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Immunology and Infection

La medición de la influenza neuraminidasa inhibición títulos de anticuerpos mediante un ensayo de lectina ligado a enzimas

Published: September 06, 2016
doi:
10.3791/54573
, ,
1Division of Viral Products, CBER,Food and Drug Administration

Summary

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Abstract

Los anticuerpos contra la neuraminidasa (NA), la segunda proteína de superficie más abundante en el virus de la influenza, contribuyen a la protección contra la influenza. Los métodos tradicionales para medir la inhibición de NA (NI) los títulos de anticuerpos no son prácticos para la serología de rutina. Este protocolo describe el ensayo ligado a enzimas lectina (ELLA), un método alternativa práctica para medir los títulos de NI que se lleva a cabo en placas de 96 pocillos recubiertas con un sustrato de la glicoproteína grande, fetuina. escinde NA ácidos siálicos terminales de fetuina, dejando al descubierto la penúltima azúcar, la galactosa. aglutinina de cacahuete (PNA) es una lectina con especificidad por galactosa y por lo tanto la extensión de la desialilación puede cuantificarse utilizando un conjugado de peroxidasa de rábano picante PNA-, seguido de la adición de un sustrato de peroxidasa cromogénico. La densidad óptica que se mide es proporcional a la actividad de NA. Para medir los títulos de anticuerpos de NI, diluciones seriadas de los sueros se incubaron a 37 ° CO / N en placas de fetuina-revestido con una cantidad fija of NA. El recíproco de la dilución más alta de suero que da como resultado la inhibición ≥50% de la actividad NA es designado como el título de anticuerpos NI. El ELLA proporciona un formato práctico para la evaluación rutinaria de las respuestas de anticuerpos humanos después de una gripe o la vacunación.

Introduction

Neuraminidasa (NA) es una glicoproteína expresada en la superficie de viriones de la gripe. Su actividad de la enzima es esencial para la liberación de partículas virales recién formadas a partir de las células infectadas 1,2. Los anticuerpos que inhiben la actividad de NA reducir los títulos de virus y síntomas de la enfermedad en modelos animales 3 y se correlacionan con la resistencia contra la enfermedad en los seres humanos 4. Por lo tanto, un aumento en la inhibición NA (NI) títulos después de la vacunación puede servir un indicador de la eficacia de la vacuna, sin embargo, muchos estudios de inmunogenicidad pasado la gripe no incluyeron este punto final, porque el ensayo tradicional para medir los títulos de anticuerpos de NI es poco práctico para la serología de rutina.

El método tradicional para medir los títulos de NI se basa en la cuantificación de la cantidad de ácido siálico que se escinde de glicoconjugados por NA 1. Este método, a menudo referido como el método de ácido tiobarbitúrico (TBA), utiliza productos químicos peligrosos para convertir ac siálicoIdentificación de un cromóforo que se puede cuantificar mediante espectrometría. El ensayo no es adecuado para probar un gran número de muestras porque se utilizan tubos de vidrio individuales, haciendo que el ensayo engorroso. La miniaturización del ensayo a una placas de 96 pocillos proporciona un formato más práctico 5, sin embargo, este ensayo todavía requiere el uso de productos químicos tóxicos y por lo tanto no es ideal.

Un ensayo alternativo para medir los títulos de anticuerpos de NI fue desarrollado por Lambré et al. 6. Este ensayo cuantifica la actividad enzimática midiendo la cantidad de la penúltima azúcar de glicoproteínas, galactosa, que queda expuesta cuando el ácido siálico es liberado por NA. Desde cacahuete aglutinina (PNA) se une específicamente a la galactosa, una peroxidasa de rábano picante PNA-(HRPO) conjugado se puede utilizar para obtener una colorimétrico lectura. La densidad óptica que se mide es por lo tanto proporcional a la actividad de NA en la muestra. Los títulos de NI se miden determinando la dilución más altade suero que inhibe al menos 50% de la actividad de NA. Este ensayo lectina ligado a enzimas (ELLA) se lleva a cabo en placas de 96 pocillos recubiertas con la fetuina, una proteína de suero altamente glicosilada, como sustrato para NA.

