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Immunology and Infection

Messung von Influenza-Neuraminidase Inhibition Antikörpertiter durch Enzyme-Linked-Lectin-Assay

Published: September 06, 2016
doi:
10.3791/54573
, ,
1Division of Viral Products, CBER,Food and Drug Administration

Summary

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Abstract

Antikörper gegen Neuraminidase (NA), das zweithäufigste Oberflächenprotein auf Influenza-Virus, tragen zu Schutz gegen Influenza. Traditionelle Methoden zur Messung der NA Hemmung (NI) Antikörpertiter sind nicht praktikabel für Routine-Serologie. Dieses Protokoll beschreibt die enzyme-linked Lektin-Assay (ELLA), eine praktische Alternative Verfahren NI Titer zu messen, die in 96-Well-Platten, beschichtet mit einem großen Glykoprotein Substrat, Fetuin durchgeführt wird. NA spaltet terminale Sialinsäuren von Fetuin, die vorletzte Zucker aussetzt, Galaktose. Erdnuß-Agglutinin (PNA) ein Lectin mit Spezifität für Galactose und daher das Ausmaß der Desialylierung kann unter Verwendung eines PNA-Meerrettich-Peroxidase-Konjugats quantifiziert werden, gefolgt von der Zugabe eines chromogenen Peroxidase-Substrat. Die optische Dichte, die gemessen wird, ist für NA-Aktivität proportional. NI-Antikörpertiter, serielle Verdünnungen von Seren werden bei 37 ° CO / N auf Fetuin-beschichteten Platten mit einer festen Menge zu messen inkubiert of NA. Der Kehrwert der höchsten Serumverdünnung, die in ≥50% ige Hemmung der NA-Aktivität resultiert, wird als NI Antikörpertiter bezeichnet. Der ELLA bietet ein praktisches Format für die Routine Bewertung von Humanantikörperreaktionen folgende Influenza-Infektion oder Impfung.

Introduction

Neuraminidase (NA) ist ein Glykoprotein auf der Oberfläche des Influenza-Virionen exprimiert. Die Enzymaktivität ist für die Freisetzung von neu gebildeten Viruspartikeln aus infizierten Zellen 1,2. Antikörper , die 4 beim Menschen NA – Aktivität reduzieren Virustiter und Krankheitssymptome in Tiermodellen 3 und korrelieren mit einer Resistenz gegen die Krankheit zu hemmen. Eine Erhöhung der NA-Hemmung (NI) Titer nach der Impfung kann daher ein Indikator für die Wirksamkeit des Impfstoffs dienen, aber viele Vergangenheit Influenza Immunogenität Studien umfassen nicht diese End-Punkt, weil der traditionelle Test NI-Antikörper-Titer zu messen, ist unpraktisch für Routine-Serologie.

Die traditionelle Methode NI – Titer zu messen basiert auf der Menge an Sialinsäure , die Quantifizierung von Glycokonjugaten von NA 1 gespalten wird. Diese Methode, die oft als die Thiobarbitursäure (TBA) -Verfahren verwendet gefährliche Chemikalien sialic ac konvertiertid auf einen Chromophor, der durch Spektrometrie quantifiziert werden kann. Der Test ist nicht geeignet zum Testen einer großen Anzahl von Proben, weil einzelne Glasrohre verwendet werden, so dass der Assay umständlich. Miniaturisierung des Assays auf eine 96 – Well – Platten liefert ein praktisches Format 5, jedoch dieser Test erfordert immer noch die Verwendung von toxischen Chemikalien und ist daher nicht ideal.

Ein alternativer Assay NI Antikörpertiter gemessen wurde durch Lambre entwickelt et al. 6. Dieser Assay quantifiziert die Enzymaktivität durch die Menge des vorletzten Zucker von Glykoproteinen Messen galactose, die freigelegt wird, wenn Sialinsäure durch NA freigesetzt wird. Da Erdnuß-Agglutinin (PNA) spezifisch an Galactose bindet, ein PNA-Meerrettich-Peroxidase (HRPO) -Konjugat kann eine kolorimetrische Auslesens zu erhalten verwendet werden. Die optische Dichte, die gemessen wird, ist daher proportional zu der NA-Aktivität in der Probe. NI Titer werden durch Bestimmen der höchsten Verdünnung gemessendes Serums, die mindestens 50% der NA-Aktivität hemmt. Dieses Enzym-Linked-Lektin-Assay (ELLA) wird in 96-Well-Platten mit Fetuin, einem stark glykosyliert Serumprotein als Substrat für NA beschichtet durchgeführt.

