Ein Protokoll zur metabolischen Profils von biologischen Proben mittels Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie eine sheathless poröse Spitze Interface-Design unter Verwendung vorgestellt.
In Metabolomics wird für die weltweite Profilierung (endogen) Metaboliten in komplexen Proben eine Vielzahl von analytischen Techniken verwendet. In diesem Beitrag wird ein Protokoll für die Analyse von anionischen und kationischen Metaboliten in biologischen Proben durch Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) präsentiert. CE ist gut geeignet für die Analyse von hochpolaren und geladenen Metaboliten als Verbindungen auf der Basis ihrer Ladung zu Grßenverhältnis getrennt sind. Eine kürzlich entwickelte sheathless Schnittstellenentwurf, dh ein poröser Spitze Schnittstelle zur Kopplung CE Elektrospray – Ionisation (ESI) MS verwendet. Diese Schnittstelle Ansatz ermöglicht die effektive Nutzung des eigen Low-Flow-Eigenschaft von CE in Verbindung mit MS, für ein breites Spektrum von polaren Metaboliten Klassen in Nanomol Nachweisgrenzen führt. Das Protokoll hier vorgestellten basiert einem nackten Fused-Silica-Kapillare mit einer porösen Spitze Emitters bei niedrigen pH-Trennbedingungen für die Analyse einer auf den Einsatzbreite Palette von Metabolitenklassen in biologischen Proben. Es wird gezeigt, dass die gleiche sheathless CE-MS-Methode kann für die Profilierung von kationischen Metaboliten verwendet werden, einschließlich Aminosäuren, Nukleoside und kleine Peptide oder anionische Metaboliten, einschließlich Zuckerphosphaten, Nukleotide und organische Säuren, indem nur die MS-Erfassungsschalt und Trennspannung Polarität. Hochinformationsreichen metabolischen Profilen in verschiedenen biologischen Proben, wie Urin, können Zerebrospinalflüssigkeit und Extrakte der Glioblastom-Zelllinie, die von diesem Protokoll in weniger als 1 h CE-MS-Analyse erhalten werden.
In der zeitgenössischen Metabolomik, High – End – analytische Trennverfahren ein breites Spektrum von Metaboliten Klassen , um einen Vertreter zu erhalten zu analysieren Auslesen des physiologischen Status eines Organismus 1. Das ultimative Ziel einer Metabolomics-Studie ist eine Antwort auf eine bestimmte biologische / klinischen Fragestellung zu erhalten. Derzeit wird die Human Metabolome Datenbank von mehr als 40.000 Einträge Metaboliten enthalten repräsentieren sowohl endogene und exogene Verbindungen (letztere mit Ursprung aus Nährstoffen, Mikrobiota, Drogen und anderen Quellen) 2. In Anbetracht der großen Vielfalt in physikalisch-chemischen Eigenschaften und Konzentrationsbereich dieser Metaboliten, mehrere Analysetechniken mit unterschiedlichen Trennmechanismen verwendet werden, in Verbindung, um so viele Metaboliten wie möglich Profil in einer bestimmten biologischen Probe. Zum Beispiel Psychogios et al. Verwendeten eine Kombination von fünf analytische Trennverfahren für metabolische profe ling von humanem Serum , was zur Detektion von mehr als 4.000 chemisch unterschiedlichen Metaboliten 3.
In diesem Papier wird die Aufmerksamkeit auf neu entwickelte CE-MS Strategien zur metabolischen Profils von biologischen Proben 4,5 bezahlt werden. In CE, spezifischer Kapillarzonenelektrophorese (CZE, normalerweise als CE bezeichnet), sind Verbindungen auf der Basis ihrer Ladung-zu-Größenverhältnis getrennt und daher diese analytische Technik ist sehr geeignet für die Analyse von polaren und geladenen Metaboliten. Der Trennmechanismus von CE ist grundsätzlich verschieden von chromatographischen basierte Techniken, wodurch eine komplementäre Sicht auf die metabolische Zusammensetzung von biologischen Proben 6-8 bereitstellt. Soga und Mitarbeiter waren die ersten , die Nützlichkeit der CE-MS für die weltweite Profilierung von Metaboliten in biologischen Proben 9,10 zu zeigen. Bis jetzt hat die Machbarkeit und Nützlichkeit der CE-MS für Metabolomik worden 11-15 weit unter Beweis gestellt.CE wird in der Regel über einen Mantel-Flüssigkeit zu MS gekoppelt Technik Schnittstelle 16,17; Jedoch aufgrund der Verdünnung des kapillaren Abstrom durch die Mantel-Flüssigkeit wird die Detektionsempfindlichkeit intrinsisch beeinträchtigt.
