JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Meten Influenza neuraminidase Remming antilichaamtiters door Enzyme-linked lectine Assay

Published: September 06, 2016
doi:
10.3791/54573
, ,
1Division of Viral Products, CBER,Food and Drug Administration

Summary

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Abstract

Antilichamen tegen neuraminidase (NA), de tweede meest voorkomende oppervlakte-eiwit op influenzavirus, bijdragen aan bescherming tegen influenza. Traditionele methoden voor het meten NA remming (NI) antilichaamtiters zijn niet praktisch voor routinematige serologie. Dit protocol beschrijft de enzymgekoppelde lectine assay (Ella), een praktische alternatieve methode om NI titers die wordt uitgevoerd in 96-putjesplaten bekleed met een groot glycoproteïne substraat fetuïne meten. NA splitst terminale siaalzuren van fetuïne, het blootstellen van de voorlaatste suiker, galactose. Pinda agglutinine (PNA), een lectine met specificiteit voor galactose en daardoor de mate van desialylation kan worden gekwantificeerd onder toepassing van een PNA-mierikswortelperoxidase conjugaat, gevolgd door toevoeging van een chromogeen substraat peroxidase. De optische dichtheid die gemeten is evenredig met NA activiteit. NI antilichaamtiters gemeten, worden seriële verdunningen van sera geïncubeerd bij 37 ° CO / N op fetuïne beklede platen met een vast bedrag of NA. Het omgekeerde van de hoogste serumverdunning die resulteert in ≥50% remming van NA activiteit wordt aangeduid als het NI antilichaamtiter. De ELLA biedt een praktische indeling voor routine evaluatie van humaan antilichaam responsen na influenza-infectie of vaccinatie.

Introduction

Neuraminidase (NA) is een glycoproteïne op het oppervlak van influenza virions. De enzymactiviteit is essentieel voor het vrijgeven van nieuw gevormde virusdeeltjes uit de geïnfecteerde cellen 1,2. Antilichamen die een remmende activiteit te verminderen NA virus titers en ziektesymptomen in diermodellen 3 en correleren met resistentie tegen ziekte bij mensen 4. Een toename van NA remming (NI) titers na vaccinatie kan daarom dienen een indicatie van de werkzaamheid van het vaccin, maar veel verleden influenza immunogeniciteit studies geen rekening gehouden met dit eindpunt omdat de traditionele test om te meten NI antilichaamtiters is onpraktisch voor routine serologie.

De traditionele methode voor NI titers maatregel is gebaseerd op kwantificeren van de hoeveelheid siaalzuur die wordt afgesplitst van glycoconjugaten door NA 1. Deze methode, ook wel de thiobarbituur methode zuur (TBA) gebruikt gevaarlijke chemicaliën siaalzuur ac converterenid een chromofoor die kan worden gekwantificeerd met behulp van spectrometrie. De test is niet geschikt voor het testen van grote aantallen monsters omdat individuele glazen buizen worden gebruikt, waardoor de test omslachtig. Miniaturisering van de bepaling om een 96 well platen verschaft een praktische indeling 5, maar deze test vereist nog steeds het gebruik van giftige chemicaliën en daarom niet ideaal.

Een alternatieve test om NI antilichaamtiters te meten werd ontwikkeld door Lambre et al. 6. Deze assay kwantificeert enzymactiviteit door de hoeveelheid van de voorlaatste suiker glycoproteïnen, galactose, die wordt blootgesteld wanneer siaalzuur wordt vrijgegeven door NA. Aangezien pinda-agglutinine (PNA) specifiek bindt aan galactose, kan een PNA-mierikswortelperoxidase (HRPO) conjugaat worden gebruikt om een ​​colorimetrische uitlezing te verkrijgen. De optische dichtheid wordt gemeten derhalve evenredig met de NA-activiteit in het monster. NI titers worden gemeten door de hoogste verdunningserum dat ten minste 50% van de NA activiteit remt. Dit enzymgekoppelde lectine assay (Ella) wordt uitgevoerd in 96-putjesplaten bekleed met fetuïne, een sterk geglycosyleerd eiwit serum, als substraat voor NA.

Een belangrijke overweging voor testen die NI titers gemeten, is de bron van NA. Dit komt omdat sera van gevaccineerde en geïnfecteerde individuen antilichamen tegen hemagglutinine (HA) en antilichamen bevatten NA. Antilichamen die binden aan HA kan verstoren NA activiteit en derhalve niet-specifieke remming door HA-specifieke antilichamen, gezuiverde NA of compleet virus met een antigeen-mismatch HA worden gebruikt in de test te vermijden. Deze virussen kunnen worden gegenereerd door klassieke herschikking of reverse genetics; het doel is een virus dat HA bevat een subtype dat niet gerelateerd is aan het doelwit stam redden en NA van het virus dat wordt onderzocht. De in dit artikel beschreven test maakt gebruik van influenza A virussen die worden gegenereerd door revErse genetica aan HA van het subtype H6 en de gerichte NA bevatten influenza-A-virussen, subtype H1N1 en H3N2 5.