Eine wichtige Überlegung für Assays, die NI-Titer zu messen, ist die Quelle der NA. Dies liegt daran, Seren von geimpften oder infizierten Individuen Antikörper gegen Hämagglutinin (HA) sowie Antikörper gegen NA enthalten. Antikörper, die an HA binden können mit NA-Aktivität stören und daher unspezifische Hemmung durch HA-spezifische Antikörper zu vermeiden, gereinigt NA oder ganzen Virus ein antigen-mismatched HA enthalten, sollten in dem Assay verwendet werden. Diese Viren können durch klassische Reassortierung oder durch reverse Genetik erzeugt werden; das Ziel ist, einen Virus zu befreien, die HA eines Subtyps enthält, die nicht an die Zielstamm verbunden ist und NA des Virus, das untersucht wird. Der Test in diesem Artikel beschrieben verwendet Influenza-A-Viren, die von rev erzeugt werdenERSE Genetik HA des Subtyps H6 und die gezielte NA von Influenza – A – Viren, Subtypen H1N1 und H3N2 5 enthalten.

Ergebnisse von ELLA und miniaturisierte TBA – Assays erzeugt zeigen diese Methoden vergleichbar sind, mit ähnlichen Subtyp Spezifität und Sensitivität 7. ELLA erfordert nicht die Verwendung von gefährlichen Chemikalien und daher ist die bevorzugte Methode NI-Titer zu messen. Es ist einfach durchzuführen, mit nur wenigen Schritten (Abbildung 1): Proben werden verdünnt und auf eine Fetuin-beschichtete Platte übertragen , auf dem Virus (die Quelle von NA) zugegeben. Die Platte wird O / N inkubiert und gewaschen, bevor sie PNA-HRPO Zugabe. Nach einer 2-stündigen Inkubation wird die Platte gewaschen und Peroxidase-Substrat zugegeben; die Farbreaktion gestoppt wird und schließlich die optische Dichte wird gemessen, und der Kehrwert der Probenverdünnung, die mindestens 50% ige Hemmung der NA-Aktivität ergab als 50% Endpunkttiter angegeben. Eine laborinterne Studie zur Beurteilung reproducibiliWiederholbarkeit führte minimal und Operator-to-Operator in nicht mehr als das 2-fache Unterschiede im Titer 7 ty des ELLA zeigte, dass die Platte zu Platte Variabilität ist. Eine nachfolgende Interlabor – Studie von ELLA Variabilität zeigte , dass der Test eine gute Reproduzierbarkeit aufweist , wenn 8 in verschiedenen Labors und dass die Aufnahme eines Standard weiter reduzieren Schwankungen bei den Ergebnissen durchgeführt. Der ELLA eignet sich zur Messung von NI – Antikörper – Titer im Serum Platten aus präklinischen und klinischen Influenza – Impfstoff – Studien 7 und auch antigene Unterschiede verwendet werden können , 9 zwischen dem NAs von Influenza – Viren zu untersuchen.

