Automated acústico de distribuição para a diluição de série do Peptide agonistas em potência Determinação Ensaios

O GLP-1R é um alvo de droga estabelecida no tratamento de diabetes tipo ² 2. O agonista do péptido nativo para este receptor, o GLP-1, tem uma semi-vida in vivo de 2-3 min ^3. A ligação do GLP-1 aos seus receptores alvo resultados acoplados a proteína G na produção a jusante do segundo mensageiro cAMP através do acoplamento à proteína G nativa para a activação da adenilil-ciclase. A medição do AMPc acumulado proporciona um ensaio robusto para monitorizar a activação do receptor e para o rastreio de activos análogos de GLP-1 com propriedades físico-químicas preferidas. Um tal ensaio requer a diluição em série de amostras de ensaio para a construção de curvas de concentração-resposta, e isto é particularmente complicado quando distribui amostras de péptidos. Possíveis erros de preparação diluição em série ponta baseada foram previamente descritos ^1,4,5. Peptídeos será adsorvido pelas plasticware, resultando em estimativas de potência não confiáveis. perda de peptídeo pode ser minimizado através de tele inclusão de albumina de soro bovino (BSA) em tampões e a utilização de utensílios de plástico siliconizado, ainda de ligação da proteína permanece imprevisível. Em particular, a variação na ligação de GLP-1 para recipientes experimentais foi descrito ^6. Há uma complicação adicional em que os agentes de estabilização utilizados na plasticware laboratório podem contaminar a partir de dicas e placas de microtitulação em buffers de ensaio aquosas e interferir com a função da proteína ^{7, 8.} Portanto, métodos para reduzir a exposição a plasticware são necessárias para aumentar a precisão das medições.

Acústicos dispensadores de líquidos concentrar um sinal acústico de alta frequência sobre a superfície de uma amostra de fluido, o que resulta na ejecção de gotículas nanolitros precisos em uma placa de ensaio adjacente ^9. O uso de ejeção acústica é padrão na indústria farmacêutica para a preparação e triagem de grandes bibliotecas de compostos sintéticos, ea tecnologia tem sido bem validada para pequenas molecules ^10. Para o nosso conhecimento, nós somos o primeiro grupo a descrever distribuição acústico para a preparação de péptidos recombinantes e sintéticos e temos relatado anteriormente a precisão melhorada em comparação com métodos baseados em ponta convencionais ^1.

Este artigo descreve a integração da preparação de peptídeos diluições em série e diretas por transferência acústica sem contato para um manuseamento placa sistema robótico totalmente automatizado. Um número de métodos que englobam transferência acústica de amostras foram descritos anteriormente ^11. Nós utilizamos um método de dois passos para preparar as concentrações de banco de intermediários e para diluir em série análogos de péptidos para a geração da curva de dose-resposta completa. Os péptidos assim preparados são incubados com células que expressam o rato alvo de GLP-1R, e usamos um ensaio disponível comercialmente homogénea de fluorescência resolvida no tempo (HTRF) para medir a acumulação de cAMP dentro destas células como uma leitura de Activ agonistas peptídicosdade. O ensaio é robusto e propícios a um formato de alto rendimento de 384 poços e rotineiramente aplicada tanto para o desenvolvimento e ensaio de rastreio de fármacos projecta ^12.