Resultaten die van Ella en geminiaturiseerde TBA assays tonen deze werkwijzen vergelijkbaar zijn met gelijke subtype specificiteit en gevoeligheid 7. ELLA vereist niet het gebruik van gevaarlijke chemicaliën en daarom de voorkeursmethode NI titers meten. Het is gemakkelijk uit te voeren met slechts een paar stappen (Figuur 1): monsters verdund en overgebracht naar een fetuïne beklede plaat waarop virus (de bron van NA) wordt toegevoegd. De plaat wordt gedurende O / N en gewassen voor het toevoegen van PNA-HRPO. Na 2 uur incubatie, de plaat gewassen en peroxidase substraat toegevoegd; de kleurreactie gestopt en tenslotte de optische dichtheid wordt gemeten en de reciproke van de verdunning die resulteerde monster in ten minste 50% remming van NA activiteiten gemeld het 50% eindpunt titer. Een intra-laboratorium onderzoek naar reproducibili beoordelenty van de ELLA bleek dat plate-to-plate variabiliteit is minimaal en operator tot operator herhaalbaarheid resulteerde in niet meer dan 2-voudig verschillen in titer 7. Een volgende inter-laboratoriumonderzoek van ELLA variabiliteit bleek dat de test heeft een goede reproduceerbaarheid wanneer deze wordt uitgevoerd in verschillende laboratoria en dat de opneming van een standaard kan een verdere verlaging van de variabiliteit in de resultaten 8. Ella is geschikt voor het meten NI antilichaamtiters in serum panels van preklinische en klinische studies influenzavaccin 7 en kan ook worden gebruikt om antigene verschillen tussen de NA's van influenzavirussen 9 evalueren.

