Sheathless شعري الكهربائي-الطيف الكتلي لالاستقلابية من التنميط العينات البيولوجية
Summary
ويرد بروتوكول لتحديد ملامح التمثيل الغذائي من العينات البيولوجية التي كتبها شعري قياس الطيف الكهربائي الشامل باستخدام sheathless التي يسهل اختراقها تصميم واجهة طرف.
Abstract
في الايض، يتم استخدام مجموعة واسعة من التقنيات التحليلية لالتنميط العالمي (الذاتية) الأيض في عينات معقدة. في هذه الورقة، ويقدم على بروتوكول لتحليل نواتج أنيوني والموجبة في العينات البيولوجية التي كتبها شعري قياس الطيف الكهربائي الشامل (CE-MS). ومناسبة تماما CE لتحليل نواتج القطبية للغاية ومشحونة كما يتم فصل المركبات على أساس نسبة الاتهام إلى حجمها. وضعت مؤخرا sheathless تفاعل تصميم، أي واجهة طرف يسهل اختراقها، ويستخدم لاقتران م إلى Electrospray التأين (ESI) MS. يسمح هذا النهج التواصل الاستخدام الفعال للممتلكات في جوهرها انخفاض تدفق من اوربا في تركيبة مع مرض التصلب العصبي المتعدد، مما أدى إلى حدود الكشف nanomolar لمجموعة واسعة من فئات الأيض القطبية. ويستند البروتوكول المقدمة هنا على توظيف عارية الشعرية تنصهر السيليكا مع باعث طرف يسهل اختراقها في ظروف فصل انخفاض الرقم الهيدروجيني لتحليل لمجموعة واسعة من الطبقات الأيض في العينات البيولوجية. وتبين أن نفس الأسلوب sheathless CE-MS يمكن استخدامها لتحديد ملامح الأيض الموجبة، بما في ذلك الأحماض الأمينية، نوكليوسدس والببتيدات الصغيرة، او نواتج الأيونية، بما في ذلك الفوسفات والسكر، والنيوكليوتيدات والأحماض العضوية، عن طريق التحول فقط الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد و الفصل قطبية الجهد. ملامح التمثيل الغذائي للغاية غنية بالمعلومات في مختلف العينات البيولوجية، مثل البول، السائل المخي الشوكي ومقتطفات من خط خلية ورم أرومي، ويمكن الحصول على هذا البروتوكول في أقل من 1 ساعة من تحليل CE-MS.
Introduction
في الايض المعاصرة، وتستخدم الراقية تقنيات الفصل التحليلي لتحليل مجموعة واسعة من الطبقات الأيض من أجل الحصول على ممثل للقراءة للخروج من الحالة الفيزيولوجية للكائن الحي 1. الهدف النهائي للدراسة الايض هو الحصول على إجابة على سؤال البيولوجي / السريرية معين. في الوقت الحاضر، وتتألف قاعدة البيانات Metabolome الإنسان أكثر من 40،000 إدخالات الأيض تمثل المركبات على حد سواء الداخلية والخارجية (للمنشأ الأخير من المواد الغذائية، والجراثيم، والمخدرات، وغيرها من المصادر) 2. ونظرا لتنوع كبير في الخصائص الفيزيائية والكيميائية ومدى تركيز هذه المركبات، متعددة التقنيات التحليلية مع آليات الفصل مختلفة وينبغي أن تستخدم جنبا إلى جنب من أجل محة العديد من نواتج الأيض ممكن في عينة بيولوجية معينة. على سبيل المثال، Psychogios آخرون استخدام مزيج من خمس تقنيات الفصل تحليلية للأستاذ التمثيل الغذائيiling من المصل البشري مما أدى إلى الكشف عن أكثر من 4000 الأيض المختلفة كيميائيا 3.