Vor kurzem wurde gezeigt , dass die Verwendung einer sheathless Schnittstelle signifikant die Nachweis Abdeckung von Metaboliten verbessert , die in verschiedenen biologischen Proben im Vergleich mit CE-MS 5,18,19 eine klassische Mantel-Flüssig – Grenzfläche verwendet wird . Zum Beispiel, circa 900 molekularen Eigenschaften wurden in menschlichem Urin durch sheathless CE-MS detektiert , während etwa 300 molekularen Eigenschaften mit Mantel-Flüssig – CE-MS 5 beobachtet wurden. Die sheathless Schnittstelle verwendet wurde auf einer porösen Spitze Emitter basiert, die durch Moini 20, erfunden wurde , die effektive Nutzung des eigen niedrigem Fließeigenschaft von CE in Kombination mit nano-ESI-MS ermöglicht.
Um die Verwendung von sheathless CE-MS im Bereich der Metabolomik zu stimulieren,ein Protokoll beschreibt dargestellt, wie dieser Ansatz für die Analyse von stark polaren Metaboliten in biologischen Proben verwendet werden, wie für die Analyse von Extrakten aus der Glioblastom-Zelllinie veranschaulicht. Es wird gezeigt, dass die sheathless CE-MS-Verfahren für die Profilierung von kationischen Metaboliten können auch für die Profilierung von anionischen Metaboliten genau die gleichen Kapillare und Trennungsbedingungen unter Verwendung verwendet werden, wodurch die Analysezeit reduziert und eine einzige Analyseplattform für die globale Profilierung der Bereitstellung berechnet Metaboliten. Das Protokoll beschreibt auch eine Strategie für die effektive Ausrichtung der sheathless poröser Spitze Emitter mit dem MS-Instrument.
A sheathless CE-MS-Verfahren eine poröse Spitze Emitters Verwendung wurde für die Analyse von hochpolaren und geladenen Metaboliten dargestellt. Ein einzigartiges Merkmal dieses Ansatzes ist, dass anionische oder kationische Metaboliten nur profiliert werden können, indem die MS-Detektion und CE Spannungspolarität umgeschaltet wird. Eine breite Palette von hochpolaren und geladenen Metaboliten in biologischen Proben mit einem hohen Abscheidegrad analysiert werden, die strukturell ähnlichen Metaboliten von entscheidender Bedeutung ist, und mit Nachweisgrenzen in der (niedrig) nanomolaren Bereich. Das dargestellte Protokoll konzentrierte sich auf die Verwendung von sheathless CE-MS für metabolische Profilieren von Zellextrakten, um die Brauchbarkeit des Verfahrens zur metabolischen Profils einer biologischen Probe zu veranschaulichen. Der hier beschriebene Ansatz kann auch für die metabolische Profilieren von anderen Arten von biologischen Proben verwendet werden, wie beispielsweise menschlichem Urin 5, da eine richtige Probenvorbehandlungsverfahren verwendet wird.
Die sheathless CE-MS method basiert auf einer porösen Spitze Emitters, der die Nutzung des eigen Low-Flow-Eigenschaft CE ermöglicht. In diesem Zusammenhang ist ein stabiles ESI-Signal eine Voraussetzung für eine reproduzierbare metabolischen Profils Studien. Somit ist es wichtig, dass der Sprüher Spitze richtig vor dem MS Einlass positioniert ist. In diesem Set-up ist der ESI-Prozess in erster Linie abhängig von der Art des BGE und daher ist BGE Optimierung von entscheidender Bedeutung. Die sheathless Konfiguration ist weniger vielseitig im Vergleich zu hülsen Flüssigkeit CE-MS-Systemen, wo eine Vielzahl von Mantel-flüssigen Zusammensetzungen zugesetzt werden, um die Ionisationseffizienz zu verbessern. Die sheathless ESI Sprayer Nadel muss vollständig mit leitfähigen Flüssigkeit (dh BGE – Lösung) gefüllt werden. Eine instabile ESI-Signal von einem teilweise oder vollständig verstopft Kapillare führen kann. Spülen bei hohen Drücken mit BGE kann dieses Problem lösen. Anderenfalls muss die Trennkapillare ersetzt werden. Vor der Beurteilung der analytischen Leistung, ein stabiles ESI Hintergrundsignalsollte zuerst erzeugt wird, welche von einem Tag auf den anderen konsistent ist.