Protocol

Alle live reassortant virussen met aviaire onderdelen moeten worden behandeld met behulp van bioveiligheidsniveau 2 (BSL2) -Enhanced praktijken in een laboratorium goedgekeurd voor gebruik door het Amerikaanse ministerie van Landbouw (USDA) en de institutionele bioveiligheid commissie. 1. Bereiding van reagentia en uitgangsmateriaal Opmerking: Raadpleeg de Materials Tabel naar de bron van alle reagentia te verkrijgen. -Fetuin gecoate platen Bereid bekledingsbuffer door 10 ml 10x coating buffer met 90 ml gedeïoniseerd H2O Bereid een voorraadoplossing van fetuïne bij 25 mg / ml in 1 x bekledingsbuffer en bewaar in 500 gl aliquots bij -20 ° C. Bereid een werkoplossing van fetuïne (25 ug / ml) onmiddellijk voor bekleden platen door verdunning van de voorraadoplossing 1000-voudig in 1x buffer coating. Gebruik een multichannel pipet tot 100 pi van de werkende oplossing van fetuïne afzien in all putjes van een 96-wells plaat die hoge eiwitbindende capaciteit heeft. Bedek elk bord met een plaat sealer dan stapelen de platen in groepen van 10 en wikkel ze in folie. Plaats de platen in de koelkast (2-8 ° C) gedurende ten minste 18 uur voor het uitvoeren van een test. Opmerking: Platen worden bekleed vooraf opgeslagen met de bekledingsoplossing bij 2-8 ° C gedurende maximaal 2 maanden. Oplosmiddelen Het verdunningsmiddel bereiden virus en monster verdunningen (2- (N -morpholino) ethaansulfonzuur (MES), pH 6,5, 20 mM CaCl2, 1% runderserumalbumine (BSA) en 0,5% Tween 20) maken, meng 94,2 ml 1X MES, pH 6,5 met 2 ml CaCl2 (10 mg / ml), 3,3 ml 30% BSA en 0,5 ml Tween 20. Het verdunningsmiddel voor PNA-HRPO (MES, pH 6,5 met 20 mM CaCl2 en 1% BSA) te bereiden, meng 94,7 ml 1x MES, pH 6,5 met 2 ml CaCl2 (10 mg / ml) en 3,3 ml 30% BSA . Neuraminidase (NA) Opmerking: H6Nx virus reassortants (deze hebben HA van H6 subtype en het NA of interest), worden gegenereerd volgende gepubliceerde methoden 5,10. Vraag flacons van geïnactiveerd reassortant virus uit een collaborateur als ze niet in huis. Bij gebruik van geïnactiveerde virus, bevestigen dat het preparaat geschikt is voor gebruik in de ELLA met bewijs dat de activering plaatsvindt aanzienlijke gevolgen voor NA activiteit had. Cultuur een voorraad H6Nx virus in geëmbryoneerde kippeneieren 11 en slaan 0,5 ml fracties zuiver allantoïsvocht bij -80 ° C. Gebruik een nieuwe hoeveelheid virus voor elke assay. Niet bevriezen en ontdooien van de monsters. Serum Monsters and Controls Hitte-inactiveren alle sera (testmonsters bijvoorbeeld voor en na de vaccinatie sera en controles zoals de monster met bekende titer NI) in een waterbad bij 56 ° C gedurende 45-60 min. Bewaar de sera bij -20 tot -70 ° C vóór of na de warmtebehandeling. Als de samples zijn om herhaaldelijk worden getest, moet meerdere porties voor het invriezen zodat het monster niet herhaaldelijk wordt ingevroren en ontdooid. Gebruik de ELLA tot NI titers van humane sera die in redelijke hoeveelheid zijn (> 5 ml) te meten ten minste één met een lage titer en elkaar te identificeren met een hoge titer. WINKEL 100 gl aliquots als ≤-20 ° C, zodat hetzelfde monster kunnen worden gebruikt als een controle in veel assays om assayprestaties volgen. Pinda agglutinine (PNA) -Horseradish Peroxidase (HRPO) Bereid de PNA-HRPO verdunningsmiddel (MES, pH 6,5 met CaCl2 en 1% BSA). Bereid een PNA-HRPO voorraadoplossing door het oplossen van 1 mg van PNA-HRPO in 1 ml oplosmiddel. WINKEL 20-200 gl aliquots bij -20 ° C. Alvorens een nieuwe PNA-HRPO lot, proef 1: 500, 1: 750, 1: 1000 en 1: 2000 verdunningen van dit reagens naar de hoeveelheid die resulteert in maximale OD van de positieve controle identificeren (virus alleen) en achtergrond ( geen virus) thoed is <10% van het positieve signaal. Maak viervoud virus verdunningen zoals beschreven in paragraaf 2.1. Breng de verdunningen om een ​​fetuïne gecoate plaat zoals beschreven in paragraaf 2.2 en incubeer de plaat bij 37 ° C. Was de plaat 16-18 uur later en voeg 1: 500, 1: 750, 1: 1000 en 1: 2000 verdunningen van PNA-HRPO (100 ul / putje) rijen van de plaat te dupliceren. Voltooiing