Protocol

Alle Live-Reassortante Viren mit aviären Komponenten müssen für die Nutzung durch die United States Department of Agriculture (USDA) und der institutionellen Biosicherheit Ausschuss genehmigt mit Biosicherheitsstufe 2 (BSL2) -unterstützten Praktiken in einem Labor behandelt werden. 1. Vorbereitung der Reagenzien und Ausgangsmaterial Hinweis: Lesen Sie die Werkstoff – Tabelle ist die Quelle aller Reagenzien zu erhalten. Fetuin-beschichteten Platten Beschichtungspuffer vor , indem 10 ml 10x Beschichtungspuffer mit 90 ml Mischen deionisiertes H 2 O Bereiten Sie eine Stammlösung von Fetuin bei 25 mg / ml in 1x Beschichtungspuffer und Speicher in 500 ul Aliquots bei -20 ° C. Bereiten Sie eine Arbeitslösung von Fetuin (25 ug / ml) unmittelbar vor der Beschichtung Platten durch die Stammlösung verdünnt 1000-fach in 1x Beschichtungspuffer. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette 100 ul der Arbeitslösung von Fetuin in al verzichtetl Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen, die eine hohe Proteinbindungskapazität hat. Cover jede Platte mit Abklebefolie dann stapeln Sie die Platten in Gruppen von 10 und wickeln Sie sie in Folie. Legen Sie die Platten in einem Kühlschrank (2-8 ° C) für mindestens 18 Stunden vor der Durchführung eines Assays. Anmerkung: Die Platten im voraus beschichtet sein kann und mit der Beschichtungslösung bei 2-8 ° C gelagert, für bis zu 2 Monate. Verdünnungsmittel Zur Herstellung des Verdünnungsmittel – Virus und Probenverdünnungen (2- (N – Morpholino) ethansulfonsäure (MES), pH 6,5, 20 mM CaCl 2, 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,5% Tween 20), mischen 94,2 ml machen 1X MES, pH 6,5 mit 2 ml CaCl 2 (10 mg / ml), 3,3 ml 30% BSA und 0,5 ml Tween 20. Um das Verdünnungsmittel für PNA-HRPO (MES, pH 6,5 mit 20 mM CaCl 2 und 1% BSA) herzustellen, Mischungs 94,7 ml 1x MES, pH 6,5 mit 2 ml CaCl 2 (10 mg / ml) und 3,3 ml 30% BSA . Neuraminidase (NA) Hinweis: H6Nx Virus REASSortants (diese haben HA von H6 – Subtyp und die NA von Interesse) werden 5,10 folgenden veröffentlichten Methoden erzeugt. Fordern Fläschchen von inaktivierten reassortant Virus von einem Mitarbeiter, wenn sie im Haus nicht zur Verfügung stehen. Wenn inaktivierten Virus verwenden, bestätigen, dass die Vorbereitung für den Einsatz in der ELLA durch Demonstration geeignet ist, dass die Inaktivierungsprozess keinen wesentlichen Einfluss auf NA-Aktivität hatte. Kultur einen Bestand von H6Nx Virus in befruchteten Hühnereiern 11 und speichern 0,5 – ml – Aliquoten ordentlich Allantoisflüssigkeit bei -80 ° C. Verwenden Sie für jeden Test ein neues Aliquot des Virus. Sie nicht die Aliquots einfrieren und auftauen. Serum-Proben und Kontrollen Wärme inaktivieren alle Seren (Testproben beispielsweise vor und nach der Impfung Seren sowie Steuerelemente, beispielsweise Probe mit bekanntem Titer NI) in einem Wasserbad bei 56 ° C für 45-60 min. Lagern Sie die Seren bei -20 bis -70 ° C vor oder nach der Wärmebehandlung. Wenn die samples sind immer wieder überprüft werden, mehrere Teilmengen, bevor so Einfrieren, dass die Probe nicht wiederholt eingefroren und wieder aufgetaut. Verwenden Sie die ELLA die NI-Titer von humanen Seren zu messen, die in angemessener Menge zur Verfügung stehen (> 5 ml) mindestens einen mit niedrigem Titer und eine andere mit einem hohen Titer zu identifizieren. Speichern von 100 & mgr; l Aliquots als ≤-20 ° C, so dass die gleiche Probe kann als eine Kontrolle in vielen Assays verwendet werden, um die Testleistung zu verfolgen. Peanut Agglutinin (PNA) -Horseradish Peroxidase (HRPO) Bereiten Sie die PNA-HRPO Verdünnungsmittel (MES, pH 6,5 mit CaCl 2 und 1% BSA). Vorbereiten eines PNA-HRPO-Stammlösung durch Auflösen von 1 mg PNA-HRPO in 1 ml Verdünnungsmittel. Speichern von 20-200 & mgr; l Aliquots bei -20 ° C. Bevor Sie eine neue PNA-HRPO viel verwenden, Test 1: 500, 1: 750, 1: 1000 und 1: 2000 Verdünnungen dieses Reagenz die Menge zu identifizieren, die mit der positiven Kontrolle (Virus nur) und einen Hintergrund in der maximalen OD-Ergebnisse ( kein Virus) tHut <10% des positiven Signals. Machen Sie quadruplicate Virus Verdünnungen, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben. Übertragen Sie die Verdünnungen zu einer Fetuin-beschichteten Platte wie in Abschnitt 2.2 beschrieben und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C. Waschen Sie die Platte 16-18 Stunden später und fügen Sie 1: 500, 1: 750, 1: 