Una consideración importante para los ensayos que miden los títulos de NI, es la fuente de NA. Esto se debe a sueros de individuos vacunados o infectados contiene anticuerpos contra la hemaglutinina (HA), así como anticuerpos para NA. Los anticuerpos que se unen a HA pueden interferir con la actividad de NA y por lo tanto, para evitar la inhibición no específica por los anticuerpos específicos de HA, NA purificada o virus completo que contiene un HA antigénicamente no coincidentes se debe utilizar en el ensayo. Estos virus pueden ser generados por redistribución clásico o mediante genética inversa; el objetivo es rescatar un virus que contiene HA de un subtipo que no está relacionada con la cepa de destino, y NA del virus que se encuentra en estudio. El ensayo descrito en este artículo emplea virus de influenza A que se generan por revErse genética para contener HA del subtipo H6 y la AN objetivo de los virus de la gripe A, subtipos H1N1 y H3N2 5.

Los resultados son generados por Ella y ensayos miniaturizados TBA muestran estos métodos son comparables, con una especificidad y sensibilidad similares subtipo 7. ELLA no requiere el uso de productos químicos peligrosos y por lo tanto es el método preferido para medir los títulos de NI. Es fácil de realizar, con sólo unos pocos pasos (Figura 1): Las muestras se diluyen y se transfirieron a una placa revestida de fetuina a la que el virus (la fuente de NA), se añade. La placa se incuba O / N y se lavó antes de añadir PNA-HRPO. Después de una incubación de 2 horas, la placa se lava y se añade sustrato de peroxidasa; la reacción de color se detiene y, finalmente, se mide la densidad óptica y el recíproco de la dilución de la muestra que dio como resultado la inhibición de al menos 50% de actividad de NA se informa como el título de punto final 50%. Un estudio intra-laboratorio para evaluar reproducibilidad de la ELLA, mostró que la variabilidad de placa a placa es mínima y repetibilidad-operador a operador no dio lugar a diferencias de más de 2 veces en el título 7. Un estudio entre laboratorios subsiguiente de ELLA variabilidad mostró que el ensayo tiene una buena reproducibilidad cuando se lleva a cabo en diferentes laboratorios y que la inclusión de una norma puede reducir aún más la variabilidad en los resultados de 8. El ELLA es adecuado para medir los títulos de anticuerpos de NI en paneles de suero de estudios de la vacuna de la gripe preclínicos y clínicos 7 y también se puede utilizar para evaluar las diferencias antigénicas entre las AN de virus de influenza 9.