في هذه الورقة، سيتم دفع الانتباه إلى استراتيجيات CE-MS وضعت مؤخرا لتحديد ملامح التمثيل الغذائي من العينات البيولوجية 4،5. م، الكهربائي أكثر الشعرية تحديدا منطقة (تشيكيا؛ ويشار عادة باسم م)، يتم فصل المركبات على أساس نسبة الاتهام إلى حجمها، وبالتالي، فإن هذا الأسلوب التحليلية هي مناسبة للغاية لتحليل نواتج القطبية واتهم. آلية فصل CE تختلف اختلافا جوهريا عن التقنيات المعتمدة الكروماتوغرافي، وبالتالي تقديم وجهة نظر مكملة على تكوين الأيض من العينات البيولوجية 6-8. كانت سوجا وزملاء العمل الأولى التي تظهر فائدة CE-MS لالتنميط العالمي من الأيض في عينات بيولوجية 9،10. حتى الآن، وجدوى وفائدة CE-MS لالايض وقد ثبت على نطاق واسع 11-15.ويقترن CE عموما إلى MS عبر غمد السائل التواصل تقنية 16،17. ولكن نظرا لتخفيف من النفايات السائلة الشعرية التي كتبها غمد السائل، للخطر حساسية الكشف عن جوهرها.
في الآونة الأخيرة، وقد تبين أن استخدام واجهة sheathless تحسنت بشكل ملحوظ التغطية الكشف عن الأيض الموجودة في مختلف العينات البيولوجية بالمقارنة مع CE-MS استخدام الكلاسيكية واجهة غمد السائل 5،18،19. على سبيل المثال، تم الكشف عن حوالي 900 ميزات الجزيئية في البول البشري عن طريق sheathless CE-MS في حين لوحظت حوالي 300 ميزات الجزيئية مع غمد السائل CE-MS 5. واستند واجهة sheathless استخدامها على باعث طرف يسهل اختراقها، والتي اخترعها مويني 20، والسماح للاستخدام الفعال للممتلكات في جوهرها انخفاض تدفق من اوربا في تركيبة مع نانو ESI-MS.
من أجل تحفيز استخدام sheathless CE-MS في مجال الايض،ويرد بروتوكول يصف كيف أن هذا النهج يمكن استخدامها لتحليل نواتج القطبية عالية في العينات البيولوجية، كما يتضح لتحليل مقتطفات من خط خلية ورم أرومي. وتبين أن طريقة CE-MS sheathless لالتنميط الأيض الموجبة يمكن أن تستخدم أيضا لالتنميط من المركبات الأيونية باستخدام بالضبط نفس شعري والانفصال الظروف، وبالتالي تقليل الوقت اللازم تحليل وتوفير منصة تحليلية واحدة لالتنميط العالمي لل الأيض المشحونة. يصف البروتوكول أيضا استراتيجية لمحاذاة الفعالة للsheathless التي يسهل اختراقها باعث طرف مع أداة MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم توضيح طريقة CE-MS sheathless توظيف باعث طرف يسهل اختراقها لتحليل نواتج القطبية للغاية ومشحونة. ومن المزايا الفريدة لهذا النهج هو أن الأيض أنيوني أو الموجبة يمكن لمحة عن طريق التحول فقط MS كشف وCE الجهد القطبية. ويمكن تحليل مجموعة واسعة من المركبات القطبية العالية واتهم في العينات البيولوجية مع كفاءة فصل عالية، وهو أمر حاسم بالنسبة الأيض مماثلة من الناحية الهيكلية، ومع حدود الكشف في (منخفض) مجموعة nanomolar. ركز بروتوكول المعروضة على استخدام sheathless CE-MS لتحديد ملامح التمثيل الغذائي للخلية مقتطفات من أجل تجسد فائدة من طريقة لتحديد ملامح التمثيل الغذائي لعينة بيولوجية. ويمكن أيضا أن النهج الموصوف هنا أن تستخدم لتحديد ملامح التمثيل الغذائي من أنواع أخرى من العينات البيولوجية، مثل البول البشري 5، بالنظر إلى أن يستخدم إجراء نموذج المعالجة المناسبة.
وsheathless CE-MS methoويستند د على باعث طرف المسامية التي تسمح للاستخدام العقار في جوهرها انخفاض تدفق من CE. في هذا السياق، إشارة ESI المستقرة هي شرط مسبق للدراسات التنميط التمثيل الغذائي استنساخه. وبالتالي، فمن المهم أن الطرف الرش بشكل سليم أمام مدخل MS. في هذا الإعداد، عملية ESI تعتمد بشكل رئيسي على طبيعة BGE وبالتالي، BGE الأمثل أمر بالغ الأهمية. تكوين sheathless أقل تنوعا بالمقارنة مع غمد السائل أنظمة CE-MS حيث يمكن إضافة جميع أنواع التراكيب غمد سائل لتحسين كفاءة التأين. تحتاج sheathless ESI البخاخ إبرة المراد شغلها تماما مع السائل موصل (أي حل BGE). قد يؤدي إشارة ESI غير مستقرة من الشعرية الجزئي أو توصيله بشكل كامل. الشطف في الضغوط العالية مع BGE قد حل هذه المسألة. خلاف ذلك يحتاج إلى استبداله الشعرية الانفصال. قبل تقييم الأداء التحليلي، مستقر إشارة الخلفية ESIيجب أن تتولد لأول مرة وهو ما يتسق من يوم واحد إلى آخر.