1000 und 1: 2000 Verdünnungen von PNA-HRPO (100 ul / Vertiefung) Reihen der Platte zu duplizieren. Füllen Sie den Test wie in den Schritten 2.3.4 bis 2.3.9 beschrieben. Überprüfen Sie die Daten, um die Verdünnung zu wählen, die ein maximales Signal geführt, die> 10-fache der Hintergrund. Unmittelbar vor dem Gebrauch bereiten die optimale Verdünnung von PNA-HRPO in 1.5.3 identifiziert. Bereiten ein großes Volumen an Waschpuffer (0,01 M Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,4, 0,05% Tween 20 (PBS-T)). Lagern Sie bei RT. Bereiten Sie das Peroxidase-Substrat (o-Phenylendiamin (OPD)): Hinweis: alternative Peroxidasesubstrate wie 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB), kann verwendet werden, Bereiten Phosphat-Citrat – Puffer durch Lösen von 1 Kapsel in 100 ml dH 2 O am Tag des Assays. Man löst 1 OPD-Tablette (10 mg) in 20 ml Phosphat-Citrat-Puffer unmittelbar vor der Verwendung. Bereiten Sie die Stop – Lösung (1 NH 2 SO 4): in 27,2 ml Lager 98% H 2 SO 4 bis 973 ml dH 2 O. Mischen Sie und speichern Sie dann bei RT. 2. Bestimmung der Menge von NA in ELLA verwenden Bereiten Virus Verdünnungen in einer 96-Well-Platte Dispense 120 ul Probenverdünnungsmittel (Abschnitt 1.2) in Spalten 1-11 der Verdünnungsplatte. Um Spalte 1, fügen Sie eine zusätzliche 96 ul Probenverdünnungsmittel. duplizieren Brunnen in der Spalte 1 Daraus ergibt sich eine Verdünnung von 1:10 von Virus auftauen und dann die Flasche mit der Virus verwirbeln, bevor 24 & mgr; l hinzugefügt wird. Eine serielle 2-fache Verdünnungen von Virus in Probenverdünnungsmittel, durch die Übertragung von120 & mgr; l von einem gut auf die nächste mit sauberen Pipettenspitzen für jede Verdünnung. Übertragen Virus Verdünnungen zu einer Fetuin-beschichteten Platte Waschen Sie die Fetuin-beschichteten Platte 3-mal mit PBS-T (Abschnitt 1.6) und dann auslöschen jede Platte auf saugfähigem Papiertuch überschüssige Waschpuffer zu entfernen. In 50 ul Probenverdünnungsmittel (siehe Abschnitt 1.2.1) in jede Vertiefung in den Spalten 1 bis 11 der Fetuin-beschichteten Platte. 100 l Probenverdünner bis Spalte 12 (diese Brunnen sind die Negativkontrolle). Transfer 50 ul verdünntes Virus von Spalten 1-11 von der Verdünnungsplatte auf die entsprechenden Vertiefungen der Fetuin-beschichteten Platte. Die Platte mit Abklebefolie und dann legen Sie sie in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C. Notieren Sie sich die Zeit, zu der verbleibenden Schritte durchgeführt werden (16-18 h später). Füllen Sie das NA Bestimmung Wenn die Inkubation abgeschlossen ist (16-18 h), übertragen dieauf die Bank Platte und der Plattenabdeckung entfernen. Waschen Sie die Platte 6-mal mit PBS-T (Abschnitt 1.7) und dann umkehren und Klaps auf saugfähige Papiertücher alle Flüssigkeit, um sicherzustellen, wurde aus den Vertiefungen entfernt wurde. 100 l / Well PNA-HRPO-Lösung (bei der bestimmten Verdünnung in 1.5.3) in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte für 2 Stunden bei RT. Weniger als 15 Minuten, bevor die Inkubation zu Ende ist, die OPD-Lösung herzustellen, wie in Abschnitt 1.7 beschrieben. Waschen Sie die Testplatten 3 mal die PNA-HRPO zu entfernen und trocken tupfen, bevor 100 ul des OPD-Substrat in jede Vertiefung hinzufügen. Inkubieren der Platte für genau 10 min bei RT. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 100 ul / Vertiefung von 1 N Schwefelsäure. Verwenden Leser eine Platte die optische Dichte (OD) für 0,1 Sekunden bei 490 nm zu messen. Speichern und exportieren Sie alle Datendateien. Wählen Sie die Virusverdünnung, die für die Serologie verwendet werden soll Zeichnen Sie ein Diagramm , das OD 490nm Plots </sub> Werte bei jeder Virusverdünnung. Überprüfen Sie die Titrationskurve das maximale Signal zu identifizieren (dies ist in der Regel das Signal, das am Anfang der Titrationskurve auf einem Plateau entspricht), das minimale Signal (Wells, die kein Virus in Spalte 12 der Platte liefern enthalten die Hintergrundsteuerung), und die Verdünnungen des Virus , das in OD führen , die mit der Eingangsverdünnungs proportional ist (dh linearen Bereich der Kurve). Wählen Sie die Virusverdünnung, die etwa 90% des maximalen Signals gibt und im linearen Bereich. Bestätigen Sie, dass die OD bei der gewählten Verdünnung mindestens 10-fach größer als das Hintergrundsignal. Verwenden Sie den ausgewählten Virusverdünnung für alle Tests, die dieses bestimmten Virus Lager beschäftigen. Hinweis: