Automated acoustique de distribution pour la Dilution série de Peptide Agonistes dans Potency Détermination Assays
Summary
Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.
Abstract
Comme pour la découverte de médicaments petite molécule, le criblage pour des agonistes de peptides nécessite une dilution en série de peptides pour produire des courbes de concentration-réponse. Le criblage des peptides donne une couche supplémentaire de complexité des procédés de manipulation des échantillons à base basculantes conventionnelles exposent des peptides à une grande surface de plasticware, offrant une opportunité accrue pour la perte de peptide par adsorption. Prévenir une exposition excessive à plasticware réduit la perte de peptide via l' adhésion aux plastiques et donc minimise les inexactitudes dans la prédiction de la puissance, et nous avons décrit précédemment les avantages de la non-contact acoustique de distribution pour in vitro criblage à haut débit d'agonistes peptidiques 1. Ici, nous discutons une solution d'automatisation totalement intégré sans contact acoustique de préparation des dilutions en série de peptides dans des plaques de microtitrage en utilisant l'exemple de criblage pour des agonistes peptidiques du glucagon-like peptide-1 du récepteur de la souris (GLP-1R). Nos méthodes permettent de haute-throughput cellulaire à base d'essais à l' écran pour les agonistes et sont facilement modulables pour soutenir l' augmentation du débit de l' échantillon, ou pour permettre l' augmentation du nombre de copies de la plaque d'essai (par exemple, pour un panel de plusieurs lignes de cellules cibles).
Introduction
GLP-1R est une cible médicamenteuse établie dans le traitement du diabète de type 2 2. L'agoniste de peptide natif pour ce récepteur, le GLP-1, a un in vivo demi-vie de 2 à 3 min 3. La liaison de GLP-1 à ses couplés à la protéine récepteur conduit cible G dans la production en aval de la deuxième cAMP messager par le couplage de la protéine G native à l'activation de l'adénylcyclase. La mesure de l'AMPc accumulé fournit un dosage solide pour contrôler l'activation du récepteur et pour cribler des actifs analogues de GLP-1 ayant des propriétés physico-chimiques préférés. Un tel essai nécessite la dilution en série d'échantillons d'essai pour construire des courbes de concentration-réponse, ce qui est particulièrement compliquée lors de la remise des échantillons peptidiques. Les erreurs potentielles de la préparation de dilution en série à base de pointe ont été décrits précédemment 1,4,5. Peptides adsorberont à plasticware, entraînant des estimations de virilité peu fiables. perte de Peptide peut être minimisé en til inclusion d'albumine de sérum bovin (BSA) dans les tampons et l'utilisation de matériel en plastique siliconée, mais la liaison protéique reste imprévisible. En particulier, la variation dans la liaison de GLP-1 à des récipients expérimentaux a été décrit 6. Il y a une autre complication en ce que des agents de stabilisation utilisés dans le laboratoire plasticware peut lixivier à partir des conseils et des plaques de microtitrage dans des tampons d'essai aqueux et interférer avec la fonction de la protéine 7, 8. Par conséquent, des méthodes pour réduire l' exposition à plasticware sont nécessaires pour augmenter la précision des mesures.
Distributeurs de liquides acoustiques concentrent un signal acoustique à haute fréquence sur la surface d'un échantillon de fluide, ce qui entraîne l'éjection de gouttelettes d'nanolitre précises dans une plaque d'essai adjacente 9. L'utilisation d'éjection acoustique est la norme dans l'industrie pharmaceutique pour la préparation et le criblage de grandes bibliothèques de composés synthétiques, et la technologie a été bien validé pour les petites molecul10 s. À notre connaissance, nous sommes le premier groupe pour décrire la distribution acoustique pour la préparation de peptides recombinants et synthétiques et nous avons précédemment rapporté la précision améliorée par rapport aux méthodes basées sur la pointe conventionnelles 1.
