Biyolojik Numune metabolik profil için Sheathless Kapiler Elektroforez-Kütle Spektrometre

NOT: metabolik profil çalışmaları için sheathless CE-MS kullanımı için burada açıklanan protokol laboratuvar kullanımı içindir. Aşağıda belirtilen prosedürler son yayınlanan iş 4,5'ten dayanmaktadır. Ileri deneysel ayrıntılar bu kağıtlar bulunabilir. Bu protokol kullanmadan önce, tüm ilgili malzeme güvenlik bilgi formlarını (MSDS) bakın. Bu protokolde belirtilen deneyler yaparken, güvenlik gözlükleri, laboratuvar önlüğü ve eldiven dahil tüm uygun laboratuar güvenlik prosedürlerini kullanın. Reaktifler Çözümleri ve Örneklerin hazırlanması 1. Arka plan elektrolit hazırlanması (BGE) Yeni BGE çözeltisi (% 10 (hac / hac) asetik asit, pH 2.2) her gün hazırlayın. 10 ml'lik bir cam şişe içine su 9.0 ml ilave edilir ve bir çeker ocak içinde, su, asetik asit, 1.0 ml. iyice bir girdap kullanarak çözüm karıştırın. Metabolit standar hazırlanmasıd karışımı su 50 ul içine 60 katyonik metabolitleri içeren 50 uM katyon standart karışımı 50 ul çözülür ve iyice çözüm karıştırmak. -80 ° C'de saklayın kullanılmadığı zaman. su 50 ul içine 30 anyonik metabolitleri içeren 50 mM anyon standart karışımı 50 ul çözülür ve iyice çözüm karıştırmak. Kullanılmadığı zaman -80 ° C 'de, aynı şekilde karışımın donma / çözülme devrelerine önlemek için parçalar halinde, bu çözüm saklayın. Not: -80 ° C'de saklandığı zaman, standart karışımları 3 ay boyunca stabildir metaboliti. Glioblastoma hücre çizgisinden ekstrelerinin hazırlanması 1 ml buz gibi soğuk% 0.9 sodyum klorür solüsyonu 21 yapışık insan U-87 mg, glioblastoma hücreleri üç kez yıkayın. Yapışık hücreler 2 ml buz soğukluğunda metanol / su çözeltisi (8/2, h / h) ilave edin ve bir lastik hücre kazıyıcı 21 uçlu kullanılarak kazıyın. </li> 2 dakika için metanol / su tüp içinde çözelti ve ultrasonicate toplayın. 16.100 x g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca metanol / su fraksiyonu (nihai oranı 8/8/2 v / v / v) ve santrifüj örneği kloroform ekleyin. metanol / su tabakayı toplayın ve vakum konsantratör kullanılarak bu fraksiyonun buharlaştırılması. sheathless CE-MS ile analiz için 50 ul su içinde kurutuldu malzeme sulandırın. Kullanılmadığı zaman -80 ° C örneği saklamayın. 2. Sheathless CE-MS Sistemini Kurmak Gözenekli uç yayıcı ile çıplak erimiş silika kartuş montajı CE enstrümanda bir gözenekli ucu yayıcı (30 mikron iç çapı x 90 cm toplam uzunluk) ile yeni bir çıplak erimiş silika kartuşu yerleştirin. % 100 metanol kullanılarak CE cihazının kontrol yazılımı ile 15 dakika boyunca 50 psi'de bir ön durulama uygulanır ve görsel olarak, sıvı capil arasından akmasını kontrolBu durulama adımında lary çıkışı. Ayrıca görsel, sıvı ileten kılcalından gelen dışarı akan olup olmadığını incelemek için BGE çözeltisi kullanılarak 5 dakika boyunca 50 psi'de karşı yönde bir durulama gerçekleştirin. herhangi bir sıvı damlası oluşumu kılcal çıkışında görülmüştür durumunda 100 psi basınçta adımı yineleyin 2.1.2. herhangi bir sıvı damlası oluşumu, bu adımı sırasında gözlenmiştir, yeni bir çıplak erimiş silika kartuşu takın. 10 dakika boyunca 50 psi'de su ile, daha sonra 10 dakika boyunca 50 psi'de 0.1 M NaOH ve ardından 10 dakika boyunca 50 psi'de, su ile ayrıştırma kılcal, yıkayın ve 10 dakika boyunca son BGE ile 50 psi. NOT: 2.1.4 kadar 2.1.1 sadece yeni bir kılcal kartuşunun kurulumu için gerekli olan adımları. ESI-MS kılcal gözenekli ucu yayıcı birleştirilmesi NOT: MS cihazı kalibre ve CE sistemine bağlı olmuştur emin olun, MS CE kılcal Bağlantıdan önce. ESI voltajı ayarlama0. nano-sprey kaynağı ile MS aleti takın. Gaz 1 gaz 2 ve arayüz ısıtıcı sıcaklığı sadece 5 psi 1500 V. Set perde ayarlanmış iyon püskürtme voltaj uygulayarak oluşur çok düşük akış hızlarında ESI olarak uygulanmadı. su tüpten erimiş silika kartuş püskürtme ucunu çıkarın ve MS cihazına bağlamak için nano-sprey kaynak adaptörü takın. CE cihazında BGE şişeleri yüksekliği püskürtücü ucu yüksekliği maç emin olun. 5 dakika boyunca 50 psi'de BGE ile durulama iletken kılcal boyunca sıvının akış kontrol edin. Bu durulama esnasında ESI püskürtücü iğne dibinde bir damla oluşumu dikkat edilmelidir adım. ileri yönde, 10 dakika boyunca 50 psi'de BGE ayırma kılcal yıkayın. Damla oluşumu, bu adımı sırasında gözenekli ucu yayıcı (püskürtücü ucu) ucunda dikkat