Alternativ messen die NA Aktivität des Virus und benutzen ~ 15-20 & mgr; U NA-Aktivität / ml im ELLA. 3. Enzyme-Linked-Lectin-Assay Hinweis: Abbildung 2 shows das Setup der Verdünnung und Assayplatten. Machen Probenverdünnungen Legen Sie die Hitze inaktivierten Proben auf Eis. Hinweis: 8 Seren in jeder Platte verdünnt werden kann. Für eine über die Platte, um 1:10 mit Verdünnungen einrichten beginnen, fügen Sie 3-11 120 ul Probenverdünnungsmittel in den Spalten in alle Vertiefungen. Spalte 2, fügen Sie 216 ul Probenverdünnungsmittel und 24 & mgr; l jeder Probe. Die Probe wird in das Bohrloch durch Auf- und Abpipettieren 3-mal und dann übertragen 120 & mgr; l in die nächste Spalte. Pipettenspitzen Nach dem Wechsel durch Pipettieren auf den Inhalt des gut mischen und nach unten und dann 120 & mgr; l in die nächste Spalte übertragen. Wiederholen Sie Schritt 3.1.4 bis die Probe wurde auf Säule 11 übertragen, und die verbleibenden 120 ul verworfen. In Proben und Viren auf die Fetuin-beschichteten Platte ein Fläschchen mit Virus, Wirbel auftauen und das Virus in dem Verdünnungsmittel (Abschnitt 1.2) bei der Verdünnung suspendieren, die in Schritt 2 ausgewählt wurde.4.2. Bereiten Sie mindestens 5 ml Virus für jede Testplatte. Halten der verdünnten Virus auf Eis, bis die Platten gewaschen werden, und Serumproben wurden zu der Platte gegeben. Entscheiden Sie sich für die Anzahl der Fetuin-beschichteten Platten, die für den Test benötigt werden (gilt im Allgemeinen 4 Seren pro Platte). Waschen Sie die Fetuin-beschichteten Platte 3-mal mit PBS-T und dann jede Platte umdrehen und tupfen auf saugfähigem Papier Tuch, um überschüssige Waschpuffer zu entfernen. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette 50 ul jeder Serumkontrolle oder Probenverdünnung von der Verdünnungsplatte in zwei Vertiefungen in Spalten zu übertragen 11.02. Zugabe von 50 & mgr; l verdünntes Virus zu allen Vertiefungen mit Ausnahme der negativen Kontrolle (Spalte 12). In 50 ul Probenverdünnungsmittel in die Vertiefungen in Spalte 1 und fügen 100 ul Probenverdünnungsmittel zur Säule 12. Die Vertiefungen mit Abklebefolie und dann mischen durch vorsichtiges Seiten der Platte oder Platzierung auf einem Plattenschüttler bei mäßiger Geschwindigkeit für 10 Sekunden tippen. Die Platte wird in einem Befied Inkubator bei 37 ° C für 16-18 Std. In PNA-HRPO und füllen Sie den Test, wie in Abschnitt 2.3 4. Datenanalyse Bestimmen Sie die Gültigkeit der Untersuchungsergebnisse Bestätigen Sie, dass die Hintergrundwerte (kein Virus) sind weniger als 10% der positiven Kontrolle (Virus und kein Serum). Bestätigen Sie, dass die Titer von Kontrollseren laufen in verschiedenen Tests die gleichen Bedingungen innerhalb von 2-fache des mittleren Titer verwendet wird. Bestätigen Sie, dass die OD-Messungen von Kontrollvertiefungen konsistent sind (≤20% unterschiedlich), und dass OD Messungen der doppelten Probenschächten sind konsistent (≤10% unterschiedlich). Ermitteln Sie die Ursache für ungültige Ergebnisse und den Test wiederholen, wenn die genannten Kriterien in 4.1.1, 4.1.2 oder 4.1.3, nicht erfüllt werden. Betrachten Sie die vorgestellten Faktoren in Tabelle 1 , wenn zu beheben versuchen. Vergeben Sie einen 50% Endpunkttiter Für jede Testplatte, subtract die durchschnittliche Hintergrund (kein Antigen zu Vertiefungen gegeben) aus allen Lesungen. Berechnen Sie die prozentuale Hemmung bei jeder Serumverdünnung unter Verwendung der Formel: 100 x (OD – Virus nur die Kontrolle – OD Testprobe) / OD – Virus nur die Kontrolle. Identifizieren der höchsten Verdünnung, die in mindestens 50% ige Hemmung des maximalen Signals geführt. Bericht des reziproken dieser Verdünnung als 50% Endpunkttiter. Hinweis: Wenn 50% ige Hemmung zu keiner Verdünnung erreicht wurde, der Titer geringer als die erste Verdünnung getestet, beispielsweise <10 , wenn die erste 01.10 Verdünnung getestet. Berechnen Sie die 50% ige Hemmkonzentration (IC 50) Verwenden Sie vier Parameter logistische Regressionen der IC – 50 – Titer zu bestimmen , wie folgt: subtrahieren den Mittelwert Hintergrund von allen Lesungen und übertragen dann die Ergebnisse zu einem Programm , das Regressionsanalyse durchführt. Verwenden Sie nicht-lineare Regression, wobei der maximale Satznur, um das Virus zu steuern und das Minimum auf Null gesetzt, die Verdünnung zu bestimmen, die mit genau 50% ige Hemmung entspricht. Bericht des reziproken dieser Verdünnung als der IC 50 Titer.