Protocol

Todos los virus reordenados en vivo con componentes aviar deben ser manejados usando nivel de bioseguridad 2 (BSL2) -Mejora de prácticas en un laboratorio aprobado para su uso por el Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA) y el comité institucional de bioseguridad. 1. Preparación de reactivos y material de partida Nota: Consulte la Tabla de Materiales para obtener la fuente de todos los reactivos. Las placas recubiertas de fetuina Preparar tampón de recubrimiento mediante la mezcla de 10 ml de 10x tampón de recubrimiento con 90 ml de H2O desionizada Preparar una solución madre de fetuina a 25 mg / ml en tampón de recubrimiento 1x y almacenar en 500 ml de alícuotas a -20 ° C. Preparar una solución de trabajo de fetuina (25 mg / ml) inmediatamente antes de las placas de revestimiento mediante la dilución de la solución madre de 1000 veces en 1 x tampón de recubrimiento. Utilizar una pipeta multicanal para dispensar 100 l de la solución de trabajo de fetuina en coll pocillos de una placa de 96 pocillos que tiene una alta capacidad de unión a proteínas. Cubrir cada placa con un sellador de placas y luego colocar las placas en grupos de 10 y se envuelven en papel de aluminio. Colocar las placas en un refrigerador (2-8 ° C) durante al menos 18 h antes de realizar un ensayo. Nota: Las placas pueden estar recubiertos con antelación y se almacenan con la solución de recubrimiento a 2-8 ° C durante un máximo de 2 meses. diluyentes Para preparar el diluyente para hacer de virus y de la muestra diluciones (2- (N morfolino) etanosulfónico (MES), pH 6,5, 20 mM CaCl 2, 1% de albúmina de suero bovino (BSA) y 0,5% de Tween 20), mezclar 94,2 ml 1X MES, pH 6,5 con 2 ml de CaCl 2 (10 mg / ml), 3,3 ml 30% de BSA y 0,5 ml de Tween 20. Para preparar el diluyente para PNA-HRPO (MES, pH 6,5 con 20 mM de CaCl2 y 1% de BSA), mezclar 94,7 ml 1x MES, pH 6,5 con 2 ml de CaCl 2 (10 mg / ml), y 3,3 ml 30% de BSA . Neuraminidasa (NA) Nota: REASS virus H6Nxortants (estos tienen HA del subtipo H6 y la AN de interés), se generan siguientes métodos publicados 5,10. Solicitar viales de virus reagrupado inactivada de un colaborador si no están disponibles en la casa. Cuando se usa virus inactivados, confirmar que la preparación es adecuada para uso en la ELLA través de la demostración de que el proceso de inactivación no tuvo un impacto significativo sobre la actividad de NA. Cultura un stock de virus H6Nx en huevos embrionados de pollo 11 y almacenar alícuotas de 0,5 ml de líquido alantoideo ordenada a -80 ° C. Utilice una nueva alícuota de virus para cada ensayo. No congelar y descongelar las partes alícuotas. Las muestras de suero y controles Heat-inactivar todos los sueros (por ejemplo, muestras de ensayo, los sueros antes y después de la vacunación, así como los controles, por ejemplo, cuando se conoce la muestra de título NI) en un baño de agua a 56 ° C durante 45-60 minutos. Guarde los sueros de -20 a -70 ° C antes o después del tratamiento térmico. Si el samples han de ser probado repetidamente, hacer varias alícuotas antes de la congelación de manera que la muestra no se congela y se descongela repetidamente. Utilice la ELLA para medir los títulos de NI de sueros humanos que están disponibles en cantidad suficiente (> 5 ml) para identificar al menos uno con un título bajo y otra con un alto título. Almacenar alícuotas de 100 l como ≤-20 ° C de modo que la misma muestra se puede utilizar como un control en muchos ensayos con el fin de realizar un seguimiento de rendimiento del ensayo. Aglutinina de cacahuete (PNA) de rábano picante peroxidasa (HRPO) Preparar el diluyente PNA-HRPO (MES, pH 6,5 con CaCl 2 y 1% de BSA). Preparar una solución madre de PNA-HRPO disolviendo 1 mg de PNA-HRPO en 1 ml de diluyente. 