אקוסטית אוטומטית מחלק עבור דילול סדרה של אגוניסטים פפטיד ב מבחני קביעת און
Summary
Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.
Abstract
כמו גילוי תרופות מולקולה קטנה, בדיקות סקר לאיתור אגוניסטים פפטיד מחייב דילול סדרתי של פפטידים לייצר תגובה עקומות ריכוז. הקרנת פפטידים מעניקה שכבה נוספת של מורכבות כמו שיטות טיפול מדגם קונבנציונליות מבוסס קצה לחשוף פפטידים על שטח פנים גדול של plasticware, מתן הזדמנות מוגברת אובדן פפטיד באמצעות ספיחה. מניעת חשיפה מוגזמת plasticware מפחית אובדן פפטיד באמצעות דבקות פלסטיק ובכך מצמצם אי דיוקים חיזוי עוצמה, ואנו בעבר תיאר את היתרונות של אקוסטית ללא מגע מחלק להקרנה במבחנה תפוקה גבוהה של אגוניסטים פפטיד 1. כאן אנו דנים פתרון אוטומציה משולבים במלואם להכנת אקוסטי ללא מגע של דילולים סדרתי פפטיד צלחות microtiter ניצול בדוגמה של ההקרנה עבור אגוניסטים פפטיד על קולטן גלוקגון דמוי עכבר פפטיד-1 (GLP-1R). השיטות שלנו לאפשר גבוה-throughput מבוסס תאי מבחני למסך עבור אגוניסטים והם להרחבה בקלות לתמוך תפוקת מדגם גדלה, או כדי לאפשר למספר גדול יותר של עותקי צלחת assay (למשל, עבור פנל של קווים נוספים תא המטרה).
Introduction
של GLP-1R מהווה יעד תרופה קיימת לטיפול בסוכרת מסוג 2 2. אגוניסט פפטיד המקורי עבור קולטן זה, GLP-1, יש in vivo זמן מחצית חיים של 2-3 דק '3. הכריכה של GLP-1 לתוצאות קולטן היעד מצמידים חלבון G שלה בייצור במורד הזרם של cAMP השליח השני באמצעות צימוד חלבון יליד ז 'ההפעלה של cyclase adenylyl. מדידה במחנה שנצבר מספקת assay חזק כדי לפקח הפעלת קולטן ו למסך אנלוגים GLP-1 פעילים עם מאפייני physicochemical מועדפים. כזה assay מחייב דילול סדרה של דגימות בדיקה לבנות תגובה עקומה ריכוז, וזה מסובך במיוחד בעת מסירת דגימות פפטיד. שגיאות פוטנציאליות מהכנת דילול סדרה מבוסס קצה תוארו בעבר 1,4,5. פפטידים יהיה לספוג plasticware, וכתוצאה מכך הערכות עצמה אמינות. ניתן למזער אובדן פפטיד באמצעות tהוא הכללת אלבומין בסרום שור (BSA) מאגרים ושימוש plasticware siliconized, עדיין חלבון מחייב נשאר בלתי צפויות. בפרט, וריאציה עקדת GLP-1 למיכלי ניסיוני תוארה 6. יש סיבוך נוסף סוכני ייצוב לזה המשמש plasticware מעבדה יכול לסנן מן טיפי צלחות microtiter לתוך מאגרי assay מימית ולהפריע חלבון פונקציה 7, 8. לכן, שיטות להקטין את חשיפת plasticware נחוצה כדי לשפר את מידת הדיוק של מדידות.
מכשירי נוזלי אקוסטיות להתמקד צליל האקוסטי בתדירות גבוהה על פני השטח של מדגם נוזל, וכתוצאה מכך הוא הוצאתן של טיפות nanoliter מדויקות לתוך צלחת assay סמוכה 9. השימוש של פליטה אקוסטית הוא סטנדרטי בתעשיית התרופות לעריכת הקרנת ספריות תרכובת סינטטיות גדולות, ואת הטכנולוגיה תאומת טוב molecul הקטןes 10. למיטב ידיעתנו, אנחנו הקבוצה הראשונה לתאר מחלק אקוסטי לעריכת פפטידים רקומביננטי וסינטטיים ואנחנו בעבר דיווחנו על הדיוק המשופר בהשוואה לשיטות קצה מבוסס קונבנציונליות 1.