Representative Results

Der Test in diesem Manuskript dargestellt ist schematisch in Figur 1 gezeigt. Abbildung 2 Die Platte mit 96 Vertiefungen Layout zeigt, und zeigt an, daß Reihenverdünnungen der Serumproben in einer Verdünnung Platte vorbereitet werden , bevor sie an die Fetuin-beschichtete Platte übertragen. Ein kritischer Parameter des Assays ist die Menge an Neuraminidase, die in dem Assay verwendet wird; dies wird durch Titration des reassortant Virus bestimmt. Beispiele für H6N1 und H6N2 – Virus – Titrationen sind in Abbildung 3 dargestellt. 1:10, 1:20 bis 01.40 Verdünnungen von H6N1, die optische Dichte war ähnlich, was darauf hinweist , dass die Bedingungen waren so , dass eine maximale Lese erhalten wurde. Bei einer 1:80 Verdünnung der ausgelesene betrug etwa 90% der maximalen und somit diese Verdünnung des Virus wurde in den folgenden Tests verwendet. Beispiele für Serum – Titrationen sind in Abbildung 4 dargestellt. Die Figur zeigt eine Humanserumprobe , das war tilichten gegen H6N1 und H6N2-Viren. Jeder Datenpunkt zeigt die prozentuale Hemmung der NA-Aktivität, die durch serielle Verdünnungen von Serum erreicht wurde; die erste Serumverdünnung in dem H6N1 Assay betrug 1:80; die erste Verdünnung des Serums in dem H6N2-Assay betrug 5. Da die höchste Verdünnung, die die NI-Antikörpertiter in ≥50% Inhibition ergibt, ist, der Titer des Serums in diesem Beispiel gezeigt ist 640 gegen die NA von NC / 99 (N1) und 160 gegen die NA von WI / 05 (N2). . Figur 1 Ein Schema des ELLA – Protokolls (A) Bestimmung der Verdünnung von Antigen (Virus) in dem Assay (Schritt 2 des Protokolls) zu verwenden: Virus – Verdünnungen werden zu einer Fetuin – beschichteten Platte und der NA – Aktivität gemessen durch Quantifizierung Terminal Galaktosereste durch Bindung von PNA-HRPO, wie in Schritt 2.3 des Protokolls beschrieben; (B </stron g>) Bestimmung der Serum-Antikörpertiter NI (Schritt 3 des Protokolls). Proben werden verdünnt und dann auf eine Fetuin-beschichtete Platte übertragen, wo Virus hinzugefügt wird. Die Platte wird inkubiert O / N vor der Zugabe von PNA-HRPO und Abschluss der Schritte erforderlich, um eine Farbreaktion zu erzeugen. Schließlich wird die Farbreaktion gestoppt und die optische Dichte gemessen wird. Der Kehrwert der Probenverdünnung, die als mindestens 50% ige Hemmung der NA – Aktivität führt zu 50% Endpunkttiter gemeldet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2. Diagramm zeigen die ELLA Platte einzurichten. Serielle Verdünnungen von Serumproben werden in einem Verdünnungsplatte hergestellt und dann zu einer Fetuin-beschichteten Platte übertragen. 3fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3. Beispiele für H6N1 und H6N2 – Virus – Titrationen. Serielle Verdünnungen von H6N1 BR / 07 (NA von A / Brisbane / 59/2007 (H1N1) in blauen Symbole dargestellt) und H6N2 UR / 07 (NA von A / Uruguay / 716 / 2007 (H3N2) in roten Symbolen dargestellt) wie beschrieben, wurden für 18 Stunden in bestimmt Fetuin-beschichteten Platten und der Reaktivität mit PNA-HRPO inkubiert. Durchschnittlich OD 490 nm von 2 Vertiefungen gegen den Kehrwert der Virusverdünnung aufgetragen. Die Verdünnung des H6N1 zur Verwendung im ELLA ausgewählt war 1:80 und die Verdünnung des H6N2 ausgewählt war 01.40 weil diese Verdünnungen in etwa 90% der maximalen optischen Dichte geführt und waren innerhalb des linearen Bereichs.3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 4. Titration von Serum gegen NA von N1 (rote Symbole) und N2 (blaue Symbole) Subtypen. NA Hemmung Titer wurden gemessen gegen Reassortante Viren H6N1 NC / 99 (enthält die NA von A / Neukaledonien / 20/1999 (H1N1) ) und H6N2 WI / 05 (enthält die NA von A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2)). Percent Enzymhemmung für serielle Verdünnungen von Serum wird mit der gestrichelte horizontale Linie, die 50% ige Hemmung gezeigt. Die NA Hemmung Titer gegen die NAs von A / New Caledonia / 20/1999 (H1N1) (NC / 99) und A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2) (WI / 05) waren 2 9.3 (640) und 2 7.3 ( 160) verbunden sind. Bitte klicken Sie hier um eine größere zu sehen version dieser Figur. Problem Mögliche Ursachen) Lösung Schwaches Signal oder kein Plateau in Virus-Titration erreicht i) niedrige NA Enzymaktivität ii) Virus Lager nicht unter optimalen Bedingungen gelagert i) bestätigen, dass das Verdünnungsmittel pH-Wert hat, der für die NA-Aktivität optimal ist; wenn pH-Wert optimal ist, bereiten Sie einen neuen Virusstamm oder Virus konzentrieren ii) nachwachsen und aliquoten Lager; Snap-freeze Fläschchen auf Trockeneis vor bei -80 ° C Lagerung Schwache oder keine Farbe in positiven Zellkontrollvertiefungen i) Virusverdünnung falsch zugeordnet ii) Vial-to-Fläschchen Variabilität in gefrorenen Virus Aliquots iii) PNA- HRPO denaturiert oder zu viel verdünnt iv) OPD falsch vorbereitet ich); Wiederholen Sie Virus-Titration ii) Titrieren mehrere Fläschchen aus der gleichen Charge, um sicherzustellen, gibt es keine Variabilität. Wenn erhebliche Variabilität, bereiten frische Aliquote iii) Verwenden Verdünnung optimale Virus PNA- HRPO zu retitrate iv) Wiederholen Sie mit frischen Zubereitung von OPD Schwache oder keine Hemmung durch positive Kontrollseren i) Zu viel Virus in Assay verwendet ii) Serum verschlechtert i) Wiederholen Virustitration ii) Erhalten Sie neue Antiseren überprüfen Lagerbedingungen Die Hemmung durch negative Kontrollseren i) Eine unzureichende Wärmebehandlung von Serum ii) Zu wenig Virus in Test verwendet i) Wiederholen Wärme-Inaktivierung von Serum ii) Wiederholen Sie Virus-Titration Hohe Hintergrund i) Eine mögliche Kontamination von Platten ii) PNA- HRPO-Konzentration zu hoch / zu niedrig i) Wiederholen frisch beschichteten Platten mit ii) titrieren PNA-HRPO korrekte Verdünnung zu identifizieren, zu verwenden, Virus-Titration zeigt scheinbare Hemmung der NA-Aktivität bei niedrigen Verdünnungen i) Allantoisflüssigkeit kann enthalten Substrat für NA ii) Verwenden Virus, das durch ein Saccharose-Kissen pelletiert wurde Tabelle 1. Ursachenanalyse von Assays, die keine Leistungskriterien erfüllen. Diese Tabelle enthält mögliche Ursachen und Lösungen für Probleme, die auftreten können, wenn die ELLA durchführen.