أداء التحليلي للsheathless طريقة CE-MS للدراسات التنميط التمثيل الغذائي يحتاج إلى أن يتم التحقق يوميا باستخدام خليط الأيض القياسية. في ظل الظروف التجريبية نفسها، وأوقات الهجرة متسقة، أي تباين أقل من 3٪ لفي غضون يوم (ن = 10)، وبين يوم و(ن = 5) باستخدام 20 حقن نيكولا لانغ من خليط القياسية الأيض (12.5 ميكرون)، الذروة وينبغي الحصول على المرتفعات / المناطق (تباين أقل من 15٪) وأرقام لوحة (تتراوح بين 60،000 و 400،000). يجب أن تكون حدود الكشف في نطاق nanomolar لمعظم المعايير الأيض. فقط عندما يتم استيفاء هذه المعايير هو الأسلوب جاهزة لتحديد ملامح التمثيل الغذائي من العينات البيولوجية. إذا لم يكن كذلك، يحتاج أداة MS لضبطها وإعادة معايرة أو يحتاج يسهل اختراقها طرف الشعرية باعث على تغييرها.
خطوة الشطف فعالة بين CE-MS تحليلات ذات أهمية عالية، ليس فقط لمنع ترحيل محتمل ولكن أيضا للحفاظ على أداء الانفصال. قد يكون سبب ترحيل محتمل من قبل قارورة BGE الملوثة مع العينة وحلها عن طريق استبدال مع قارورة BGE الجديدة ول. عندما sheathless طريقة CE-MS لا تكون قيد الاستعمال، فإنه من المهم لقطع شعري فصل وتخزين الجانب مدخل الشعرية في الماء وخارج المغمورة مع الأكمام واقية في أنبوب يحتوي على الماء لإطالة شعري مدى الحياة.
وخلاصة القول، يبين sheathless طريقة CE-MS اقترح إمكانية قوية لتحديد ملامح التمثيل الغذائي من العينات البيولوجية عندما تستخدم وفقا للإجراءات الواردة في هذا البروتوكول. في هذه المرحلة، هناك حاجة إلى بيانات المقارنة بين المختبرات بالتأكيد لsheathless CE-MS من أجل تقييم (على المدى الطويل) استنساخ ومتانة هذا النهج لالايض. قد يحفز هذا البروتوكول مثل هذه الدراسة. التحديات التحليلية المختلفة لا تزال بحاجة إلى النظر فيها. لالأداء الإقتصادي الأداء الأمثلormance، يجب أن تحفظ CE الحالية ويفضل أقل من 5 أمبير وفي هذه المرحلة يتم توفير الشعرية بواعث طرف مسامية فقط بطول 91 سم والتي قد تعوق تطوير فحوصات عالية الإنتاجية. وعلاوة على ذلك، تم استخدام منطقة عازلة فصل انخفاض الرقم الهيدروجيني لتحديد ملامح التمثيل الغذائي انيوني التي قد لا تكون الأكثر الأمثل لتحقيق الفصل الأساسي من الفوسفات والسكر المرتبطة هيكليا. ومن المهم أيضا هو أن الأيض الأيونية الوحيدة التي يمكن أن تحلل والتي (جزئيا) سالبة الشحنة وفقا للشروط الفصل المستخدمة. والخطوة التالية هي لتقييم جدوى طريقة CE-MS sheathless للدراسات التنميط الأيض السريرية كما في الوقت الراهن، واحد يسهل اختراقها طرف الشعرية باعث لا يمكن إلا أن تستخدم لتحليل ما يصل إلى 100 عينات بيولوجية.
عموما، سوف مزيد من التطوير في نهج sheathless CE-MS فتح اتجاه جديد في مجال الايض، أي نحو فهم أعمق من الوظائف البيولوجية في الصورةحالات وافرة المقيدة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Rawi Ramautar would like to acknowledge the financial support of the Veni grant scheme of the Netherlands Organization of Scientific Research (NWO Veni 722.013.008).
