Автоматизированная Акустическая дозирования для серийного разведения пептидные агонисты в Potency Определение Assays
Summary
Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.
Abstract
Как и в случае небольшого обнаружения наркотиков молекулы, скрининг пептидных агонистов требует последовательного разведения пептидов для получения кривых концентрация-ответ. Скрининг пептидов обеспечивает дополнительный уровень сложности, как обычные методы обработки образцов наконечников на основе пептидов, разоблачить на большой площади поверхности из пластмассы, что обеспечивает повышенную возможность потери пептида посредством адсорбции. Предотвращение чрезмерного воздействия снижает потери из пластмассы пептида посредством присоединения к пластмассам и , таким образом , сводит к минимуму неточности в прогнозировании потенции, и ранее мы описали преимущества бесконтактной акустических раздаточного для высокопроизводительного скрининга в пробирке пептидных агонистов 1. Здесь мы обсудим полностью интегрированное решение автоматизации для бесконтактного акустической подготовки пептидных серийных разведений в микротитровальных планшетах с использованием в качестве примера для скрининга пептидных агонистов у мышей глюкагон-подобный пептид-1 рецептора (GLP-1R). Наши методы позволяют высокой-throughput клеток на основе анализов для скрининга агонистов и легко масштабируются для поддержки повышенную пропускную способность образца, или для обеспечения увеличения числа копий планшета для анализа (например, для панели более целевых клеточных линий).
Introduction
GLP-1R является признанным целевой препарат в лечении сахарного диабета 2 типа 2. Нативный пептидного агониста рецептора для этого, ГПП-1, имеет в естественных условиях полураспада 2-3 мин 3. Связывание ГПП-1 с его белком мишени приводит рецепторов G в нисходящем производства вторичного мессенджера цАМФ через нативного белка муфте G к активации аденилатциклазы. Измерение накопленного цАМФ обеспечивает надежный анализ для контроля за активацию рецептора и экран для активных GLP-1 аналоги с предпочтительными физико-химическими свойствами. Такой анализ требует серийного разведения образцов тест построить кривые зависимости ответа от концентрации, и это особенно сложным при передаче пептидных образцов. Потенциальные ошибки от зондового подготовки последовательного разбавления были описаны ранее 1,4,5. Пептиды будет адсорбироваться из пластмассы, что приводит к недостоверным потенцией оценок. Потеря Пептид может быть сведено к минимуму с помощью тон включение бычьего сывороточного альбумина (БСА) в буферах и использование силиконизированный, все же из пластмассы связывания с белками остается непредсказуемой. В частности, изменение связывания GLP-1 в экспериментальных контейнерах было описано 6. Существует еще одна сложность в том , что стабилизационные агенты , используемые в лаборатории из пластмассы могут вымываться из советов и микротитровальных пластин в водные буферы анализа и препятствуют функции белка 7, 8. Поэтому методы для уменьшения воздействия Пластик необходимы для повышения точности измерений.
Акустические жидкие распылители фокусировать звуковой сигнал высокой частоты на поверхность образца жидкости, что приводит к выбросу капельки точных nanoliter в смежную планшет для анализа 9. Использование акустического выброса является стандартом в фармацевтической промышленности для подготовки и скрининга больших синтетических библиотек соединений, а технология была хорошо подтверждена для малых moleculэс 10. Насколько нам известно, мы первая группа для описания акустического дозирования для получения рекомбинантных и синтетических пептидов , и мы уже ранее сообщали улучшенную точность по сравнению с обычными зондовых методов , основанных на 1.
