الآلي الصوتية الاستغناء عن التخفيف المسلسل من الببتيد ناهضات في الفعالية تحديد فحوصات
Summary
Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.
Abstract
كما هو الحال مع اكتشاف المخدرات جزيء صغير، وفحص لمستقبلات الببتيد يتطلب التخفيف المتسلسل من الببتيدات لإنتاج منحنيات التركيز على الاستجابة. فحص الببتيدات يتيح طبقة إضافية من التعقيد وسائل التعامل مع عينة القائم على طرف التقليدية تعرض الببتيدات إلى مساحة كبيرة من بلستيكور، وتوفير فرصة زيادة عن فقدان الببتيد عن طريق الامتصاص. منع التعرض المفرط للبلستيكور يقلل من فقدان الببتيد عبر التمسك البلاستيك وبالتالي يقلل من عدم الدقة في التنبؤ رجولية، والتي وصفناها سابقا فوائد الصوتية عدم الاتصال الاستغناء عنه في المختبر فحص عالية الإنتاجية من مستقبلات الببتيد 1. نحن هنا مناقشة حل أتمتة متكاملة لعدم الاتصال إعداد الصوتية من التخفيفات المسلسل الببتيد في صفيحة معايرة دقيقة باستخدام المثال من فحص مستقبلات الببتيد في الماوس مثل الجلوكاجون الببتيد 1 مستقبلات (GLP-1R). طرقنا تسمح للارتفاعفحوصات للكشف عن منبهات -throughput خلية المستندة وهي قابلة للتطوير لدعم زيادة الإنتاجية عينة، أو السماح لأعداد متزايدة من نسخ لوحة فحص (على سبيل المثال، لوحة من أكثر خطوط الخلايا المستهدفة) بسهولة.
Introduction
وGLP-1R هو هدف المخدرات التي أنشئت في علاج السكري من النوع 2 2. ناهض الببتيد الأصلي لهذا المستقبل، GLP-1، لديه في الجسم الحي نصف عمر من 2-3 دقيقة 3. الربط من GLP-1 إلى البروتين إلى جانب النتائج مستقبلات هدفه G في إنتاج المصب من الثاني مخيم رسول من خلال الأصلي اقتران بروتين G لتفعيل محلقة أدينيليل. قياس المخيم المتراكمة يوفر فحص قوي لمراقبة تنشيط مستقبلات وللكشف عن النشطة GLP-1 نظائرها مع الخصائص الفيزيائية المفضلة. مثل هذا الفحص يتطلب التخفيف المتسلسل للعينات اختبار لبناء منحنيات التركيز على الاستجابة، وهذا أمر معقد ولا سيما عند تسليم عينات الببتيد. وقد وصفت الأخطاء المحتملة من إعداد التخفيف المتسلسل القائم على طرف سابقا 1،4،5. والببتيدات كثف لبلستيكور، مما أدى إلى تقديرات قوة لا يمكن الاعتماد عليها. فقدان الببتيد يمكن التقليل من خلال رانه إدراج زلال المصل البقري (BSA) في مخازن واستخدام بلستيكور siliconized و، ولكن بروتين ملزمة لا يزال لا يمكن التنبؤ بها. على وجه الخصوص، وقد وصفت الاختلاف في ربط GLP-1 إلى حاويات التجريبية 6. وهناك مضاعفات أخرى في هذا كلاء الاستقرار المستخدمة في بلستيكور المختبر يمكن أن تتسرب من النصائح وصفيحة معايرة دقيقة إلى مخازن فحص المائية وتتدخل في وظيفة البروتين 7 و 8. لذلك، أساليب للحد من التعرض لبلستيكور ضرورية لزيادة دقة القياسات.
الصوتية موزعات السائلة تركز إشارة الصوتية عالية التردد على سطح عينة السائل، مما أدى إلى طرد قطرات نانولتر دقيقة إلى لوحة فحص المجاورة 9. استخدام اللفظ الصوتي القياسي في صناعة الأدوية لإعداد وفحص مكتبات كبيرة مجمع الاصطناعية، ولقد تم التحقق من صحة هذه التكنولوجيا بشكل جيد لmolecul صغيروفاق 10. على حد علمنا، نحن المجموعة الأولى لوصف الاستغناء الصوتية لإعداد الببتيدات المؤتلف والاصطناعية ولقد ذكرت سابقا تحسين دقة بالمقارنة مع الطرق التقليدية القائمة على طرف 1.