20-200 almacenar alícuotas a -20 ° C. Antes de utilizar un nuevo lote PNA-HRPO, prueba de 1: 500, 1: 750, 1: 1.000 y 1: 2.000 diluciones de este reactivo para identificar la cantidad que resulta en DO máxima con el control positivo (sólo virus) y un fondo ( sin virus) tsombrero es <10% de la señal positiva. Hacer diluciones de virus por cuadruplicado como se describe en la sección 2.1. La transferencia de las diluciones a una placa revestida de fetuina como se describe en la sección 2.2 y se incuba la placa a 37 ° C. Lavar la placa 16 a 18 horas más tarde y añadir 1: 500, 1: 750, 1: 1.000 y 1: 2.000 diluciones de PNA-HRPO (100 l / pocillo) para duplicar filas de la placa. Completar el ensayo como se describe en los pasos 2.3.4 a 2.3.9. Revisar los datos para seleccionar la dilución que dio lugar a una señal máxima que es> 10 veces el fondo. Inmediatamente antes de su uso, preparar la dilución óptima de PNA-HRPO identificada en 1.5.3. Preparar un gran volumen de tampón de lavado (0,01 M tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4, 0,05% de Tween 20 (PBS-T)). Almacenar a temperatura ambiente. Preparar el sustrato de peroxidasa (diclorhidrato de o-fenilendiamina (OPD)): Nota: peroxidasa sustratos alternativos tales como 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), se puede utilizar Preparar tampón de fosfato-citrato disolviendo 1 cápsula en 100 ml dH 2 O en el día de ensayo. Disolver 1 tableta de OPD (10 mg) en 20 ml de tampón de fosfato-citrato inmediatamente antes del uso. Preparar la solución de parada (1 NH 2 SO 4): añadir 27,2 ml de solución madre 98% de H 2 SO 4 a la 973 ml dH2O Mezclar y luego almacenar a temperatura ambiente. 2. La determinación de la cantidad de Na utilizar en ELLA Preparar diluciones de virus en una placa de 96 pocillos Prescindir de 120 l de diluyente de muestra (sección 1.2) en las columnas 1-11 de la placa de dilución. Para la columna 1, añadir un 96 l de diluyente de muestra adicional. Descongelar y luego vórtice el vial de virus antes de la adición de 24 l a pocillos duplicados en la columna 1. Esto da una dilución 1:10 de virus. Se hacen diluciones en serie de 2 veces de virus en diluyente de la muestra, mediante la transferencia de120 l de un pocillo al siguiente utilizando puntas de pipeta limpias para cada dilución. Transferencia de diluciones de virus a una placa recubierta de fetuina Se lavan las fetuına recubierto de la placa 3 veces con PBS-T (sección 1.6) y luego seque cada placa sobre una toalla de papel absorbente para eliminar cualquier exceso de tampón de lavado. Añadir 50 l de diluyente de muestra (sección 1.2.1) a cada pocillo en las columnas 1 a 11 de la placa de fetuina-revestido. Añadir 100 l de diluyente de la muestra a la columna 12 (estos pozos son el control negativo). Transferencia de 50 l de virus diluido desde las columnas 1-11 de la placa de dilución a los pocillos correspondientes de la placa de fetuina-revestido. Cubrir la placa con un sellador de placas y luego se coloca en un incubador humidificado a 37 ° C. Tome nota de la hora en la que se llevarán a cabo los pasos restantes (16-18 horas más tarde). Completar la Determinación NA Cuando la incubación se completa (16-18 h), la transferencia de laplaca al banco y retirar el sellador de placas. Lavar la placa 6 veces con PBS-T (sección 1.7) y luego invertir y palmada en toallas de papel absorbente para asegurar que todo el líquido se ha eliminado de los pozos. Añadir 100 ml de solución / bien PNA-HRPO (a la dilución determinada en 1.5.3) a todos los pocillos y se incuba la placa durante 2 horas a RT. Menos de 15 minutos antes de la incubación es a fin, preparar la solución volumétrica que se describe en la sección 1.7. Se lavan las placas de ensayo 3 veces para eliminar la PNA-HRPO y secar antes de añadir 100 l de sustrato OPD a cada pocillo. Incubar la placa durante exactamente 10 minutos a temperatura ambiente. Detener la reacción mediante la adición de 100 l / pocillo de ácido sulfúrico 1N. Use un lector de placas para medir la densidad óptica (DO) a 490 nm durante 0,1 seg. Guardar y exportar todos los archivos de datos. Seleccione la dilución de virus que serán utilizados para la serología Dibujar un gráfico que representa 490 nm OD </sub> valores en cada dilución de virus. Inspeccionar la curva de valoración para identificar la señal máxima (normalmente es la señal que corresponde a una meseta en el comienzo de la curva de valoración), (pozos que no contienen virus en la columna 12 de la placa de proporcionar el control de fondo) la señal mínima, y las diluciones de virus que resultan en OD que es proporcional a la dilución de entrada (es decir, la región lineal de la curva). Seleccione la dilución de virus que da aproximadamente 90% de la señal máxima y está dentro del rango lineal. Confirmar que la DO a la dilución seleccionada es al menos 10 veces mayor que la señal de fondo. Utilice la dilución de virus seleccionadas para todos los ensayos que emplean este virus acción en particular. Nota: Como alternativa, se mide la