В данной статье описывается интеграция получения пептидных последовательных и прямых разбавление бесконтактной передачи акустической на полностью автоматизированной обработки пластин роботизированной системы. Ряд методов , охватывающих акустический перенос образцов были описаны ранее 11. Мы используем двухступенчатый метод для подготовки промежуточных концентраций запаса и серийно разбавить пептидные аналоги для генерации полной кривой доза-реакция. Полученные пептиды инкубируют с клетками, экспрессирующими целевой мыши GLP-1R, и мы используем имеющиеся в продаже гомогенным с временным разрешением флуоресценции (HTRF) анализа для измерения накопления цАМФ внутри этих клеток в качестве считывании пептидных агонистов Activность. Анализ является надежной и поддаются высокой пропускной формате 384-луночного и обычно применяется как для анализа развития и скрининг лекарств проектов 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает успешное применение автоматизированного акустического дозирования серийно разбавить образцы пептидов в диапазоне концентраций от 3 х 10 6 , требующей меньше , чем 1 мкл образца. Основным преимуществом этого метода является то, чтобы повысить качество данны…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
None.
Materials
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Prepared as a 0.5 M stock in DMSO |
| GLP-1 (7-36) amide | Bachem | H-6795 | Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100X reference control' |
| Test peptides | Produced in-house at MedImmune | Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate | |
| 100X peptide stock | Produced in-house at MedImmune | Test peptide diluted into assay buffer to 100X final required concentration | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Cedex XS Cell Analyzer | Innovatis | ||
| Corning 384 well plates, low volume | Sigma-Aldrich | 4514 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate | Labcyte Inc. | P-05525 | |
| Echo Qualified Reservoir | Labcyte Inc. | ER-0055 | |
| Echo 550 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl | |
| Echo 525 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 25 nl | |
| ACell Benchtop Automation | HighRes Biosolutions | MC522 | |
| Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics | HighRes Biosolutions | ||
| MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermFisher Scientific | 5840300 | Referred to as 'bulk reagent dispenser' |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEJ | |
| EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer |
References
- Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow. J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).
- Campbell, J. E., Drucker, D. J. Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action. Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).
- Hui, H., Farilla, L., Merkel, P., Perfetti, R. The short half-life of glucagon-like peptide-1 in plasma does not reflect its long-lasting beneficial effects. Eur.J.Endocrinol. 146 (6), 863-869 (2002).
- Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, contact-free volume transfers minimize compound loss in dose-response experiments. J.Biomol.Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
- Ekins, S., Olechno, J., Williams, A. J. Dispensing Processes Impact Apparent Biological Activity as Determined by Computational and Statistical Analyses. PLoS ONE. 8 (5), 62325 (2013).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Tache, Y., Reeve, J. R. The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal.Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
- McDonald, G. R., et al. Bioactive Contaminants Leach from Disposable Laboratory Plasticware. Science. 322 (5903), 917 (2008).
- Belaiche, C., Holt, A., Saada, A. Nonylphenol ethoxylate plastic additives inhibit mitochondrial respiratory chain complex I. Clin Chem. 55 (10), 1883-1884 (2009).
- Sackmann, E. K., et al. Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection. J.Lab.Autom. 21 (1), 166-177 (2016).
- Grant, R. J., et al. Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology. J.Biomol.Screen. 14 (5), 452-459 (2009).
- Turmel, M., Itkin, Z., Liu, D., Nie, D. An Innovative Way to Create Assay Ready Plates for Concentration Response Testing Using Acoustic Technology. J.Lab.Autom. 15 (4), 297-305 (2010).
- Butler, R., et al. Use of the site-specific retargeting jump-in platform cell line to support biologic drug discovery. J.Biomol.Screen. 20 (4), 528-535 (2015).
- Panchal, S., Verma, R. J. Effect of sodium fluoride in maternal and offspring rats and its amelioration. Asian Pac.J.Reprod. 3 (1), 71-76 (2014).
- Hanson, S. M., Ekins, S., Chodera, J. D. Modeling error in experimental assays using the bootstrap principle: understanding discrepancies between assays using different dispensing technologies. J.Comput. Aided Mol.Des. 29 (12), 1073-1086 (2015).
- Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments. J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
- Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing. J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).
- Roberts, K., et al. Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays. J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).