توضح هذه المقالة دمج إعداد الببتيد التخفيفات المسلسل ومباشرا من عدم الاتصال نقل الصوتية الصعود إلى التعامل مع لوحة نظام الروبوت الآلي بالكامل. وقد وصف عدد من الأساليب التي تشمل نقل الصوتية عينات سابقا 11. نحن نستخدم طريقة من خطوتين لإعداد تركيزات الأسهم المتوسطة ولتمييع متسلسل نظائرها الببتيد لتوليد منحنى الاستجابة للجرعة كاملة. يتم تحضين الببتيدات مستعدة مع الخلايا معربا عن الماوس الهدف GLP-1R، ونحن نستخدم فحص المتاحة تجاريا متجانسة مضان وقت حل (HTRF) لقياس تراكم مخيم داخل هذه الخلايا كما قراءات من أكتيف ناهض الببتيدإيتي. فحص قوي وقابلة لالإنتاجية العالية شكل 384 بشكل جيد وتطبيقها بشكل روتيني إلى كل من التنمية فحص وفحص المخدرات المشاريع 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول التطبيق الناجح لصرف الصوتية المؤتمتة لتمييع متسلسل عينات الببتيد على نطاق تركيز 3 × 10 6 تتطلب أقل من 1 ميكرولتر من العينة. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة لزيادة جودة البيانات من خلال التقليل من الببتيد الامتزاز إلى بلستيكور عبر خفض التعرض للعي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
None.
Materials
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Prepared as a 0.5 M stock in DMSO |
| GLP-1 (7-36) amide | Bachem | H-6795 | Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100X reference control' |
| Test peptides | Produced in-house at MedImmune | Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate | |
| 100X peptide stock | Produced in-house at MedImmune | Test peptide diluted into assay buffer to 100X final required concentration | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Cedex XS Cell Analyzer | Innovatis | ||
| Corning 384 well plates, low volume | Sigma-Aldrich | 4514 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate | Labcyte Inc. | P-05525 | |
| Echo Qualified Reservoir | Labcyte Inc. | ER-0055 | |
| Echo 550 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl | |
| Echo 525 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 25 nl | |
| ACell Benchtop Automation | HighRes Biosolutions | MC522 | |
| Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics | HighRes Biosolutions | ||
| MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermFisher Scientific | 5840300 | Referred to as 'bulk reagent dispenser' |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEJ | |
| EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer |
References
- Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow. J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).
- Campbell, J. E., Drucker, D. J. Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action. Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).
- Hui, H., Farilla, L., Merkel, P., Perfetti, R. The short half-life of glucagon-like peptide-1 in plasma does not reflect its long-lasting beneficial effects. Eur.J.Endocrinol. 146 (6), 863-869 (2002).
- Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, contact-free volume transfers minimize compound loss in dose-response experiments. J.Biomol.Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
- Ekins, S., Olechno, J., Williams, A. J. Dispensing Processes Impact Apparent Biological Activity as Determined by Computational and Statistical Analyses. PLoS ONE. 8 (5), 62325 (2013).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Tache, Y., Reeve, J. R. The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal.Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
- McDonald, G. R., et al. Bioactive Contaminants Leach from Disposable Laboratory Plasticware. Science. 322 (5903), 917 (2008).
- Belaiche, C., Holt, A., Saada, A. Nonylphenol ethoxylate plastic additives inhibit mitochondrial respiratory chain complex I. Clin Chem. 55 (10), 1883-1884 (2009).
- Sackmann, E. K., et al. Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection. J.Lab.Autom. 21 (1), 166-177 (2016).
- Grant, R. J., et al. Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology. J.Biomol.Screen. 14 (5), 452-459 (2009).
- Turmel, M., Itkin, Z., Liu, D., Nie, D. An Innovative Way to Create Assay Ready Plates for Concentration Response Testing Using Acoustic Technology. J.Lab.Autom. 15 (4), 297-305 (2010).
- Butler, R., et al. Use of the site-specific retargeting jump-in platform cell line to support biologic drug discovery. J.Biomol.Screen. 20 (4), 528-535 (2015).
- Panchal, S., Verma, R. J. Effect of sodium fluoride in maternal and offspring rats and its amelioration. Asian Pac.J.Reprod. 3 (1), 71-76 (2014).
- Hanson, S. M., Ekins, S., Chodera, J. D. Modeling error in experimental assays using the bootstrap principle: understanding discrepancies between assays using different dispensing technologies. J.Comput. Aided Mol.Des. 29 (12), 1073-1086 (2015).
- Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments. J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
- Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing. J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).
- Roberts, K., et al. Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays. J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).
