酵素結合レクチンアッセイによってインフルエンザノイラミニダーゼ阻害抗体価を測定します

鳥のコンポーネントを持つすべてのライブ再集合体ウイルスは、バイオセーフティーレベル2（BSL2）を使用して処理しなければならない米国農務省（USDA）と制度バイオセーフティ委員会によって使用が承認実験室での実践を-enhanced。 試薬および出発材料の作製注：すべての試薬 ​​の供給源を得るために、 材料表を参照してください。 フェチュインでコーティングされたプレート脱イオンH 2 Oで90 mlので10ml 10×コーティング緩衝液を混合することにより、コーティング緩衝液を調製 -20℃で500μlのアリコートで1×コーティングバッファーとストア内の25ミリグラム/ mlのフェチュインのストック溶液を準備します。 すぐに原液を1×コーティングバッファーを1,000倍希釈してプレートをコーティングする前に、フェチュインの作業溶液（25μg/ ml）を準備します。 アルへフェチュインのワーキング溶液100μlを分配するためにマルチチャンネルピペットを使用して、高タンパク質結合能を有する96ウェルプレートのLウェル。 その後、10のグループにプレートをスタックし、ホイルでラッププレートシーラーで各プレートをカバーしています。 アッセイを行う前に、少なくとも18時間、冷蔵庫（2〜8℃）でプレートを置きます。 注意：プレートを、事前にコーティングされ、最大2ヶ月間2-8℃で塗布液を記憶することができます。 希釈剤ウイルスサンプルの希釈（2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）、pH6.5の、20mMのCaCl 2を、1％ウシ血清アルブミン（BSA）および0.5％のTween 20）を、94.2 mlと混合するために希釈剤を調製するために1X MES、2ミリリットルのCaCl 2（10 mg / mlで）3.3 mlの30％BSAおよび0.5 mlのツイーン20でpH 6.5。 2ミリリットルのCaCl 2（10mg / ml）で94.7ミリリットルの1x MES、pHが6.5を混ぜ、PNA-HRPO（MES、20mMのCaCl 2を、1％BSAを用いてpH 6.5）のための希釈剤を準備し、3.3ミリリットルの30％BSAに。 ノイラミニダーゼ（NA） 注：H6Nxウイルスreass公開された方法5,10以下ortants（これらはH6サブタイプのHAと関心のNAを持っている）、生成されます。彼らは、社内で使用できない場合、協力者から不活性化された再集合体ウイルスのバイアルを要求します。不活化ウイルスを使用する場合、調製物は、不活性化処理はNA活性に有意な影響を及ぼさなかったことを実証を通じてELLAでの使用に適していることを確認します。 -80℃できちんとした尿膜液0.5mlのアリコートを発育鶏卵で培養H6Nxウイルスのストックを11と格納します。 各アッセイのために、ウイルスの新しいアリコートを使用してください。アリコートを凍結し、解凍しないでください。 血清サンプルおよびコントロール 45-60分間56℃の水浴中で、全ての血清（試験サンプル例えば 、前およびワクチン接種後の血清、並びに対照、 例えば 、既知のNI力価を有するサンプル）を熱不活性化します。前または熱処理後の-20〜-70℃で血清を保管してください。 SAMP場合レは、サンプルを繰り返し凍結及び解凍されないように、凍結前に、いくつかのアリコートを行い、繰り返し試験します。 （> 5ミリリットル）低力価および高力価と相互に少なくとも一つを識別するために、合理的な量で利用可能なヒト血清中のNI力価を測定するために、ELLAを使用してください。店舗≤-20°Cとして100μlのアリコートを、同じサンプルは、アッセイ性能を追跡するために多くのアッセイにおける対照として使用することができるようになっています。 ピーナッツ凝集素（PNA） – 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRPO） PNA-HRPO希釈液（MES、 塩化カルシウムでpH 6.5および1％BSA）を準備します。 希釈液1mlにPNA-HRPO 1mgを溶解させることによって、PNA-HRPO原液を準備します。 -20℃で20から200μlのアリコートを保管してください。 新しいPNA-HRPOロットを使用する前に、テスト1：500、1：750、1：1000〜1：ポジティブコントロール（ウイルスのみ）で、最大ODをもたらす量と背景を識別するために、この試薬の2000希釈液（ウイルス）トンノー帽子は<正の信号の10％です。 