van de test, zoals beschreven in de stappen 2.3.4 tot 2.3.9. Bekijk de gegevens om de verdunning die resulteerde in een maximale signaal dat> 10 maal de achtergrond te selecteren. Vlak voor het gebruik, de voorbereiding van de optimale verdunning van PNA-HRPO die in 1.5.3. Bereid een grote hoeveelheid wasbuffer (0,01 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4, 0,05% Tween 20 (PBS-T)). Bewaar bij kamertemperatuur. Bereid de peroxidase substraat (o-fenyleendiamine dihydrochloride (OPD)): Opmerking: alternatieve peroxidase substraten zoals 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), kan worden gebruikt Bereid fosfaat-citraatbuffer door oplossen 1 capsule 100 ml dH 2 O op de dag van assay. Los 1 tablet OPD (10 mg) in 20 ml fosfaat-citraatbuffer onmiddellijk voor gebruik. Bereid de stop-oplossing (1 NH 2 SO 4): voeg 27,2 ml bouillon 98% H 2 SO 4-973 ml dH 2 O. Meng en bewaar bij kamertemperatuur. 2. Vaststelling van het bedrag van NA te gebruiken in ELLA Bereid virusverdunningen in een 96-putjesplaat Verdeel 120 pi monster verdunner (paragraaf 1.2) in kolommen 1-11 van de verdunning plaat. Om kolom 1, voegt een extra 96 ​​pi monster verdunner. Ontdooien en vervolgens vortex de flacon van het virus voor het toevoegen van 24 pi aan putjes in kolom 1 dupliceren Dit geeft een 1:10 verdunning van het virus. Maak seriële 2-voudige verdunningen van virus in monsterverdunningsmiddel bij overdracht120 ul van de ene goed naar het volgende gebruik van schone pipetpunten voor elke verdunning. Transfer Virus verdunningen om een ​​Fetuin gecoate plaat Was de-fetuïne gecoate plaat 3 maal met PBS-T (paragraaf 1.6) en daarna dep elke plaat op absorberend papier handdoek om overtollig wasbuffer te verwijderen. Voeg 50 pl monster verdunningsmiddel (1.2.1) aan elke well in kolom 1 tot 11 van de fetuïne-beklede plaat. Voeg 100 pl monster verdunningsmiddel kolom 12 (deze putten zijn de negatieve controle). Overdracht 50 ul van de verwaterde virus uit de kolommen 1-11 van de verdunning plaat om de overeenkomstige putjes van de fetuïne-gecoate plaat. Bedek de plaat met een plaatafdichter en plaats het in een bevochtigde incubator bij 37 ° C. Noteer het tijdstip waarop de resterende stappen zullen worden uitgevoerd (16-18 uur later). Vul het NA Determination Wanneer de incubatie voltooid is (16-18 uur), breng deplaat naar de bank en verwijder de plaat sealer. Was de plaat 6 keer met PBS-T (paragraaf 1.7) en vervolgens te keren en dep op absorberend papier handdoeken te zorgen dat alle vloeistof is uit de putjes verwijderd. Voeg 100 ul / putje PNA-HRPO oplossing (bij een verdunning bepaald 1.5.3) aan alle putjes en incubeer de plaat gedurende 2 uur bij KT. Minder dan 15 min voor de incubatie is hiertoe, OPD-oplossing zoals beschreven in paragraaf 1.7. Was de test platen 3 keer om de PNA-HRPO verwijderen en dep droog zijn voor het toevoegen van 100 ul van de OPD substraat aan elk putje. Incubeer de plaat gedurende precies 10 minuten bij kamertemperatuur. Stop de reactie door toevoeging van 100 ul / putje 1 N zwavelzuur. Gebruik een plaatlezer om de optische dichtheid (OD) bij 490 nm gemeten voor 0,1 sec. Opslaan en exporteren alle gegevensbestanden. Selecteer de Virus Verwatering die zullen worden gebruikt voor Serologie Teken een grafiek die OD 490 nm uitzet </sub> waarden op elk virus verdunning. Inspecteer de titratiecurve het maximale signaal te identificeren (dit is meestal het signaal dat overeenkomt met een plateau aan het begin van de titratie curve), de minimale signaal (putten die geen virus in kolom 12 van de plaat bevatten over een achtergrondcontrole), en de verdunningen van virus die leiden tot OD die evenredig is met de ingang verdunning (dat wil zeggen lineaire gebied van de curve). Selecteer de virusverdunning dat ongeveer 90% van het maximale signaal geeft en binnen het lineaire bereik. Controleer of de OD bij de geselecteerde verdunning ten minste 10 maal groter dan het achtergrondsignaal. Gebruik de geselecteerde virus verdunning voor alle testen die dit specifieke virus voorraad in