actividad de NA del virus y el uso de ~ 15-20 mU / ml de actividad de NA en el ELLA. 3. ligado a enzimas lectina Ensayo Nota: la Figura 2 shoWS la configuración de las placas de dilución y de ensayo. Hacer diluciones de muestras Colocar las muestras inactivadas por calor en el hielo. Nota: 8 sueros se puede diluir en cada placa. Para un conjunto usando diluciones de partida a las 1:10 través de la placa, añadir 120 l de diluyente de la muestra a todos los pocillos de las columnas 3-11. Para la columna 2, añadir 216 l de diluyente de muestra y 24 l de cada muestra. Mezclar la muestra en el pocillo pipeteando arriba y abajo 3 veces y después transferir 120 l a la columna siguiente. Después de cambiar las puntas de pipeta, mezclar el contenido del pozo pipeteando arriba y abajo y luego transferir 120 l a la columna siguiente. Repita el paso 3.1.4 hasta que la muestra se ha transferido a la columna 11 y los restantes 120 l desechado. Añada las muestras y virus a la placa revestida de fetuina Descongelar un vial de virus, vórtice y resuspender el virus en el diluyente (sección 1.2) en la dilución que fue seleccionado en el paso 2.4.2. Preparar al menos 5 ml de virus por cada placa de ensayo. Mantenga el virus diluido en hielo hasta que se lavan las placas y las muestras de suero se han añadido a la placa. Decidir sobre el número de placas recubiertas de fetuina que son necesarios para el ensayo (generalmente se cuenta 4 sueros por placa). Se lavan las fetuına recubierto de la placa 3 veces con PBS-T y luego invierta cada placa y secar sobre una toalla de papel absorbente para eliminar el exceso de tampón de lavado. Utilizar una pipeta multicanal para transferir 50 l de cada control de suero o dilución de la muestra de la placa de dilución en pocillos duplicados en las columnas 2-11. Añadir 50 l de virus diluido a todos los pocillos excepto el control negativo (columna 12). Añadir 50 l de diluyente de la muestra a los pocillos de la columna 1 y añadir 100 l de diluyente de la muestra a la columna 12. Cubrir los pocillos con un sellador de placas y luego mezclar golpeando suavemente los lados de la placa o la colocación en un agitador de placas a velocidad moderada durante 10 seg. Colocar la placa en una Humidifincubadora de IED a 37 ° C durante 16-18 horas. Añadir PNA-HRPO y completar el ensayo como se describe en la sección 2.3 Análisis 4. Datos Determinar la validez de los resultados del ensayo Confirmar que los valores de fondo (sin virus) están a menos de 10% del control positivo (virus y no suero). Confirman que los títulos de los sueros de control de ejecución en diferentes ensayos que usan las mismas condiciones están dentro de 2 veces del título de la mediana. Confirman que las mediciones de densidad óptica de los pocillos de control son consistentes (≤20% de diferencia) y que las mediciones de densidad óptica de los pocillos para muestras duplicadas son consistentes (≤10% de diferencia). Determinar la causa raíz de los resultados no válidos y repetir el ensayo si los criterios enumerados en el apartado 4.1.1, 4.1.2 o 4.1.3, no se cumplen. Tenga en cuenta los factores que se presentan en la Tabla 1 cuando se trata de solucionar. Asignar un título de punto final 50% Para cada placa de ensayo, Dobtract el fondo promedio (sin antígeno añadido a los pozos) de todas las lecturas. Calcular el porcentaje de inhibición a cada dilución de suero usando la fórmula: 100 x (virus OD único control – OD de la muestra de ensayo) / OD virus único control. Identificar la dilución más alta que resultó en la inhibición de al menos 50% de la señal máxima. Reportar el recíproco de esta dilución como el título de punto final del 50%. Nota: Si la inhibición de 50% no se logró en cualquier dilución, el título es menor que la primera dilución probado, por ejemplo, <10 cuando 01:10 es la primera dilución probada. Calcular la concentración inhibitoria 50% (IC 50) Utilice cuatro regresiones logísticas de parámetros para determinar el título IC 50 de la siguiente manera: restar el fondo promedio de todas las lecturas y luego transferir los resultados a un programa que lleva a cabo el análisis de regresión. Utilizar la regresión no lineal, con el conjunto máximopara el virus sólo de control y el mínimo pone a cero, para determinar la dilución que se corresponde con la inhibición de exactamente 50%. Reportar el recíproco de esta dilución como el IC50 título.