Materials
| CESI 8000 instrument | Sciex | A98089 | OptiMS adapter required to couple CESI to MS |
| OptiMS Fused-Silica Cartridge, 30 μm ID x 90 cm total length | Sciex | B07367 | |
| OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source | Sciex | B07363 | |
| CESI vials | Sciex | B11648 | |
| Micro vials | Sciex | 144709 | |
| Glacial acetic acid | Sigma | A6283 | Use in fume hood |
| Cationic metabolite mixture | Human Metabolome Technologies | H3304-3034 | |
| Anionic metabolite mixture | Human Metabolome Technologies | H3304-1031 | |
| Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv) | Sigma | 14262 | Use in fume hood |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | 72079 | 0.1 M |
| U-87 MG Glioblastoma cell line | Sigma | 89081402 | |
| Chloroform | Sigma | 650498 | Toxic; use in fume hood |
References
- Ramautar, R., Berger, R., van der Greef, J., Hankemeier, T. Human metabolomics: strategies to understand biology. Curr Opin Chem Biol. 17, 841-846 (2013).
- Wishart, D. S., et al. HMDB 3.0–The Human Metabolome Database in 2013. Nucleic Acids Res. 41, D801-D807 (2013).
- Psychogios, N., et al. The human serum metabolome. PLoS One. 6, e16957 (2011).
- Gulersonmez, M. C., Lock, S., Hankemeier, T., Ramautar, R. Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry for anionic metabolic profiling. Electrophoresis. 37, 1007-1014 (2016).
- Ramautar, R., Busnel, J. M., Deelder, A. M., Mayboroda, O. A. Enhancing the coverage of the urinary metabolome by sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry. Anal Chem. 84, 885-892 (2012).
- Ramautar, R., et al. Metabolic profiling of human urine by CE-MS using a positively charged capillary coating and comparison with UPLC-MS. Mol Biosyst. 7, 194-199 (2011).
- Naz, S., Garcia, A., Barbas, C. Multiplatform analytical methodology for metabolic fingerprinting of lung tissue. Anal Chem. 85, 10941-10948 (2013).
- Ibanez, C., et al. CE/LC-MS multiplatform for broad metabolomic analysis of dietary polyphenols effect on colon cancer cells proliferation. Electrophoresis. 33, 2328-2336 (2012).
- Soga, T., et al. Simultaneous determination of anionic intermediates for Bacillus subtilis metabolic pathways by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem. 74, 2233-2239 (2002).
- Soga, T., et al. Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry. J Proteome Res. 2, 488-494 (2003).
- Britz-McKibbin, P. Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry (CE-ESI-MS)-based metabolomics. Methods Mol Biol. 708, 229-246 (2011).
- Ibanez, C., et al. A new metabolomic workflow for early detection of Alzheimer’s disease. J Chromatogr A. 1302, 65-71 (2013).
- Kuehnbaum, N. L., Britz-McKibbin, P. New advances in separation science for metabolomics: resolving chemical diversity in a post-genomic era. Chem Rev. 113, 2437-2468 (2013).
- Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nat Protoc. 8, 783-799 (2013).
- Hirayama, A., Wakayama, M., Soga, T. Metabolome analysis based on capillary electrophoresis-mass spectrometry. Trac-Trend Anal Chem. 61, 215-222 (2014).
- Maxwell, E. J., Chen, D. D. Twenty years of interface development for capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry. Anal Chim Acta. 627, 25-33 (2008).
- Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry interfaces: fundamental concepts and technical developments. J Chromatogr A. 1267, 17-31 (2012).
- Hirayama, A., Tomita, M., Soga, T. Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry with a high-sensitivity porous sprayer for cationic metabolome analysis. Analyst. 137, 5026-5033 (2012).
- Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. Non-aqueous capillary electrophoresis for the analysis of acidic compounds using negative electrospray ionization mass spectrometry. J Chromatogr A. 1323, 163-173 (2014).
- Moini, M. Simplifying CE-MS operation. 2. Interfacing low-flow separation techniques to mass spectrometry using a porous tip. Anal Chem. 79, 4241-4246 (2007).
- Dettmer, K., et al. Metabolite extraction from adherently growing mammalian cells for metabolomics studies: optimization of harvesting and extraction protocols. Anal Bioanal Chem. 399, 1127-1139 (2011).