2.1節で説明したように四重のウイルス希釈液を作ります。 2.2節で説明したように、フェチュインでコーティングされたプレートに希釈液を移し、37℃でプレートをインキュベートします。 16-18時間後、プレートを洗浄し、1追加：プレートの行を複製するPNA-HRPOの2,000希釈液（100μl/ウェル）：500、1：750、1：1000〜1。 2.3.9へのステップ2.3.4で説明したようにアッセイを完了します。 > 10倍のバックグラウンドである最大信号が得られた希釈を選択するために、データを確認します。 使用直前に、1.5.3で同定されたPNA-HRPOの最適希釈を準備します。 洗浄緩衝液（0.01 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH7.4の0.05％ツイーン20（PBS-T））を大量に調製します。室温で保管してください。 ペルオキシダーゼ基質（o-フェニレンジアミン二塩酸塩（OPD））を準備します。注：このような3,3のような代替ペルオキシダーゼ基質」、5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）を使用することができますアッセイの日に100ミリリットルのdH 2 Oに1カプセルを溶解させることにより、リン酸-クエン酸緩衝液を準備します。 使用直前にリン酸 – クエン酸緩衝液20mlに1 OPD錠（10 mg）を溶解させます。 停止液（1 NH 2 SO 4）を準備：SO 4 973ミリリットルのdH 2 Oに27.2ミリリットルの株式98％のH 2を追加します。混合し、次いで、室温で保管してください。 ELLAで使用するためのNAの量の2決意 96ウェルプレートにウイルス希釈液を調製列希釈プレートの1-11に120μlのサンプル希釈剤（セクション1.2）を分注します。 カラム1に、追加の96μlのサンプル希釈剤を追加します。 解凍した後、これがウイルスの1:10希釈を与える列1のウェルを複製するために24μLを追加する前に、ウイルスのバイアルをボルテックス。 転送することにより、検体希釈液中のウイルスの連続2倍希釈液を作ります各希釈のためのクリーンなピペットチップを使用して、次の1つのウェルから120μlを。 フェチュインでコーティングされたプレートへのウイルスの希釈を転送 PBS-T（1.6節）で、フェチュインでコーティングされたプレートを3回洗浄した後、余分な洗浄バッファーを除去するために、吸水性ペーパータオルの上に各プレートをブロット。 フェチュインでコーティングされたプレートの11列1に各ウェルに検体希釈液（セクション1.2.1）の50μLを加えます。 （これらのウェルは、陰性対照である）カラム12にサンプル希釈液の100μlのを追加します。 転送列フェチュインでコーティングされたプレートの対応するウェルに希釈プレートの1月11日から希釈したウイルス50μlの。 プレートシーラーでプレートをカバーし、その後、37℃の加湿インキュベーターに入れてください。 残りのステップは、（16-18時間後）を行うことする時間をメモします。 NAの決意を完了インキュベーション（16〜18時間）完了すると、転送ベンチにプレートとプレートシーラーを削除します。 PBS-T（1.7節）でプレートを6回洗浄した後、全ての液体がウェルから除去されていることを確認するために反転させ、吸収紙タオル上でバッチリ。 すべてのウェルに（1.5.3で決定希釈で）100μl/ウェルPNA-HRPO溶液を添加し、室温で2時間静置します。 インキュベーションが終了している15分未満前にセクション1.7で説明したように、OPD溶液を調製。 PNA-HRPOを除去し、各ウェルにOPD基質100μlを添加する前に乾燥しみするために、テストプレートを3回洗浄します。 室温で正確に10分間プレートをインキュベートします。 1N硫酸100μl/ウェルを加えて反応を停止します。 0.1秒間490nmでの光学密度（OD）を測定するために、プレートリーダーを使用してください。 保存して、すべてのデータファイルをエクスポートします。 血清学のために使用されるウイルスの希釈を選択 ODの490nmのをプロットしたグラフを描きます</sUB>各ウイルス希釈液での値。 、（これは通常、滴定曲線の先頭でプラトーに対応した信号である）、最小信号（バックグラウンドコントロールを提供するプレートのカラム12にはウイルスが含まれていない井戸）最大信号を識別するために滴定曲線を点検入力希釈（曲線すなわち、線形領域）に比例したODをもたらすウイルスの希釈。 