Representative Results

El ensayo presentado en este manuscrito se muestra esquemáticamente en la Figura 1. Figura 2 muestra la disposición de la placa de 96 pocillos, y se indica que diluciones en serie de las muestras de suero se preparan en una placa de dilución antes de transferirlos a la placa de fetuina-revestido. Un parámetro crítico del ensayo es la cantidad de neuraminidasa que se utiliza en el ensayo; esto se determina a través de la titulación del virus de genoma reordenado. Ejemplos de H6N1 y H6N2 titulaciones de virus se muestran en la Figura 3. A las 1:10, 1:20 y 1:40 diluciones de H6N1, la densidad óptica fue similar, indicando que las condiciones eran tales que se obtuvo una lectura máxima. A una dilución 1:80, La lectura fue de aproximadamente 90% de la máxima y por lo tanto se utilizó esta dilución de virus en los ensayos posteriores. Ejemplos de titulaciones de suero se muestran en la Figura 4. La figura muestra una muestra de suero humano que era titrado contra H6N1 y H6N2 virus. Cada punto de datos muestra el porcentaje de inhibición de la actividad de NA que se logró por diluciones en serie de suero; la dilución primera suero en el ensayo fue 1:80 H6N1; la primera dilución de suero en el ensayo fue H6N2 5. Dado que la mayor dilución que da lugar a la inhibición ≥50% es el título de anticuerpo NI, el título del suero se muestra en este ejemplo es 640 en contra de la NA de NC / 99 (N1) y 160 en contra de la NA de WI / 05 (N2). . Figura 1. Un esquema del protocolo ELLA (A) Determinación de la dilución de antígeno (virus) para utilizar en el ensayo (etapa 2 del protocolo): diluciones de virus se añaden a una placa recubierta de fetuina y la actividad medida por NA la cuantificación de residuos de galactosa terminal a través de la unión de PNA-HRPO como se describe en el paso 2.3 del protocolo; (B </stron g>) Determinación de los títulos de anticuerpos séricos de NI (paso 3 del protocolo). Las muestras se diluyen y después se transfirieron a una placa de fetuina recubierto donde se añade virus. La placa se incuba O / N antes de añadir PNA-HRPO y completar los pasos necesarios para generar una reacción de color. Por último, la reacción de color se detiene y se mide la densidad óptica. El recíproco de la dilución de la muestra que se traduce en una inhibición de al menos el 50% de la actividad de NA se presenta como el título de punto final del 50%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2. Diagrama que muestra la placa de ELLA configurado. Diluciones en serie de las muestras de suero se realizan en una placa de dilución y después se transfirieron a una placa de fetuina-revestido. 3fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3. Ejemplos de H6N1 y H6N2 titulaciones de virus. Diluciones seriadas de H6N1 BR / 07 (NA de A / Brisbane / 59/2007 (H1N1) se muestra en símbolos azules) y H6N2 UR / 07 (NA de A / Uruguay / 716 / 2007 (H3N2) se muestra en símbolos rojos) se incubaron durante 18 h en placas de fetuina recubierto y la reactividad con PNA-HRPO determinada como se describe. Promedio OD 490 nm de 2 pocillos se representa frente a la inversa de la dilución de virus. La dilución de H6N1 seleccionado para su uso en el ELLA era 1:80 y la dilución de H6N2 seleccionado fue 1:40 porque estas diluciones dio lugar a aproximadamente 90% de la densidad óptica máxima y estaban dentro del rango lineal.3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4. La valoración del suero de la AN del N1 (símbolos rojos) y N2 (símbolos azules) subtipos de NA títulos de inhibición se midieron. Contra virus reordenados H6N1 NC / 99 (contiene la NA de A / New Caledonia / 20/1999 (H1N1) ) y H6N2 WI / 05 (contiene la NA de A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2)). inhibición de la enzima por ciento por diluciones en serie de suero se muestra con la línea horizontal de trazos indica una inhibición del 50%. Los títulos de inhibición de NA en contra de la AN de A / New Caledonia / 20/1999 (H1N1) (NC / 99) y A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2) (WI / 05) fueron 2 9.3 (640) y 2 7.3 ( 160), respectivamente. Haga clic aquí para ver una mayor cincorsión de esta figura. Problema Posibles causas) Solución señal débil o ninguna meseta alcanzado en la titulación del virus i) una baja actividad enzimática NA ii) de virus no se almacena en condiciones óptimas i) confirmar que el diluyente tiene un pH que es óptimo para la actividad de NA; si el pH es óptimo, preparar un nuevo virus de reserva o concentrado de virus ii) vuelvan a crecer y alícuota de valores; viales complemento de congelación en hielo seco antes de almacenar a -80 ° C Débil o no hay color en los pocillos de control de células positivas i) dilución de virus asigna incorrectamente ii) la variabilidad Vial-a-vial en alícuotas congeladas de virus iii) PNA-HRPO desnaturalizado o diluido demasiado iv) OPD preparado incorrectamente yo); la titulación del virus de repetición ii) Valorar varios viales del mismo lote para asegurar que no hay variabilidad. Si una variabilidad significativa, preparar alícuotas frescas iii) la dilución óptima de virus a retitrate PNA-HRPO iv) Repita con preparación reciente del OPD Débil o ninguna inhibición por los sueros control positivo i) El exceso de virus utilizado en el ensayo ii) Suero deterioró i) Repetir la titulación del virus ii) Obtener nuevas condiciones de almacenamiento antisueros Ver La inhibición por los sueros de control negativo i) Inadecuado tratamiento térmico de suero ii) Muy poca virus utilizado en el ensayo i) Repetir la inactivación térmica de suero ii) la titulación del virus de repetición fondo de alta i) La posible contaminación de las placas ii) la concentración de PNA-HRPO muy alto / muy baja i) Repetir utilizando placas recién recubiertas ii) Se titula PNA-HRPO para identificar la dilución correcta de utilizar Virus titulación muestra aparente inhibición de la actividad de NA en diluciones bajas i) fluido alantoideo puede contener sustrato para NA ii) Uso virus que ha sido granulado a través de un colchón de sacarosa Tabla 1. análisis de la causa raíz de los ensayos que no cumplan con los criterios de rendimiento. Esta tabla proporciona las posibles causas y soluciones para los problemas que pueden ocurrir cuando se realiza la ELLA.