dienst. Let op: U kunt ook het meten van de NA activiteit van het virus en het gebruik van ~ 15-20 pU NA activiteit / ml in de ELLA. 3. Enzym-gebonden lectine Assay Opmerking: Figuur 2 shows de opzet van de verdunning en assay platen. Maak Sample verdunningen Plaats het warmte geïnactiveerd monsters op ijs. Opmerking: 8 sera kunnen in elke plaat worden verdund. Voor een set-up met behulp van verdunningen beginnend bij 1:10 over de plaat, voeg 120 ul monster verdunner aan alle putjes in de kolommen 3-11. Kolom 2, voeg 216 pl monster verdunningsmiddel en 24 pl van elk monster. Meng het monster in de put door en neer te pipetteren 3 maal en breng 120 ul naar de volgende kolom. Na het veranderen pipetpunten, meng de inhoud van de put door en neer te pipetteren en breng 120 ul naar de volgende kolom. Herhaal stap 3.1.4 totdat het monster is overgedragen aan kolom 11 en de resterende 120 ul weggegooid. Monsters en Virus toe te voegen aan de Fetuin-gecoate plaat Dooi een flacon van het virus, vortex en resuspendeer het virus in het oplosmiddel (paragraaf 1.2) aan de verdunning die werd geselecteerd in stap 2.4,2. Maak minstens 5 ml virus per testplaat. Houd de verdunde virusoplossing op ijs tot de platen gewassen en serummonsters werden aan de plaat toegevoegd. Beslis over het aantal fetuïne-beklede platen die nodig zijn voor de bepaling (algemene toepassing 4 sera per plaat). Was de-fetuïne gecoate plaat 3 maal met PBS-T en keer dan elke plaat en dep op absorberend papier handdoek om overtollig wasbuffer te verwijderen. Gebruik een multichannel pipet tot 50 pl van elk serum controle of monster verwatering te brengen van de verdunning plaat in tweevoud putten in de kolommen 2-11. Voeg 50 pl verdunde virusoplossing aan alle putjes behalve de negatieve controle (kolom 12). Voeg 50 pl monster verdunningsmiddel aan wells in kolom 1 en voeg 100 pl monster verdunningsmiddel kolom 12. Bedek de putten met een plaat sealer en meng door voorzichtig te tikken zijden van de plaat of het plaatsen op een bord shaker matige snelheid gedurende 10 sec. Plaats de plaat in een Humidified incubator bij 37 ° C gedurende 16-18 uur. Voeg PNA-HRPO en vul de test zoals beschreven in paragraaf 2.3 4. Data Analysis Bepaal de geldigheid van de testresultaten Bevestig dat de achtergrondwaarden (geen virus) zijn minder dan 10% van de positieve controle (virus en geen serum). Bevestigen dat de titers van controlesera run in verschillende tests onder dezelfde omstandigheden zijn binnen 2-voudige van de mediaan titer. Bevestigen dat OD metingen van controle putten zijn consistent (≤20% verschillend) en dat OD metingen van duplomonster putten zijn consistent (≤10% verschillend). Bepaal de oorzaak van ongeldige resultaten en herhaal de test als de in 4.1.1, 4.1.2 of 4.1.3 genoemde criteria, wordt niet voldaan. Houd rekening met de factoren die in Tabel 1 wanneer het proberen om op te lossen. Wijs een 50% End-point Titer Voor elke assay plaat, subtract de gemiddelde achtergrond (geen antigeen toegevoegd aan putjes) uit alle metingen. Bereken het percentage remming bij elke serumverdunning met behulp van de formule: 100 x (OD virus alleen controle – OD monster) / OD virus alleen controle. Identificeer de hoogste verdunning die resulteerde in ten minste 50% remming van het maximale signaal. Rapporteren de omgekeerde van deze verdunning als het 50% eindpunt titer. Opmerking: Als 50% remming niet werd bereikt op enige verdunning, de titer is dan de eerste verdunning getest, bijvoorbeeld <10 bij 01:10 is de eerste verdunning getest. Bereken de 50% remmende concentratie (IC 50) Gebruik vier parameter logistische regressie op de IC-50 titer te bepalen als volgt: trek de gemiddelde voor de achtergrond van alle lezingen en vervolgens over de resultaten aan een programma dat regressie-analyse uitvoert. Gebruik van niet-lineaire regressie, met de maximale sethet virus uitsluitend het beheer en de minimale ingesteld op nul, de verdunning die overeenkomt met precies 50% remming te bepalen. Rapporteren de omgekeerde van deze verdunning als de IC 50 titer.