Cet article décrit l'intégration de la préparation des peptides dilutions en série et directes par transfert acoustique sans contact sur une manipulation plaque système robotique entièrement automatisé. Un certain nombre de méthodes englobant transfert acoustique d'échantillons ont été décrits précédemment 11. Nous utilisons un procédé en deux étapes pour préparer des concentrations de stock intermédiaire et de diluer en série analogues peptidiques pour la génération de la pleine courbe dose-réponse. Les peptides ainsi préparés sont mis en incubation avec des cellules exprimant la cible souris GLP-1R, et nous utilisons un dosage disponible dans le commerce par fluorescence à résolution temporelle homogène (HTRF) afin de mesurer l'accumulation d'AMPc à l'intérieur de ces cellules en lecture des peptides agonistes activlité. Le test est robuste et prête à un format de 384 puits à haut débit et systématiquement appliqué à la fois le développement de tests et de dépistage de drogue projets 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit l'application réussie de distribution acoustique automatisé pour diluer en série des échantillons de peptides sur une plage de concentration de 3 x 10 6 nécessitant moins de 1 ul de l' échantillon. Le principal avantage de cette méthode est d'augmenter la qualité des données en minimisant peptide adsorption à plasticware via une exposition réduite des échantillons à des récipients expérimentaux et plasticware (tels que des pointes de pipette) qui sont normalemen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
None.
Materials
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Prepared as a 0.5 M stock in DMSO |
| GLP-1 (7-36) amide | Bachem | H-6795 | Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100X reference control' |
| Test peptides | Produced in-house at MedImmune | Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate | |
| 100X peptide stock | Produced in-house at MedImmune | Test peptide diluted into assay buffer to 100X final required concentration | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Cedex XS Cell Analyzer | Innovatis | ||
| Corning 384 well plates, low volume | Sigma-Aldrich | 4514 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate | Labcyte Inc. | P-05525 | |
| Echo Qualified Reservoir | Labcyte Inc. | ER-0055 | |
| Echo 550 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl | |
| Echo 525 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 25 nl | |
| ACell Benchtop Automation | HighRes Biosolutions | MC522 | |
| Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics | HighRes Biosolutions | ||
| MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermFisher Scientific | 5840300 | Referred to as 'bulk reagent dispenser' |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEJ | |
| EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer |
References
- Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow. J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).
- Campbell, J. E., Drucker, D. J. Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action. Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).
- Hui, H., Farilla, L., Merkel, P., Perfetti, R. The short half-life of glucagon-like peptide-1 in plasma does not reflect its long-lasting beneficial effects. Eur.J.Endocrinol. 146 (6), 863-869 (2002).
- Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, contact-free volume transfers minimize compound loss in dose-response experiments. J.Biomol.Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
- Ekins, S., Olechno, J., Williams, A. J. Dispensing Processes Impact Apparent Biological Activity as Determined by Computational and Statistical Analyses. PLoS ONE. 8 (5), 62325 (2013).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Tache, Y., Reeve, J. R. The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal.Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
- McDonald, G. R., et al. Bioactive Contaminants Leach from Disposable Laboratory Plasticware. Science. 322 (5903), 917 (2008).
- Belaiche, C., Holt, A., Saada, A. Nonylphenol ethoxylate plastic additives inhibit mitochondrial respiratory chain complex I. Clin Chem. 55 (10), 1883-1884 (2009).
- Sackmann, E. K., et al. Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection. J.Lab.Autom. 21 (1), 166-177 (2016).
- Grant, R. J., et al. Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology. J.Biomol.Screen. 14 (5), 452-459 (2009).
- Turmel, M., Itkin, Z., Liu, D., Nie, D. An Innovative Way to Create Assay Ready Plates for Concentration Response Testing Using Acoustic Technology. J.Lab.Autom. 15 (4), 297-305 (2010).
- Butler, R., et al. Use of the site-specific retargeting jump-in platform cell line to support biologic drug discovery. J.Biomol.Screen. 20 (4), 528-535 (2015).
- Panchal, S., Verma, R. J. Effect of sodium fluoride in maternal and offspring rats and its amelioration. Asian Pac.J.Reprod. 3 (1), 71-76 (2014).
- Hanson, S. M., Ekins, S., Chodera, J. D. Modeling error in experimental assays using the bootstrap principle: understanding discrepancies between assays using different dispensing technologies. J.Comput. Aided Mol.Des. 29 (12), 1073-1086 (2015).
- Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments. J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
- Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing. J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).
- Roberts, K., et al. Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays. J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).