edilmelidir. C bir mesafede MS girişinin giriş gözenekli ucu verici yerleştirinirca 2 ile 3 mm. 1 dakikalık bir rampa süresini kullanarak 30 kV gerilim uygulayın ve 65 0 ilk ESI gerilim kullanılarak metabolik profil çalışmaları için 1.000 m / z m / z aralığında MS verilerini elde başlar. NOT: elektrosprey olması gerektiği gibi kütle spektrumu sinyalinin geçersiz olmalıdır. ölçüm verilerinin devam ederken 1000 V ESI voltajı ayarlayın. sabit bir arka plan sinyali gelene kadar 200 V artımlarla ESI voltajı artış en az 15 dakika boyunca gözlenmiştir. maksimal ve en istikrarlı MS sinyalini (toplam iyon Elektroferogram) sağlayan konum görmek için x, y veya z-yönünde hareket MS girişine merkezine göre gözenekli ucu yayıcı pozisyonunu optimize edin. gözenekli ucu yayıcı pozisyonunu optimize ve optimal ESI gerilimi belirlendikten sonra, 0 V ESI gerilimini ayarlamak ve 5 dakikalık bir rampa süresini kullanarak 1 kV 30 kV CE gerilimi azaltın. MS yöntemi usin oluşturmag optimum ESI gerilim ve metabolit standartları ve biyolojik numunelerin analizi için CE cihaz üzerinde CE yöntemi. Metabolit Standartları ve Biyolojik örnekler 3. Analizi Sheathless CE-MS sisteminin performans değerlendirmesi Transfer CE şişenin içine sığar ve giriş örnek tepsisine bu şişeyi koymak boş 100 ul microvial (PCR flakon) içine anyonik metaboliti standart karışımı 20 ul. NOT: Güvenilir bir enjeksiyon için microvial gerekli minimum hacim 2 ml. Adım 2.2.9 sırasında oluşturulan MS edinimi negatif iyon modu yöntemi başlatın ve daha sonra CE araç kontrol yazılımı kullanarak CE dizisi başlar. 10 için 1.0 psi BGE enjeksiyon ile daha sonra 60 saniye boyunca 2.0 psi'de enjeksiyon, ardından 3 dakika süre ile 50 psi'de BGE ayırma kılcal durulayın (NL 20 kılcal hacminin% 3 uygun olarak) vesn. Not: Daha sonra, MS verileri elde etme tetiklenir. girişine 30 dakika boyunca 0.5 psi'lik bir basınç ile 1,0 dakikalık bir yükseliş süresi ile -30 kV bir voltaj uygulanır. Bir 30 dakika elektroforetik ayrılmasından sonra MS veri toplama durdurmak ve (elektroforetik ayırma gözenekli ucu kılcal yayıcı dayanıklılığını artırır sonra CE gerilimi kademeli düşüş) 5 dakikalık bir rampa süresi kullanarak -1 kV CE gerilimi azaltır. Örnek enjeksiyonları arasında, 3 dakika boyunca 30 psi'de su ile kılcal 0.1 M sodyum hidroksit, su ve BGE her durulama. göç süreleri ve analiz anyonik metaboliti karışımının sinyal yoğunluğu belirleyerek kaydedilen verileri analiz edin. anyonik metabolit standartları 10 ve 28 dakika arasında bölgede görünür olup olmadığını değerlendirmek. Üç yapısal olarak ilgili izomerleri, yani, D-Glukoz-1-fosfat, D-Glukoz-6-fosfat, D-fruktoz-6-fosfat olup olmadığını kontrol edinKısmen ayrılmış, yani, ilk iki tepe arasındaki çözünürlük 0.75 dolaylarında olup, son iki tepe (Şekil 1 e bakınız) 0.50 circa. NOT: 1.5 çözünürlük iki komşu doruklarına bir temel ayrılık gösterir. Tekrarlayın 3.1.1 ve katyonik metaboliti karışımı için 3.1.2 adımları. MS algılama pozitif iyon modunda şimdi ve CE gerilimi 30 kV olduğundan emin olun. göç süreleri ve analiz katyonik metaboliti karışımının sinyal yoğunluğu belirleyerek kaydedilen verileri analiz edin. katyonik metabolit standartlar 8 ve 22 dakika arasındaki bölgede görünür olup olmadığını değerlendirmek. izolösin ve lösin 15 ila 15.5 dk göç olup olmadığını kontrol edin ve çözünürlük 0.5 dolaylarında olup olmadığını belirlemek. Biyolojik numunelerin analizi Tekrarlayın 3.1.1 ve glioblastoma hücre hattının ekstresi anyonik metabolik profil için 3.1.2 adımları. NOT: Metabolik conÖrnek ön muameleden sonra elde edilen tert 20 hücre / nl circa bir hücre yoğunluğuna karşılık gelir, bu nedenle, 20 nl enjeksiyon analizi 400 hücre eşdeğerdir. . 5 MDA kütle doğruluğu kullanarak metaboliti laktik asit (m / z 89,0243) için bir çıkarılan iyon Elektroferogram oluşturun ve sinyal yoğunluğu 100.000 sayıları üzerinde olup olmadığını kontrol edin. Tekrarlayın 3.1.1 ve glioblastoma hücre hattının ekstresi katyonik metabolik profil için 3.1.2 adımları. NOT: Bir çok bilgi açısından zengin toplam iyon Elektroferogram bu modda 20 nl enjeksiyon için dikkat edilmelidir. analizleri veya kullanılmadığında sonra 15 dakika boyunca 50 psi'de, su ile yıkayın ve kılcal bir şişe içeren su ve su ihtiva eden bir tüp içinde, gözenekli bölümü (çıkış kısmı) kılcal giriş bölümünü depolamak.