Representative Results

De bepaling in dit manuscript wordt schematisch weergegeven in figuur 1. Figuur 2 toont de 96 putjesplaat lay-out, en geeft aan dat seriële verdunningen van de serummonsters worden bereid in een verdunning plaat voor het overzetten naar de fetuïne-beklede plaat. Een kritische parameter van de test is de hoeveelheid neuraminidase die wordt gebruikt in de test; Dit wordt bepaald door middel van titratie van de reassortant virus. Voorbeelden van H6N1 en H6N2 virus titraties zijn weergegeven in figuur 3. Op 1:10, 1:20 en 1:40 verdunningen van H6N1, de optische dichtheid was vergelijkbaar, wat aangeeft dat de omstandigheden zodanig dat een maximale waarde verkregen waren. Bij een 1:80 verdunning, de uitlezing ongeveer 90% van de maximale en daarom is deze verdunning van virus werd gebruikt in de volgende assays. Voorbeelden van serum titraties zijn weergegeven in figuur 4. De figuur toont een humaan serummonster dat was ticentreerde tegen H6N1 en H6N2 virussen. Elk datapunt geeft het percentage remming van NA activiteit die werd verkregen door seriële verdunningen van het serum; de eerste serumverdunning in het H6N1-test was 1:80; de eerste verdunning van serum in de H6N2 assay was 5. Aangezien de hoogste verdunning die resulteert in ≥50% remming NI antilichaamtiter, de titer van het in dit voorbeeld serum is 640 tegen de NA van NC / 99 (N1) en 160 tegen de NA van WI / 05 (N2). . Figuur 1. Een schematische weergave van de ELLA protocol (A) Bepaling van de verdunning van het antigeen (virus) te gebruiken in de assay (stap 2 van het protocol): Virus verdunningen toegevoegd aan een fetuïne beklede plaat en de NA activiteit gemeten kwantificeren terminal galactose resten door binding van PNA-HRPO zoals beschreven in stap 2.3 van het protocol; (B </stron g>) Bepaling van serum NI antilichaamtiters (stap 3 van het protocol). Monsters werden verdund en vervolgens overgebracht naar een fetuïne-beklede plaat waarbij virus wordt toegevoegd. De plaat wordt gedurende O / N voor het toevoegen van PNA-HRPO en het voltooien van de stappen die nodig zijn om een ​​kleur reactie te genereren. Tenslotte wordt de kleurreactie gestopt en de optische dichtheid wordt gemeten. Het omgekeerde van het monster verdunning die resulteert in ten minste 50% remming van de NA-activiteit wordt gerapporteerd als het 50% eindpunt titer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2. Diagram aantonen Ella plaat ingesteld. Seriële verdunningen van serummonsters in een verdunning plaat en vervolgens overgebracht naar een fetuïne-beklede plaat. 3fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3. Voorbeelden van H6N1 en H6N2 virus titraties. Seriële verdunningen van H6N1 BR / 07 (NA van A / Brisbane / 59/2007 (H1N1), weergegeven in blauwe symbolen) en H6N2 UR / 07 (NA van A / Uruguay / 716 / 2007 (H3N2) in het rood symbolen) werden gedurende 18 uur in fetuïne beklede platen en de reactiviteit met PNA-HRPO bepaald zoals beschreven. Gemiddelde OD 490nm van 2 putjes uitgezet tegen de reciproke van de verdunning virus. De verdunning van H6N1 voor gebruik bij de ELLA was 1:80 en de verdunning van 1:40 H6N2 gekozen was omdat deze verdunningen resulteerde in ongeveer 90% van de maximale optische dichtheid en lagen binnen het lineaire bereik.3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4. Titratie van serum tegen NA van N1 (rode symbolen) en N2 (blauwe symbolen) subtypes. NA remming titers werden gemeten tegen reassortant virussen H6N1 NC / 99 (bevat de NA van A / New Caledonia / 20/1999 (H1N1) ) en H6N2 WI / 05 (bevat de NA van de A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2)). Percentage enzymremming voor seriële verdunningen van serum wordt getoond met de gestippelde horizontale lijn die 50% remming. De NA remming titers tegen de NA van de A / New Caledonia / 20/1999 (H1N1) (NC / 99) en A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2) (WI / 05) waren 2 9.3 (640) en 2 7.3 ( 160), respectievelijk. klik hier om te zien een grotere version van dit cijfer. Probleem Mogelijke oorzaken) Oplossing Zwak signaal of geen plateau bereikt in virus titratie i) lage NA enzymactiviteit ii) virus voorraad niet onder optimale omstandigheden bewaard i) bevestigen dat het verdunningsmiddel pH die optimaal is voor NA activiteit; als pH optimaal is, voor te bereiden een nieuw virus voorraad of concentraat virus ii) teruggroeien en de hoeveelheid voorraad; snap-vries flesjes op droog ijs voordat u bij -80 ° C Zwakke of geen kleur in positieve cel controleputjes i) virusverdunning foutief toegewezen ii) Vial-to-flacon variabiliteit in bevroren virus porties iii) PNA- HRPO gedenatureerd of verdund te veel iv) OPD verkeerd bereid ik); Herhaal virus titratie ii) Titreer diverse flacons uit dezelfde partij om ervoor te zorgen is er geen variatie. Als belangrijke variabiliteit, voor te bereiden verse porties iii) Gebruik optimale virus verdunning tot retitrate PNA- HRPO iv) Herhaal dit met verse bereiding van OPD Zwakke of geen remming door positieve controle sera i) Teveel gebruikte virus in bepalingsbuffer ii) Serum verslechterd i) Herhaal virus titratie ii) Verkrijgen van nieuwe antisera controleren bewaarcondities Remming door negatieve controle sera i) ondeskundige warmtebehandeling van serum ii) Te weinig gebruikte virus in bepalingsbuffer i) Herhaal hitte-inactivatie van serum ii) Herhaal virustitratie high achtergrond i) Mogelijke verontreiniging platen ii) PNA- HRPO concentratie te hoog / te laag i) Herhaal met vers beklede platen ii) Titreer PNA-HRPO juiste verdunning identificeren gebruiken Virus titratie toont duidelijk de remming van NA-activiteit bij lage verdunningen i) allantoïsvocht kan substraat voor NA bevatten ii) Gebruik virus dat werd gepelleteerd door een sucrose kussen Tabel 1. Probleemanalyse assays die niet aan prestatiecriteria. Deze tabel geeft de mogelijke oorzaken en oplossingen voor problemen die zich kunnen voordoen bij het uitvoeren van de ELLA.

Discussion

Het enzymgekoppelde lectine assay is een praktische methode om NI antilichaamtiters gemeten in sera. Hoewel ELLA in 1990 werd beschreven door Lambre et al., Is de acceptatie als standaard serologische test recenter zijn, met talrijke laboratoria die de assay NI antilichaamtiters van klinische monsters 12-16 te meten. Sommige modificaties kunnen worden aangebracht protocol stappen zonder grote invloed op NI titers die gemeten. Zo kan PBS worden gebruikt als verdunningsmiddel, echter, is het zeer nuttig om het virus titratie krommen in de aanbevolen buffer (MES, pH 6,5) te zoeken en PBS voordat een beslissing wordt gemaakt, omdat sommige NA subtypen significant verminderde enzymactiviteit bij pH> 7,0. Wanneer de optimale pH niet wordt gebruikt, kan de maximale signaal virus worden verminderd, waardoor het gebruik van een overmatige hoeveelheid antigen (dwz virus) in de test; onder deze omstandigheden, kan de test verminderde gevoeligheid.

sommige geenn-specifieke remming waargenomen bij onbehandelde sera getest in de ELLA. Deze wordt verwijderd door warmtebehandeling (56 ° C gedurende 45 min), hetgeen de aanwezigheid van thermolabiele β-remmers. Andere niet-specifieke remmers (α en γ-klasse) van influenza HA zijn beschreven, met name wat betreft H3N2 virus hemagglutinatie en infectiviteit. Inderdaad wordt aspecifieke inhibitie ook waargenomen in ELLA wanneer H3N2 virussen worden gebruikt als bron van NA; Deze remming wordt verwijderd door behandeling van de serummonsters een kleine hoeveelheid sialidase 9.