Die analytische Leistungsfähigkeit des sheathless CE-MS-Methode für metabolischen Profils Studien muss geprüft werden täglich Metabolit Standardmischungen verwenden. Unter den gleichen experimentellen Bedingungen, konsistente Migrationszeiten, dh Variation unter 3% für within-Tag (n = 10) und zwischen-Tag (n = 5) 20 nl Injektion eines Metaboliten Standardmischung unter Verwendung von (12.5 uM), peak Höhen / Bereiche (Variation von weniger als 15%) und Bodenzahlen (im Bereich zwischen 60.000 und 400.000) sollte erhalten werden. Die Nachweisgrenzen im nanomolaren Bereich für die meisten Metaboliten Standards sein sollte. Nur wenn diese Kriterien erfüllt sind, ist die Methode bereit für metabolischer Profile von biologischen Proben. Wenn nicht, muss die MS Instrument abgestimmt werden und neu kalibriert oder die poröse Spitze kapillaren Emitter geändert werden muss.
Eine wirksame Spülschritt zwischen CE-MS-Analysen ist von großer Bedeutung, nicht nur umPotentialverschleppung zu verhindern, sondern auch die Trennleistung zu erhalten. Potentialverschleppung kann mit der Probe und somit durch Ersatz mit neuen BGE Fläschchen gelöst kontaminiert durch BGE Fläschchen verursacht werden. Wenn die sheathless CE-MS-Verfahren nicht verwendet wird, ist es wichtig, die Trennkapillare zu trennen und die Einlaßseite der Kapillare in Wasser zu speichern und mit der Außenseite der Schutzhülle in einem Rohr untergetauchten Wasser enthält Kapillare Lebensdauer zu verlängern.
Zusammenfassend zeigt die vorgeschlagene sheathless CE-MS-Methode ein starkes Potential für metabolische Profilierung von biologischen Proben, wenn sie gemäß den in diesem Protokoll angegeben verwendet. In diesem Stadium werden Interlabor-Vergleichsdaten auf jeden Fall erforderlich für sheathless CE-MS, um die (langfristige) Reproduzierbarkeit und Robustheit dieses Ansatzes für Metabolomik zu beurteilen. Dieses Protokoll kann eine solche Studie stimulieren. Verschiedene analytische Herausforderungen müssen noch berücksichtigt werden. Für eine optimale performance sollte der CE Strom vorzugsweise unter 5 & mgr; A gehalten werden, und in diesem Stadium die kapillaren porösen Spitze Emitter nur auf einer Länge von 91 cm vorgesehen ist, welche die Entwicklung von Hochdurchsatz-Assays beeinträchtigen kann. Außerdem wurde ein niedriger pH Trennungspuffer für anionische Metabolic Profiling verwendet, der nicht der optimalste zum Erreichen einer Basislinientrennung von strukturell verwandten Zuckerphosphaten sein. Wichtig ist auch, dass nur anionische Metaboliten analysiert werden können, die (teilweise) negativ unter den verwendeten Trennbedingungen berechnet. Der nächste Schritt ist, wie es derzeit die Brauchbarkeit der sheathless CE-MS-Methode für klinische Studien metabolischen Profils zu bewerten, eine einzige poröse Spitze kapillaren Emitter nur für die Analyse von bis zu 100 biologischen Proben verwendet werden.
Insgesamt Weiterentwicklung im sheathless CE-MS – Ansatz wird eine neue Richtung im Bereich der Metabolomics öffnen, dh zu einem tieferen Verständnis der biologischen Funktionen in sreichlich eingeschränkten Fällen.
The authors have nothing to disclose.
Dr. Rawi Ramautar would like to acknowledge the financial support of the Veni grant scheme of the Netherlands Organization of Scientific Research (NWO Veni 722.013.008).
CESI 8000 instrument | Sciex | A98089 | OptiMS adapter required to couple CESI to MS |
OptiMS Fused-Silica Cartridge, 30 μm ID x 90 cm total length | Sciex | B07367 | |
OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source | Sciex | B07363 | |
CESI vials | Sciex | B11648 | |
Micro vials | Sciex | 144709 | |
Glacial acetic acid | Sigma | A6283 | Use in fume hood |
Cationic metabolite mixture | Human Metabolome Technologies | H3304-3034 | |
Anionic metabolite mixture | Human Metabolome Technologies | H3304-1031 | |
Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv) | Sigma | 14262 | Use in fume hood |
Sodium hydroxide solution | Sigma | 72079 | 0.1 M |
U-87 MG Glioblastoma cell line | Sigma | 89081402 | |
Chloroform | Sigma | 650498 | Toxic; use in fume hood |