Discussion

Das Enzym-linked-Lectin-Assay ist eine praktische Methode NI Antikörpertiter in Seren gemessen. Obwohl ELLA von Lambre et al., 1990 beschrieben wurde, hat seine Akzeptanz als Standard serologische Assay neueren gewesen, mit zahlreichen Laboratorien der Durchführung des Assays NI Antikörpertiter von klinischen Proben 12-16 zu messen. Einige Änderungen können ohne großen Einfluss auf die NI-Titern auf Protokollschritte durchgeführt werden, die gemessen werden. So kann beispielsweise PBS als Verdünnungsmittel verwendet werden, ist es jedoch sehr hilfreich, um die Virus-Titrationskurven in dem empfohlenen Puffer zu vergleichen (MES, pH 6,5) und PBS, bevor eine Entscheidung getroffen wird, da einige NA-Subtypen Enzymaktivität deutlich reduziert bei pH-Wert> 7,0. Wenn der optimale pH – Wert nicht verwendet wird, kann das maximale Signal des Virus reduziert werden, bei der Verwendung einer übermßigen Menge an Antigen resultierenden (dh Virus) in dem Test; unter diesen Bedingungen kann der Assay reduzierter Empfindlichkeit aufweisen.

Einige neinn-spezifische Inhibierung wird beobachtet, wenn unbehandelten Seren im ELLA getestet. Dies wird durch Hitzebehandlung (56 ° C für 45 min) entfernt, was das Vorhandensein von thermolabilen β-Inhibitoren. Andere nicht-spezifische Inhibitoren (α und γ-Klasse) von Influenza-HA beschrieben wurden, insbesondere in Bezug auf H3N2-Virus Hämagglutination und Infektiosität. Tatsächlich unspezifische Hemmung wird auch in ELLA beobachtet, wenn H3N2-Viren als Quelle für NA verwendet werden; Diese Hemmung wird durch Behandlung der Serumproben mit einer kleinen Menge von Sialidase 9 entfernt.

Wie bei anderen serologischen Assays, negative und positive Kontrollen sollten in jedem Assay eingeschlossen werden, um ein Mittel zu schaffen, die Testleistung zu bewerten. Wenn der Test nicht erfüllt Akzeptanzkriterien, sollte der Grund , identifiziert werden. Tabelle 1 enthält eine Liste der möglichen Schritte im Test, die angegangen werden können , um Probleme zu beheben.

Das ELLA Protokoll provided in diesem Bericht verwendet Reassortante Viren, die die HA mit Ursprung aus einem Vogelvirus enthalten, als Quelle der NA. Dies stellt eine Einschränkung des Tests auf die Durchführung, weil eine Genehmigung erforderlich ist, mit schwach pathogenen Geflügelpestviren zu arbeiten. H6Nx Reassortante Viren können zwischen den Laboratorien geteilt werden, nachdem sie inaktiviert worden sind. Daher kann der Test durchgeführt durch die Zusammenarbeit werden, wenn das Labor die Reassortante Virus Erzeugungs hat gezeigt, dass die Inaktivierung vollständig ist, und das Präparat seine NA-Aktivität beibehalten. Die Einschränkung der Verwendung H6Nx Reassortante Viren kann durch die Verwendung nicht-infektiöser Quellen NA überwunden werden. Zum Beispiel haben einige Laboratorien 17 gereinigtem rekombinantem NA verwendet, während andere 15 virusähnlichen Partikeln (VLPs) verwendet haben. Doch weder rekombinante NA noch VLPs sind leicht erhältlich und deshalb setzen wir Influenza-Viren mit einer antigen-mismatched avian HA zu verwenden.