Voor andere serologische assays dienen negatieve en positieve controles worden opgenomen in elke assay een middel om assayprestaties evalueren. Als de test niet heeft voldaan aan de acceptatiecriteria, moet de reden worden geïdentificeerd. Tabel 1 geeft een lijst van mogelijke stappen in de test die kan worden gericht om problemen op te lossen.

De ELLA protocol provided in dit rapport wordt gereassorteerde virussen die HA afkomstig van een vogel virus bevatten, als bron voor NA. Dit vormt een beperking van het uitvoeren van de test, omdat een vergunning nodig is om te werken met laagpathogene aviaire virussen. H6Nx gereassorteerde virussen kunnen worden gedeeld tussen laboratoria nadat ze zijn geïnactiveerd. Derhalve kan de test worden uitgevoerd via samenwerking zodra het laboratorium genereren van de reassortant virus is aangetoond dat de inactivatie volledig is en het preparaat Na- activiteit behouden. De beperking van het gebruik H6Nx reassortante virussen kunnen worden overwonnen door niet-infectieuze bron van NA. Bijvoorbeeld hebben sommige laboratoria gezuiverd recombinant NA 17 gebruikt, terwijl andere virusachtige deeltjes (VLP's) 15 gebruikt. Noch recombinant NA of VLP's zijn direct beschikbaar en daarom blijven we influenzavirussen gebruiken met een antigeen-mismatch aviaire HA.

De traditionelemethode NI antilichaamtiters gemeten is niet praktisch om verschillende redenen; van de meeste zorg zijn de schadelijke chemische stoffen die nodig zijn om een ​​kleur reactie veroorzaken. Bovendien worden grote hoeveelheden benodigd monster en de test is lastig uit te voeren. Daarentegen Ella is gemakkelijk uit te voeren en is in een formaat dat titratie van een redelijk aantal monsters mogelijk maakt. Gegevens uit studies die ELLA variabiliteit tonen aan dat de test levert reproduceerbare resultaten 7,8 onderzocht. De Ella maakten de routinemeting van NI antilichaamtiters mogelijk, en verwacht wordt dat vaker wordt gebruikt door laboratoria die serologische studies.

Er zijn een aantal kritische stappen die moeten worden genomen bij het uitvoeren van de ELLA. Eerst moeten niet-specifieke remmers van NA activiteit verwijderd. Deze remmers zijn algemeen thermolabiele en vernietigd door een warmtebehandeling bij 56 ° C gedurende 45 minuten. Warmtebehandeling is voldoende om niet-speci verwijderenfic remmers van monsters wanneer H6 opnieuw geordende virussen worden gebruikt als bron van NA, echter, wanneer H3N2 virussen worden gebruikt in de ELLA, serum factoren die binden aan hemagglutinine storingen veroorzaken ELLA en moet worden verwijderd door behandeling met een kleine hoeveelheid sialidase voor de behandeling 9 verwarmen. Ten tweede, een overmatige hoeveelheid antigeen, dwz H6Nx gereassorteerde virus, niet worden gebruikt, omdat dit de gevoeligheid van de assay vermindert. Zorgvuldige titratie van het virus is dus een essentiële stap; de hoeveelheid antigeen die in elke test moet een signaal dat duidelijk boven de achtergrond verschaffen, en moeten in het lineaire bereik van de titratie curve, dat wil zeggen dat het signaal (optische dichtheid) evenredig met de virusverdunning zijn.

Naast de gebruikelijke serologie, kan de ELLA worden gebruikt om antigene verschillen tussen agentschappen van seizoensgebonden influenzavirussen te evalueren. Deze informatie kan zeer nuttig zijn bij het selecteren van virusstammen voor opname van eens vaccin kandidaten en zal een beter begrip van het immuunsysteem van de druk die resulteren in antigene drift van NA te vergemakkelijken. Daarnaast kunnen antigene analyse van NA's van varkens of aviaire influenza virussen kritische informatie te verstrekken bij het bepalen van de pandemie potentieel van opkomende stammen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This project was funded by intramural PanFlu funds from the Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Plasmids used to prepare reassortant viruses were kindly provided by Robert Webster, St Jude Children’s Research Hosptial, Memphis, TN. We are indebted to Ewan Plant and Haruhiko Murata for critical review of the manuscript.