Discussion

El ensayo ligado a enzimas lectina es un método práctico para medir los títulos de anticuerpos en el suero de NI. Aunque ELLA fue descrito por Lambre et al., En 1990, su aceptación como un ensayo serológico estándar ha sido más reciente, con numerosos laboratorios que realizan el ensayo para medir los títulos de anticuerpos de NI de muestras clínicas 12-16. Algunas modificaciones se pueden hacer a pasos del protocolo sin un gran impacto en los títulos de NI que se miden. Por ejemplo, PBS se puede utilizar como diluyente, sin embargo, es muy útil para comparar las curvas de valoración del virus en el tampón recomendado (MES, pH 6,5) y PBS antes de tomar una decisión, ya que algunos subtipos de NA se han reducido de manera significativa la actividad enzimática a pH> 7,0. Cuando no se utiliza el pH óptimo, la señal máxima de virus se puede reducir, lo que resulta en el uso de una cantidad excesiva de antígeno (es decir, virus) en el ensayo; en estas condiciones, el ensayo puede tener una sensibilidad reducida.

algunos sinla inhibición específica-n se observa cuando los sueros sin tratar se ponen a prueba en el ELLA. Esto se elimina por tratamiento térmico (56 ° C durante 45 min), lo que indica la presencia de termolábiles beta inhibidores. Otros inhibidores no específicos (α y γ-clase) de la gripe HA se han descrito, en particular en relación con H3N2 hemaglutinación virus y la infectividad. De hecho, la inhibición no específica se observa también en ELLA cuando se utilizan virus H3N2 como la fuente de NA; esta inhibición se elimina por tratamiento de las muestras de suero con una pequeña cantidad de sialidasa 9.

En cuanto a otros ensayos serológicos, controles negativos y positivos deben ser incluidos en cada ensayo para proporcionar un medio para evaluar el rendimiento del ensayo. Cuando el ensayo no ha cumplido con los criterios de aceptación, la razón debe ser identificado. La Tabla 1 proporciona una lista de pasos potenciales en el ensayo que se pueden abordar para solucionar problemas.

El prov protocolo ELLAided en el presente informe utiliza virus reordenados que contienen la HA procedente de un virus aviar, como la fuente de NA. Esto representa una limitación para la realización del ensayo ya que se requiere un permiso para trabajar con virus aviar de baja patogenicidad. virus reordenados H6Nx pueden ser compartidos entre los laboratorios después de que han sido inactivados. Por tanto, el ensayo puede llevarse a cabo a través de colaboraciones una vez que el laboratorio generar el virus de genoma reordenado ha demostrado que la inactivación es completo y la preparación ha conservado su actividad de NA. La restricción de la utilización de H6Nx virus reordenados se puede superar mediante el uso de fuentes no infecciosas de NA. Por ejemplo, algunos laboratorios han utilizado recombinante purificada NA 17, mientras que otros han utilizado partículas similares a virus (VLP) 15. Sin embargo, ni NA recombinante ni VLP están fácilmente disponibles, por lo que continúan utilizando los virus de influenza aviar con un HA antigénicamente no coincidentes.