מאמר זה מתאר את האינטגרציה של הכנת דילולים סדרתי וישיר פפטיד בהעברה אקוסטי ללא מגע על גבי מערכת רובוטיקה טיפול צלחת אוטומטי לחלוטין. מספר השיטות המקיפות העברת אקוסטי של דגימות תוארו בעבר 11. אנו מנצלים שיטת שני שלבים להכין ריכוזי מניות ביניים לדלל אנלוגים פפטיד סדר עבור הדור של עקומת מנה-תגובה המלאה. פפטידים מוכן מודגרת עם תאים המבטאים את עכבר היעד GLP-1R, ואנו משתמשים קרינת זמן נפתר הומוגנית זמין מסחרי (HTRF) assay למדוד הצטברות cAMP בתוך התאים האלה כמו הודעה של activ אגוניסט פפטידity. Assay הוא חזק מקובל בפורמט תפוקה גבוהה 384 גם ויישמנו באופן שיגרתי הוא בפיתוח assay הקרנת סמי פרויקטים 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את היישום המוצלח של מחלק אקוסטי האוטומטי לדלל דגימות פפטיד סדרתי על פני טווח ריכוז של 3 x 10 6 הדורשים פחות מ -1 μl של מדגם. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא לשפר את איכות נתונים באמצעות מזעור ספיחת פפטיד plasticware באמצעות לחשיפה מצומצמת של דגימות למכלי ניס?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
None.
Materials
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Prepared as a 0.5 M stock in DMSO |
| GLP-1 (7-36) amide | Bachem | H-6795 | Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100X reference control' |
| Test peptides | Produced in-house at MedImmune | Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate | |
| 100X peptide stock | Produced in-house at MedImmune | Test peptide diluted into assay buffer to 100X final required concentration | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Cedex XS Cell Analyzer | Innovatis | ||
| Corning 384 well plates, low volume | Sigma-Aldrich | 4514 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate | Labcyte Inc. | P-05525 | |
| Echo Qualified Reservoir | Labcyte Inc. | ER-0055 | |
| Echo 550 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl | |
| Echo 525 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 25 nl | |
| ACell Benchtop Automation | HighRes Biosolutions | MC522 | |
| Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics | HighRes Biosolutions | ||
| MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermFisher Scientific | 5840300 | Referred to as 'bulk reagent dispenser' |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEJ | |
| EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer |
References
- Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow. J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).
- Campbell, J. E., Drucker, D. J. Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action. Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).
- Hui, H., Farilla, L., Merkel, P., Perfetti, R. The short half-life of glucagon-like peptide-1 in plasma does not reflect its long-lasting beneficial effects. Eur.J.Endocrinol. 146 (6), 863-869 (2002).
- Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, contact-free volume transfers minimize compound loss in dose-response experiments. J.Biomol.Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
- Ekins, S., Olechno, J., Williams, A. J. Dispensing Processes Impact Apparent Biological Activity as Determined by Computational and Statistical Analyses. PLoS ONE. 8 (5), 62325 (2013).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Tache, Y., Reeve, J. R. The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal.Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
- McDonald, G. R., et al. Bioactive Contaminants Leach from Disposable Laboratory Plasticware. Science. 322 (5903), 917 (2008).
- Belaiche, C., Holt, A., Saada, A. Nonylphenol ethoxylate plastic additives inhibit mitochondrial respiratory chain complex I. Clin Chem. 55 (10), 1883-1884 (2009).
- Sackmann, E. K., et al. Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection. J.Lab.Autom. 21 (1), 166-177 (2016).
- Grant, R. J., et al. Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology. J.Biomol.Screen. 14 (5), 452-459 (2009).
- Turmel, M., Itkin, Z., Liu, D., Nie, D. An Innovative Way to Create Assay Ready Plates for Concentration Response Testing Using Acoustic Technology. J.Lab.Autom. 15 (4), 297-305 (2010).
- Butler, R., et al. Use of the site-specific retargeting jump-in platform cell line to support biologic drug discovery. J.Biomol.Screen. 20 (4), 528-535 (2015).
- Panchal, S., Verma, R. J. Effect of sodium fluoride in maternal and offspring rats and its amelioration. Asian Pac.J.Reprod. 3 (1), 71-76 (2014).
- Hanson, S. M., Ekins, S., Chodera, J. D. Modeling error in experimental assays using the bootstrap principle: understanding discrepancies between assays using different dispensing technologies. J.Comput. Aided Mol.Des. 29 (12), 1073-1086 (2015).
- Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments. J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
- Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing. J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).
- Roberts, K., et al. Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays. J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).