Materials

coating buffer  KPL 50-84-01
 fetuin Sigma F3385
5X MES, pH 6.5  KD-Medical PBS-0134
CaCl2 Sigma C7902
30% BSA Sigma A8327
Tween 20 Sigma P1379
Lectin PNA-HRPO Sigma  L7759
PBS-T Sigma P3563-10PAK
o-Phenylenediamine dihydrochloride Sigma P8287
phosphate-citrate buffer Sigma P4922
Sulfuric acid Sigma 258105
96-well  Maxisorp plates NUNC 439454
96-well round bottom well plates NUNC 267245
Plate sealers Thermo Scientific  14-245-192B
chicken eggs Charles River Laboratories 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs
multichannel pipette Variety of suppliers e.g., Rainin, Eppendorf 8 or 12 channel manual pipettem 50-250 µl volume
Pipette tips Depends on pipettor brand Depends on pipettor brand
Plate reader, with 490 nm filter Perkin Elmer Victor V
water bath set to 37 °C Variety of suppliers  Variety of models
water bath set to 56 °C Variety of suppliers  Variety of models
refrigerator set to 4 °C Variety of suppliers  Variety of models
incubator set to 37 °C Variety of suppliers  Variety of models
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kilbourne, E. D., Laver, W. G., Schulman, J. L., Webster, R. G. Antiviral activity of antiserum specific for an influenza virus neuraminidase. J Virol. 2 (4), 281-288 (1968).
  2. Compans, R. W., Dimmock, N. J., Meier-Ewert, H. Effect of antibody to neuraminidase on the maturation and hemagglutinating activity of an influenza A2 virus. J Virol. 4 (4), 528-534 (1969).
  3. Schulman, J. L., Khakpour, M., Kilbourne, E. D. Protective effects of specific immunity to viral neuraminidase on influenza virus infection of mice. J Virol. 2 (8), 778-786 (1968).
  4. Murphy, B. R., Kasel, J. A., Chanock, R. M. Association of serum anti-neuraminidase antibody with resistance to influenza in man. N Engl J Med. 286 (25), 1329-1332 (1972).
  5. Sandbulte, M. R., Gao, J., Straight, T. M., Eichelberger, M. C. A miniaturized assay for influenza neuraminidase-inhibiting antibodies utilizing reverse genetics-derived antigens. Influenza Other Respi Viruses. 3 (5), 233-240 (2009).
  6. Lambre, C. R., Terzidis, H., Greffard, A., Webster, R. G. Measurement of anti-influenza neuraminidase antibody using a peroxidase-linked lectin and microtitre plates coated with natural substrates. J Immunol Methods. 135 (1-2), 49-57 (1990).
  7. Couzens, L., et al. An optimized enzyme-linked lectin assay to measure influenza A virus neuraminidase inhibition antibody titers in human sera. J Virol Methods. 210C, 7-14 (2014).
  8. Eichelberger, M. C., et al. Comparability of neuraminidase inhibition antibody titers measured by enzyme-linked lectin assay (ELLA) for the analysis of influenza vaccine immunogenicity. Vaccine. 34 (4), 458-465 (2016).
  9. Westgeest, K. B., et al. Optimization of an enzyme-linked lectin assay suitable for rapid antigenic characterization of the neuraminidase of human influenza A(H3N2) viruses. J Virol Methods. 217, 55-63 (2015).
  10. Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y., Hobom, G., Webster, R. G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 6108-6113 (2000).
  11. WHO. . Manual of Animal Influenza Diagnosis and Surveillance. , (2002).
  12. Cate, T. R., et al. A high dosage influenza vaccine induced significantly more neuraminidase antibody than standard vaccine among elderly subjects. Vaccine. 28 (9), 2076-2079 (2010).
  13. Couch, R. B., et al. Antibody correlates and predictors of immunity to naturally occurring influenza in humans and the importance of antibody to the neuraminidase. J Infect Dis. 207 (6), 974-981 (2013).
  14. Fritz, R., et al. Neuraminidase-Inhibiting Antibody Response to H5N1 Virus Vaccination in Chronically Ill and Immunocompromised Patients. Open Forum Infect Dis. 1 (2), (2014).
  15. Fries, L. F., Smith, G. E., Glenn, G. M. A recombinant viruslike particle influenza A (H7N9) vaccine. N Engl J Med. 369 (26), 2564-2566 (2013).
  16. Monto, A. S., et al. Antibody to Influenza Virus Neuraminidase: An Independent Correlate of Protection. J Infect Dis. 212 (8), 1191-1199 (2015).
  17. Fritz, R., et al. A vero cell-derived whole-virus H5N1 vaccine effectively induces neuraminidase-inhibiting antibodies. J Infect Dis. 205 (1), 28-34 (2012).

Tags

InfluenzaNeuraminidaseAntibodyELLAEnzyme-linked Lectin AssayH6 Reassortant VirusFetuin-coated PlatePeanut AgglutininHRPVaccine

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gao, J., Couzens, L., Eichelberger, M. C. Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay. J. Vis. Exp. (115), e54573, doi:10.3791/54573 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image