Geautomatiseerde Acoustic Afgifte voor de seriële verdunning van Peptide agonisten in potentie Bepaling Testen
Summary
Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.
Abstract
Zoals met kleinmoleculige geneesmiddelen, screenen op peptide agonisten vereist seriële verdunning van peptiden naar concentratie-respons curves produceren. Screening peptiden biedt een extra complexiteit conventionele tip gebaseerde steekproef behandelingsmethoden peptiden blootstellen aan een groot oppervlak van plasticware, die een verhoogde kans peptide verlies via adsorptie. Waardoor een overmatige blootstelling aan plasticware peptide vermindert verlies via hechting aan kunststoffen en dus minimaliseert onnauwkeurigheden in potentie voorspelling, en we hebben eerder beschreven voordelen van contactloze akoestische afgifte in vitro high-throughput screening van peptide agonisten 1. Hier bespreken we een volledig geïntegreerde automatiseringsoplossing voor contactloze akoestische bereiding van peptide seriële verdunningen in microtiterplaten met gebruikmaking van het voorbeeld voor het screenen op peptide agonisten bij de muis glucagon-achtige peptide-1 receptor (GLP-1R). Onze methoden zorgen voor een hoge-throughput cell-based assays voor het screenen op agonisten en zijn gemakkelijk schaalbaar naar grotere monsters worden verwerkt ondersteunen of te zorgen voor een verhoogd aantal testplaat kopieën (bijvoorbeeld voor een panel van meer doel cellijnen).
Introduction
De GLP-1R is een gevestigde drug target in de behandeling van type 2 diabetes 2. Het natieve peptide agonist voor deze receptor, GLP-1 heeft een in vivo halfwaardetijd van 2-3 minuten 3. De binding van GLP-1 zijn G-eiwit gekoppelde receptor leidt tot doel de verwerking tot de tweede boodschapper cAMP met natief G-proteïne koppeling aan de activering van adenylylcyclase. Meting van de geaccumuleerde cAMP werd een degelijke test om receptoractivering controleren en te screenen op actieve GLP-1 analoga met voorkeur fysicochemische eigenschappen. Een dergelijke bepaling vereist seriële verdunning van de monsters concentratie-respons curves construeren, en dit is bijzonder moeilijk bij de afgifte van peptide monsters. Mogelijke fouten uit-tip op basis van seriële verdunning voorbereiding zijn eerder 1,4,5 beschreven. Peptiden zullen adsorberen aan plasticware, wat resulteert in onbetrouwbare potentie schattingen. Peptide verlies kan worden geminimaliseerd dezhij opneming van runderserumalbumine (BSA) in buffers en het gebruik van silicium voorziene plasticware, maar blijft de eiwitbinding onvoorspelbaar. Met name de variatie in binding van GLP-1 experimentele containers beschreven 6. Er is een bijkomende complicatie, dat stabilisatiemiddelen gebruikt in laboratoria plasticware kunnen uitlogen van tips en microtiterplaten in waterige assay buffers en interfereren met eiwitfunctie 7, 8. Daarom methoden om blootstelling aan plasticware nodig om de nauwkeurigheid van de metingen te verbeteren.
Akoestische vloeistof dispensers richten hoogfrequente akoestische signaal op het oppervlak van een vloeistofmonster, waardoor het uitstoten van precieze nanoliter druppeltjes in een aangrenzende testplaat 9. Het gebruik van akoestische ejectie is standaard in de farmaceutische industrie voor de voorbereiding en screening van grote synthetische verbinding bibliotheken, en de technologie is goed gevalideerd voor kleine molecules 10. Voor zover wij weten, zijn wij de eerste groep van akoestische afgifte beschrijven de bereiding van recombinant en synthetische peptiden en we hebben eerder gemeld de verbeterde nauwkeurigheid in vergelijking met conventionele tip gebaseerde methoden 1.