Das traditionelleVerfahren NI Antikörpertiter zu messen, ist aus mehreren Gründen nicht zweckmäßig; der meisten Sorge sind die schädlichen Chemikalien, die eine Farbreaktion zu erzeugen, benötigt werden. Darüber hinaus sind große Probenvolumina erforderlich und der Test ist mühsam durchzuführen. Im Gegensatz dazu ist die ELLA einfach durchzuführen und ist in einem Format, das Titration einer angemessenen Anzahl von Proben ermöglicht. Daten aus Studien , die ELLA Variabilität zeigen , dass die Testausbeuten reproduzierbare Ergebnisse 7,8 untersucht. Die ELLA hat folglich Routinemessung von NI-Antikörpertiter möglich gemacht, und es wird erwartet, dass sie von den Laboratorien die Durchführung serologischer Studien häufiger verwendet werden.

Es gibt einige wichtige Schritte, die berücksichtigt werden müssen, wenn die ELLA durchführen. Erste, nicht-spezifische Inhibitoren der NA-Aktivität zu entfernen. Diese Inhibitoren sind in der Regel thermolabile und werden durch Wärmebehandlung bei 56 ° C für 45 min zerstört. Die Wärmebehandlung ist ausreichend unspezifische zu entfernenFIC Inhibitoren von Proben, wenn H6 Reassortante Viren als Quelle für NA verwendet werden, wenn jedoch sind H3N2-Viren im ELLA, Serumfaktoren verwendet, die mit dem ELLA zu Hämagglutinin binden stören auch und sollten durch Behandlung mit einer kleinen Menge von Sialidase entfernt werden Vorbehandlung 9 zu erwärmen. Zweitens, eine übermäßige Menge an Antigen, das heißt Reassortante H6Nx Virus, sollten nicht verwendet werden , da dies die Empfindlichkeit des Assays verringert. Sorgfältige Titration von Virus ist daher ein wichtiger Schritt; sein , die Menge an Antigen in jedem Assay verwendet wird, muss ein Signal bereitzustellen , das deutlich über dem Hintergrund ist, und im linearen Bereich der Titrationskurve sein muß, also muss das Signal (optical density) proportional zu der Virusverdünnung.

Neben der Routine-Serologie kann die ELLA verwendet werden, um antigene Unterschiede zwischen nationalen Agenturen der saisonalen Influenza-Viren zu bewerten. Diese Information kann sehr hilfreich sein, wenn Virusstämme für die Aufnahme eine Auswahls-Impfstoffkandidaten und wird zu einem besseren Verständnis von Immundruck resultieren, die in Antigendrift von NA führen. Darüber hinaus kann liefern Antigen Analyse von NAs von Schweinen oder aviäre Influenzaviren kritische Informationen in der Pandemie-Potenzial der Schwellen Stämme zu bestimmen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This project was funded by intramural PanFlu funds from the Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Plasmids used to prepare reassortant viruses were kindly provided by Robert Webster, St Jude Children’s Research Hosptial, Memphis, TN. We are indebted to Ewan Plant and Haruhiko Murata for critical review of the manuscript.

Materials

coating buffer  KPL 50-84-01
 fetuin Sigma F3385
5X MES, pH 6.5  KD-Medical PBS-0134
CaCl2 Sigma C7902
30% BSA Sigma A8327
Tween 20 Sigma P1379
Lectin PNA-HRPO Sigma  L7759
PBS-T Sigma P3563-10PAK
o-Phenylenediamine dihydrochloride Sigma P8287
phosphate-citrate buffer Sigma P4922
Sulfuric acid Sigma 258105
96-well  Maxisorp plates NUNC 439454
96-well round bottom well plates NUNC 267245
Plate sealers Thermo Scientific  14-245-192B
chicken eggs Charles River Laboratories 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs
multichannel pipette Variety of suppliers e.g., Rainin, Eppendorf 8 or 12 channel manual pipettem 50-250 µl volume
Pipette tips Depends on pipettor brand Depends on pipettor brand
Plate reader, with 490 nm filter Perkin Elmer Victor V
water bath set to 37 °C Variety of suppliers  Variety of models
water bath set to 56 °C Variety of suppliers  Variety of models
refrigerator set to 4 °C Variety of suppliers  Variety of models
incubator set to 37 °C Variety of suppliers  Variety of models
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References

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Gao, J., Couzens, L., Eichelberger, M. C. Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay. J. Vis. Exp. (115), e54573, doi:10.3791/54573 (2016).
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