın. fetuin kaplı plaka 11 sütun her bir kuyucuğa 1 Örnek seyreltici (bölüm 1.2.1) 50 ul ekle. sütun 12 numune seyreltici 100 ul (Bu kuyular, negatif kontrol olarak) eklenir. Aktarım sütun fetuin kaplı levhanın tekabül eden gözleri seyreltme plaka 1-11 seyreltilmiş virüs, 50 ul. Bir plaka kapatıcı ile örtün ve plaka daha sonra 37 ° C de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde yerleştirin. Geri kalan adımlar (16-18 saat sonra) yapılacaktır hangi zaman not alın. NA Tayini tamamlayın inkübasyon (16-18 saat) tamamlandığında, aktarmaktezgah plaka ve plaka mühürleyen çıkarın. PBS-T (bölüm 1.7) ile plaka 6 kez yıkayın ve sonra ters ve emici kağıt havlu üzerinde pat tüm sıvı kuyulardan kaldırıldı sağlamak. tüm oyuklara (1.5.3 belirlenen seyreltmede) 100 ul / oyuk PNA-HRPO solüsyonu ilave edin ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca plaka inkübe edin. Kuluçka sonunda için az 15 dakika önce, Bölüm 1.7'de tarif edildiği gibi, OPD solüsyon hazırlanır. PNA-HRPO kaldırmak ve her kuyuya OPD substrat 100 ul eklemeden önce kuru leke test plakaları 3 kere yıkayın. Oda sıcaklığında tam olarak 10 dakika boyunca inkübasyona bırakılır. 100 ul / 1 N sülfürik asit ilave ederek reaksiyonu durdurun. 0.1 saniye süreyle 490 nm'de optik yoğunluk (OD) ölçmek için, bir plaka okuyucu kullanarak. Kaydedin ve tüm veri dosyalarını ihracat. Seroloji için kullanılır edilecek Virüs Seyreltme seçin OD 490 araziler bir grafik çizmek </sub> Her virüs dilusyondaki değerleri. (Bu genellikle titrasyon eğrisinin başında bir plato karşılık gelen sinyal), minimum sinyal (arka plan kontrolü sağlamak plakanın 12. kolonunda hiçbir virüs içeren kuyu) maksimum sinyal tanımlamak için titrasyon eğrisini kontrol edin ve giriş seyreltme (eğrisinin, yani lineer bölge) ile orantılıdır OD neden virüs seyreltmeleri. maksimum sinyal yaklaşık% 90 verir ve doğrusal aralıkta virüs seyreltme seçin. Seçilen seyreltme OD en azından arka plan sinyali daha fazla 10 kat olduğunu doğrulayın. Bu, özellikle virüs stokları kullanan tüm deneyleri için seçilen bir virüs seyreltme kullanın. Alternatif virüsün NA aktivitesini ölçmek ve ELLA 15-20 ~ μU NA faaliyet / ml kullanın: Not. 3. Lektin Deneyi enzim-bağlanmış Not: Şekil 2 shoSeyreltme ve deney plakalarının setup ws. Numune seyreltileri yapmak buz üzerinde ısı ile inaktive örnekleri yerleştirin. Not: 8 sera, her plaka seyreltilebilir. Bir plaka üzerinde 1:10 başlayan dilüsyonları kullanarak kurmak için, sütunlar 3-11 tüm kuyulara 120 ul örnek seyreltici ekleyin. 