最大信号の約90％を与え、直線範囲内にあるウイルスの希釈を選択します。選択された希釈でのODはバックグラウンドシグナルよりも少なくとも10倍大きいことを確認してください。この特定のウイルスストックを採用し、すべてのアッセイのために選択されたウイルス希釈液を使用してください。 注：別の方法として、ウイルスのNA活性を測定し、ELLAに〜15-20μUNA活動/ミリリットルを使用しています。 3.酵素結合レクチンアッセイ注： 図2笙希釈およびアッセイプレートのセットアップをWS。 サンプル希釈液を作ります氷の上で熱不活性化サンプルを置きます。 注：8の血清を各プレートに希釈することができます。 プレート全体の1：10から始まる希釈液を使用して設定するために、列3-11内のすべてのウェルに120μlのサンプル希釈剤を追加します。 コラム2に、検体希釈液の216μlの各サンプルの24μlを添加します。 3回上下にピペッティングすることで十分でサンプルを混合した後、次の列に120μLを移します。 ピペットチップを変更した後、上下にピペッティングによりウェルの内容物を混合した後、次の列に120μLを移します。 サンプルまでの手順を繰り返し3.1.4カラム11に転送されており、残りの120μlを破棄します。 フェチュインでコーティングされたプレートにサンプルおよびウイルスを追加ウイルス、渦のバイアルを解凍し、ステップ2で選択された希釈率で希釈剤（セクション1.2）でウイルスを懸濁します。4.2。各アッセイプレートのためのウイルスの少なくとも5ミリリットルを準備します。プレートを洗浄し、血清サンプルをプレートに添加されるまで、氷上で希釈したウイルスを保管してください。 （一般的にプレート当たり4血清を適用）アッセイのために必要とされ、フェチュインでコーティングされたプレートの数を決定します。 PBS-Tでフェチュインでコーティングされたプレートを3回洗浄した後、各プレートを反転し、余分な洗浄バッファーを除去するために、吸水性ペーパータオルの上にブロット。 列2-11の重複ウェルに希釈プレートから各血清対照または試料希釈液50μlを転送するためにマルチチャンネルピペットを使用してください。 陰性対照（カラム12）を除く全てのウェルに希釈したウイルスの50μLを加えます。 カラム1のウェルに検体希釈液の50μlのを追加し、カラム12にサンプル希釈液の100μlを添加します。 プレートシーラーでウェルを覆い、その後静かにプレートの側面をタップするか、10秒間中程度の速度でプレートシェーカー上に置くことによって混合します。 humidifにプレートを置き16-18時間、37℃でIEDインキュベーター。 PNA-HRPOを追加し、2.3節で説明したようにアッセイを完了 4.データ解析アッセイ結果の妥当性を判断バックグラウンド値（ウイルスなし）は、ポジティブコントロール（ウイルスおよび血清なし）の10％未満であることを確認します。 同じ条件を用いて、異なるアッセイにおける対照血清ランの力価は中央値力価の2倍以内であることを確認します。 対照ウェルのOD測定値は（≤20％異なる）一貫性があり、重複したサンプルウェルのOD測定値は（≤10％異なる）一致していることを確認します。 無効な結果の根本原因を特定し、4.1.1、4.1.2または4.1.3に記載されている基準は、満たされていない場合、アッセイを繰り返します。トラブルシューティングをしようとすると、表1に示す要因を考慮してください。 50％エンドポイント力価を割り当て各アッセイプレート、suコマンドのためのすべての測定値から平均バックグラウンド（ウェルに添加していない抗原）btract。 式を用いて、各血清希釈におけるパーセント阻害を計算する：100×（OD ウイルスのみ制御 – OD テストサンプル ）/ OD ウイルスのみを制御 。 最大信号の少なくとも50％の阻害をもたらした最高希釈を識別します。 50％終点力価として、この希釈の逆数を報告します。 注意：50％の阻害が任意の希釈で達成されなかった場合は、力価は、最初にテストした希釈よりも小さい例えば 、<10 1:10最初にテストした希釈があります。 50％阻害濃度を計算する（IC 50） 次のようにIC 50力価を決定するために、4パラメータロジスティック回帰を使用してください：すべての測定値から平均バックグラウンドを減算した後、回帰分析を行うプログラムに結果を転送します。 最大設定で、非線形回帰を使用してくださいウイルスのみの対照と最小値は、正確に50％阻害に対応する希釈を決定するために、ゼロに設定。 IC 50力価として、この希釈の逆数を報告します。