Automatizado de dispensación acústica para la dilución en serie del péptido Los agonistas de la potencia Ensayos de Determinación

El GLP-1R es una diana de fármaco establecido en el tratamiento de la diabetes tipo 2 ^2. El agonista de péptido nativo para este receptor, GLP-1, tiene una in vivo la vida media de 2 a 3 min ^3. La unión de GLP-1 a sus acoplados a proteínas G resultados receptor diana en la producción corriente abajo de la segunda mensajero AMPc a través de acoplamiento nativo proteína G a la activación de la adenilato ciclasa. La medición de la cAMP acumulado proporciona un sólido ensayo para controlar la activación del receptor y para la detección de activos análogos de GLP-1 con propiedades físico-químicas preferidas. un ensayo de este tipo requiere la dilución en serie de muestras de ensayo para construir las curvas de concentración-respuesta, y esto es particularmente complicada cuando se entrega muestras de péptidos. Los errores potenciales de preparación de la dilución en serie basada en la punta se han descrito anteriormente ^1,4,5. Los péptidos se adsorben a recipientes de plástico, lo que resulta en estimaciones de potencia poco fiables. pérdida de péptido puede ser minimizado a través de tque la inclusión de la albúmina de suero bovino (BSA) en tampones y el uso de recipientes de plástico siliconado, sin embargo, la proteína de unión sigue siendo impredecible. En particular, la variación en la unión de GLP-1 a recipientes experimentales se ha descrito ^6. Existe una complicación adicional en la que los agentes de estabilización utilizados en recipientes de plástico de laboratorio pueden filtrarse desde las puntas y las placas de microtitulación en tampones de ensayo acuosas e interferir con la función de la proteína ^{7, 8.} Por lo tanto, los métodos para reducir la exposición a los recipientes de plástico son necesarios para aumentar la precisión de las mediciones.

Dispensadores de líquido acústicos centran una señal acústica de alta frecuencia sobre la superficie de una muestra de fluido, dando como resultado la expulsión de gotitas de nanolitros precisas en una placa de ensayo adyacente ^9. El uso de eyección acústica es estándar en la industria farmacéutica para la preparación y selección de grandes bibliotecas de compuestos sintéticos, y la tecnología ha sido bien validado para pequeñas moleculES ^10. Hasta donde sabemos, somos el primer grupo de distribución para describir acústica para la preparación de péptidos recombinantes y sintéticos y hemos informado anteriormente de la exactitud mejorada en comparación con los métodos convencionales basados en la punta ^1.

En este artículo se describe la integración de la preparación de diluciones en serie de péptidos y directos por transferencia acústica sin contacto sobre una placa de manipulación robótica sistema totalmente automatizado. Una serie de métodos que comprenden la transferencia acústica de las muestras se han descrito anteriormente ^11. Utilizamos un método de dos etapas para preparar las concentraciones de valores intermedios y para diluir en serie análogos de péptidos para la generación de la curva dosis-respuesta completa. Los péptidos preparados se incuban con las células que expresan el ratón diana GLP-1R, y que utilizan un ensayo disponible comercialmente homogénea de fluorescencia resuelta en el tiempo (HTRF) para medir la acumulación de cAMP dentro de estas células como una lectura de activ agonistas peptídicosdad. El ensayo es robusto y es susceptible de un alto rendimiento formato de 384 pocillos y se aplica de forma rutinaria tanto para el desarrollo y ensayo de detección de drogas proyecta ^12.