2. sütun için, örnek seyreltici 216 ul her bir numune için 24 ul ekle. yukarı pipetleme ve 3 kez aşağı iyi numune karıştırın ve daha sonra bir sonraki sütuna 120 ul aktarın. pipet uçları değiştirdikten sonra, aşağı yukarı pipetleme kuyu içeriğini karıştırın ve daha sonra bir sonraki sütuna 120 ul aktarın. numunenin kadar adımı yineleyin 3.1.4 sütuna 11 devredilmiştir ve kalan 120 ul atılır. Fetuin kaplı Plate Örnekleri ve Virüs ekle Virüs, girdap bir şişe çözülme ve 2. adımda seçilen seyreltme de seyreltici (bölüm 1.2) virüs tekrar süspansiyon.4.2. Her bir deney plakası için virüsün en az 5 ml hazırlayın. Plakalar yıkanır ve serum numuneleri plakaya ilave edilinceye kadar buz üzerinde seyreltilmiş virüs tutun. Deney için gerekli olan fetuin kaplı plakaların sayısına dair karar (genellikle plaka başına 4 sera uygulanır). PBS-T ile fetuin kaplı plaka 3 kere yıkayın ve sonra her plaka ters ve aşırı yıkama tamponu çıkarmak için emici kağıt havlu üzerine leke. sütun 2-11 yinelenen kuyulara seyreltme plaka her serum kontrolü veya dilusyonun 50 ul aktarmak için çok kanallı pipet kullanın. Negatif kontrol (sütun 12) dışında tüm oyuklara seyreltilmiş virüs, 50 ul ekle. sütun 1 çukurlara örnek seyreltici 50 ul ilave edin ve kolon 12 örnek seyreltici 100 ul ilave edin. Bir plaka kapatıcı ile kuyu Kapak ve yavaşça plaka kenarlarına dokunarak ya da 10 sn orta hızda bir plaka karıştırıcısı üzerinde koyarak karıştırın. Bir humidif plaka koyun16-18 saat boyunca 37 ° C'de ied inkübatör. PNA-HRPO ekleyin ve bölüm 2.3'de anlatıldığı gibi tahlil tamamlamak 4. Veri Analizi Analiz Sonuçlarının Geçerlilik belirleyin Arka plan değerleri (hiçbir virüs) pozitif kontrol (virüs ve hiçbir serumu)% 10'dan daha az olduğundan emin olun. aynı koşullar kullanılarak farklı deneylerde kontrol serumları çalıştırmak titreleri medyan titreye 2 kat içinde olduğundan emin olun. kontrol kuyuları bu OD ölçümleri (≤20% farklı) tutarlı ve yinelenen örnek kuyuların o OD ölçümleri (≤10% farklı) tutarlı onaylayın. Geçersiz sonuçların kök nedenini belirlemek ve 4.1.1, 4.1.2 veya 4.1.3 listelenen kriterler, yerine getirilmediği takdirde tahlil tekrarlayın. Gidermek için çalışırken Tablo 1'de sunulan faktörleri göz önünde bulundurun. % 50 uç nokta titerinin atama Her bir deney plakası, su içintüm okumalardan ortalama arka plan (oyuklara ilave hiçbir antijen) btract. Formülü kullanarak her serum seyreltme de yüzde inhibisyon hesaplayın: 100 x (OD virüs yalnızca kontrol – OD test örneği) / OD virüsü sadece kontrol. Maksimum sinyalin en az% 50 inhibisyon ile sonuçlanmıştır yüksek dilüsyon tanımlar. % 50 uç-nokta titeri olarak seyreltisinin tersi bildirin. Not:% 50 inhibisyon herhangi seyreltme elde değil ise, titre, test edilen ilk seyreltme daha az, örneğin, <10 01:10 test ilk seyreltme olduğunu. % 50 engelleyici konsantrasyonunun hesaplanması (IC50) Regresyon analizi gerçekleştiren bir program sonuçlarını aktarmak sonra tüm okumalardan ortalama arka plan çıkarma ve aşağıdaki gibidir: IC 50 titresi belirlemek için dört parametre lojistik regresyon kullanın. Maksimum seti ile, doğrusal olmayan regresyon kullanınvirüs, sadece kontrolü ve minimum tam% 50 inhibisyon ile karşılık gelen seyreltmenin tespit etmek için, sıfıra ayarlanır. IC50 titresi olarak seyreltisinin tersi bildirin.