Dit artikel beschrijft de integratie van de voorbereiding van de peptide seriële en directe verdunningen van non-contact akoestische overgang naar een volledig geautomatiseerde plaat omgaan met robotica-systeem. Een aantal werkwijzen omvattende akoestische monsteroverdracht zijn eerder 11 beschreven. We gebruiken een tweestapswerkwijze tussenliggende stock concentraties bereiden en serieel verdund peptide analogen voor de vorming van de volledige dosis-responscurve. De bereide peptiden worden geïncubeerd met cellen die het doelwit muis GLP-1R, en we gebruiken een commercieel verkrijgbare homogene-time fluorescentie (HTRF) test om cAMP ophoping binnen deze cellen te meten als een uitlezing van de peptide-agonist activteit. De test is robuust en vatbaar voor een hoge doorvoer 384 putjes en routinematig toegepast op zowel assay ontwikkeling en het screenen van geneesmiddelen 12 projecteert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft de succesvolle toepassing van geautomatiseerde akoestische afgifte aan peptide monsters serieel verdunnen over een concentratiegebied van 3 x 10 6 die minder dan 1 pl monster. Het grote voordeel van deze methode is de gegevenskwaliteit verhogen door het minimaliseren peptide adsorptie aan plasticware via verminderde blootstelling monsters experimentele containers en plasticware (zoals pipetpunten) die normaal voor reagensoverdracht en mengen vereist. Terwijl de akoestische afgifte niet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
None.
Materials
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Prepared as a 0.5 M stock in DMSO |
| GLP-1 (7-36) amide | Bachem | H-6795 | Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100X reference control' |
| Test peptides | Produced in-house at MedImmune | Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate | |
| 100X peptide stock | Produced in-house at MedImmune | Test peptide diluted into assay buffer to 100X final required concentration | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Cedex XS Cell Analyzer | Innovatis | ||
| Corning 384 well plates, low volume | Sigma-Aldrich | 4514 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate | Labcyte Inc. | P-05525 | |
| Echo Qualified Reservoir | Labcyte Inc. | ER-0055 | |
| Echo 550 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl | |
| Echo 525 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 25 nl | |
| ACell Benchtop Automation | HighRes Biosolutions | MC522 | |
| Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics | HighRes Biosolutions | ||
| MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermFisher Scientific | 5840300 | Referred to as 'bulk reagent dispenser' |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEJ | |
| EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer |
References
- Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow. J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).
- Campbell, J. E., Drucker, D. J. Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action. Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).
- Hui, H., Farilla, L., Merkel, P., Perfetti, R. The short half-life of glucagon-like peptide-1 in plasma does not reflect its long-lasting beneficial effects. Eur.J.Endocrinol. 146 (6), 863-869 (2002).
- Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, contact-free volume transfers minimize compound loss in dose-response experiments. J.Biomol.Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
- Ekins, S., Olechno, J., Williams, A. J. Dispensing Processes Impact Apparent Biological Activity as Determined by Computational and Statistical Analyses. PLoS ONE. 8 (5), 62325 (2013).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Tache, Y., Reeve, J. R. The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal.Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
- McDonald, G. R., et al. Bioactive Contaminants Leach from Disposable Laboratory Plasticware. Science. 322 (5903), 917 (2008).
- Belaiche, C., Holt, A., Saada, A. Nonylphenol ethoxylate plastic additives inhibit mitochondrial respiratory chain complex I. Clin Chem. 55 (10), 1883-1884 (2009).
- Sackmann, E. K., et al. Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection. J.Lab.Autom. 21 (1), 166-177 (2016).
- Grant, R. J., et al. Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology. J.Biomol.Screen. 14 (5), 452-459 (2009).
- Turmel, M., Itkin, Z., Liu, D., Nie, D. An Innovative Way to Create Assay Ready Plates for Concentration Response Testing Using Acoustic Technology. J.Lab.Autom. 15 (4), 297-305 (2010).
- Butler, R., et al. Use of the site-specific retargeting jump-in platform cell line to support biologic drug discovery. J.Biomol.Screen. 20 (4), 528-535 (2015).
- Panchal, S., Verma, R. J. Effect of sodium fluoride in maternal and offspring rats and its amelioration. Asian Pac.J.Reprod. 3 (1), 71-76 (2014).
- Hanson, S. M., Ekins, S., Chodera, J. D. Modeling error in experimental assays using the bootstrap principle: understanding discrepancies between assays using different dispensing technologies. J.Comput. Aided Mol.Des. 29 (12), 1073-1086 (2015).
- Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments. J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
- Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing. J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).
- Roberts, K., et al. Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays. J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).