Lo tradicionalmétodo para medir los títulos de anticuerpos de NI no es práctica por varias razones; de mayor preocupación son los productos químicos nocivos que se necesitan para producir una reacción de color. Además, se necesitan grandes volúmenes de muestra y el ensayo es engorroso de realizar. En contraste, la ELLA es fácil de realizar y está en un formato que permite la valoración de un número razonable de muestras. Los datos de los estudios que examinaron ELLA muestran variabilidad que los resultados de los rendimientos de ensayo reproducibles 7,8. El ELLA ha hecho por consiguiente la medición de rutina de los títulos de anticuerpos NI posibles, y se prevé que se va a utilizar con más frecuencia por los laboratorios que llevan a cabo estudios serológicos.

Hay varios pasos críticos que deben tenerse en cuenta cuando se realiza la ELLA. En primer lugar, los inhibidores no específicos de la actividad NA deben ser eliminados. Estos inhibidores son generalmente termolábiles y son destruidas por tratamiento térmico a 56 ° C durante 45 min. El tratamiento térmico es suficiente para eliminar inespecíFIC inhibidores de las muestras cuando se utilizan virus reordenados H6 como la fuente de NA, sin embargo, cuando los virus H3N2 se utilizan en la ELLA, factores del suero que se unen a la hemaglutinina también interfieren con la ELLA y deben eliminarse por tratamiento con una pequeña cantidad de sialidasa antes del tratamiento térmico 9. En segundo lugar, una cantidad excesiva de antígeno, es decir, virus de genoma reordenado H6Nx, no debe ser usado ya que esto reduce la sensibilidad del ensayo. Por lo tanto, la valoración cuidadosa de los virus es un paso esencial; la cantidad de antígeno usada en cada ensayo debe proporcionar una señal que es muy superior a la de fondo, y debe estar dentro del intervalo lineal de la curva de valoración, es decir, la señal (densidad óptica) debe ser proporcional a la dilución de virus.

Además de la serología de rutina, el ELLA se puede utilizar para evaluar las diferencias antigénicas entre AN de virus de influenza de temporada. Esta información puede ser muy útil cuando la selección de cepas de virus para la inclusión de unas candidatas a vacunas y facilitará una mayor comprensión de las presiones inmunitarias que dan lugar a la deriva antigénica de NA. Además, el análisis antigénico de AN de virus de la influenza porcina o aviar puede proporcionar información crítica en la determinación del potencial pandémico de cepas emergentes.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This project was funded by intramural PanFlu funds from the Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Plasmids used to prepare reassortant viruses were kindly provided by Robert Webster, St Jude Children’s Research Hosptial, Memphis, TN. We are indebted to Ewan Plant and Haruhiko Murata for critical review of the manuscript.

Materials

coating buffer  KPL 50-84-01
 fetuin Sigma F3385
5X MES, pH 6.5  KD-Medical PBS-0134
CaCl2 Sigma C7902
30% BSA Sigma A8327
Tween 20 Sigma P1379
Lectin PNA-HRPO Sigma  L7759
PBS-T Sigma P3563-10PAK
o-Phenylenediamine dihydrochloride Sigma P8287
phosphate-citrate buffer Sigma P4922
Sulfuric acid Sigma 258105
96-well  Maxisorp plates NUNC 439454
96-well round bottom well plates NUNC 267245
Plate sealers Thermo Scientific  14-245-192B
chicken eggs Charles River Laboratories 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs
multichannel pipette Variety of suppliers e.g., Rainin, Eppendorf 8 or 12 channel manual pipettem 50-250 µl volume
Pipette tips Depends on pipettor brand Depends on pipettor brand
Plate reader, with 490 nm filter Perkin Elmer Victor V
water bath set to 37 °C Variety of suppliers  Variety of models
water bath set to 56 °C Variety of suppliers  Variety of models
refrigerator set to 4 °C Variety of suppliers  Variety of models
incubator set to 37 °C Variety of suppliers  Variety of models
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References

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Gao, J., Couzens, L., Eichelberger, M. C. Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay. J. Vis. Exp. (115), e54573, doi:10.3791/54573 (2016).
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