Sheathless Eletroforese Capilar-Espectrometria de Massa para Metabolic Profiling de amostras biológicas

NOTA: O protocolo descrito aqui para o uso de sheathless CE-MS para estudos perfil metabólico é apenas para uso em laboratório. Os procedimentos descritos abaixo são baseados em 4,5 trabalho recentemente publicado. Mais detalhes experimentais podem ser encontrados nestes documentos. Antes de usar este protocolo, consulte todas as folhas de dados de segurança pertinentes (MSDS). Por favor, use todos os procedimentos de segurança laboratoriais adequados, incluindo óculos de segurança, jaleco e luvas, quando da realização dos experimentos descritos neste protocolo. 1. Preparação dos reagentes e amostras Solutions Preparação do electrólito de fundo (BGE) Prepara-se uma nova solução de BGE (10% (v / v) de ácido acético, pH 2,2) a cada dia. Adicionar 9,0 ml de água num frasco de vidro de 10 ml e adicionar 1.0 ml de ácido acético à água numa hotte. Misturar a solução, cuidadosamente, com um vórtice. Preparação de standar metabolitomistura d Dissolver 50 ul de uma mistura padrão de 50 mM cação contendo 60 metabólitos catiônicos em 50 ul de água e misturar a solução completamente. Armazenar a -80 ° C quando não estiver em uso. Dissolve-se 50 ul de uma mistura padrão contendo anião 50 uM 30 metabolitos aniónicos em 50 ul de água e misturar a solução completamente. Conserva-se a solução, em alíquotas para evitar ciclos de congelamento / descongelamento do mesmo padrão de mistura, a -80 ° C quando não estiver em uso. NOTA: O metabolito misturas padrão são estáveis ​​durante 3 meses, quando armazenado adequadamente a -80 ° C. Preparação de extractos a partir da linha celular de glioblastoma Lavam-se as células U-87 MG de glioblastoma humanas aderentes três vezes com solução de cloreto de sódio a 1 ml de gelo-frio 0,9% 21. Adicionar 2 ml de solução de metanol / água gelada (8/2, v / v) para as células aderentes e raspar usando um raspador de células de borracha com ponta 21. </li> Recolher a solução de metanol / água em um tubo e ultrasonicate durante 2 min. Adicionar clorofórmio para a fracção de metanol / água (proporção final 8/8/2, v / v / v) e centrifuga-se a amostra durante 10 min a 16100 xg e 4 ° C. Recolher a camada de metanol / água e evapora-se esta fracção com um concentrador de vácuo. Reconstituir o material seco em 50 ul de água, para análise por sheathless CE-MS. Quando não estiver em utilização armazenar a amostra a -80 ° C. 2. Configurando o CE-MS Sistema Sheathless Instalação do cartucho de sílica fundida nua com o emissor ponta porosa Coloque um novo cartucho de sílica fundida nua com um emissor de ponta porosa (comprimento 30 mm de diâmetro interno x 90 cm total) no instrumento CE. Aplicar uma lavagem para a frente a 50 psi durante 15 min com o software que controla o instrumento CE utilizando metanol a 100% e verificar visualmente se o líquido flui para fora da capiltomada lary durante esta etapa de lavagem. Além disso executar uma lavagem no sentido oposto a 50 psi durante 5 min, utilizando a solução BGE para examinar visualmente se o líquido flui para fora do capilar condutora. Repetir o passo 2.1.2, a uma pressão de 100 psi no caso de não formação da gota de líquido ter sido observada na saída do tubo capilar. Instalar um novo cartucho de sílica fundida nu se sem formação de gota de líquido foi observada durante este passo. Enxaguar o capilar de separação com água a 50 psi durante 10 min, seguido de NaOH 0,1 M a 50 psi durante 10 min, em seguida, por água a 50 psi durante 10 min e, finalmente, com BGE a 50 psi durante 10 min. NOTA: As etapas 2.1.1 2.1.4 até que só são necessários para a instalação de um cartucho novo capilar. Acoplamento do capilar porosa emissor dica para ESI-MS NOTA: antes do acoplamento do capilar para o MS CE, assegurar que o instrumento de MS foi calibrado e conectado ao sistema CE. Definir a tensão ESI para0. Montar o instrumento MS com uma fonte nanospray. Gas 1, gás 2 e temperatura do aquecedor de interface não foram aplicados como ESI em taxas de fluxo muito baixas ocorre por apenas aplicando a tensão de pulverização iónica definir a 1500 V. Set a cortina a 5 psi. Remover a ponta do pulverizador do cartucho de sílica fundida a partir do tubo de água e instalá-lo no adaptador de origem de nanospray para acoplamento com o instrumento de MS. Certifique-se de que a altura dos frascos BGE no instrumento CE coincidir com a altura da ponta do pulverizador. Entrada para o fluxo de líquido através do capilar condutora por lavagem com BGE a 50 psi durante 5 min. Durante este passo de lavagem uma formação de gotas na base da agulha pulverizador ESI deve ser observada. Lave o capilar de separação com BGE a 50 psi durante 10 min na direção de avanço. formação da gota deve ser observado na ponta do bico emissor poroso (ponta do pulverizador) durante este passo. Posicionar o emissor de ponta porosa para a entrada da entrada MS a uma distância de cIRCA 2 a 3 mm. Aplicada uma tensão de 30 kV, utilizando um tempo de rampa de 1 min e iniciar a aquisição de dados de MS na gama de m / z de 65 a 1000 m / z para estudos perfil metabólico usando primeiro uma voltagem ESI de 0. NOTA: O espectro de massa deve ser desprovido de sinal como não deve haver electropulverização. Definir a tensão ESI a 1.000 V, enquanto continuar a medição de dados. Aumentar a tensão de ESI com incrementos de 200 V até que um sinal de fundo constante é observada durante pelo menos 15 min. Optimizar a posição do emissor ponta porosa com respeito ao centro da entrada de MS, movendo-o em x, y, ou z-sentido, a fim de ver qual a posição que proporciona o sinal de máxima e MS mais estável (electroferograma iónico total). Depois de optimizar a posição do emissor de ponta porosa e determinando a tensão óptima ESI, definir a tensão ESI de 0 V e diminuir a tensão de CE de 30 kV a 1 kV, utilizando um tempo de rampa de 5 min. Crie um método usin MSg a tensão ESI óptima e um método de CE sobre o instrumento CE para a análise de padrões de metabolitos e amostras biológicas. 3. Análise do metabolito Padrões e amostras biológicas A avaliação do desempenho do sistema sheathless CE-MS Transferir 20 uL da mistura padrão metabolito aniónico num microtubo 100 ul vazio (tubo de PCR) que se encaixa dentro de um frasco CE e colocar esse frasco no tabuleiro das amostras de entrada. NOTA: O volume mínimo exigido no microtubo para uma injecção de confiança é de 2 mL. Iniciar a aquisição MS método modo de ião negativo criado durante o passo 2.2.9 e subsequentemente iniciar a sequência CE usando o software que controla o instrumento CE. Lavar a separação capilar com BGE a 50 psi durante 3 min, seguido por injecção de 2,0 psi durante 60 seg (20 nl correspondente a 3% do volume capilar) e depois por injecção BGE a 1,0 psi durante 10seg. NOTA: Posteriormente, a aquisição de dados MS é acionado. Aplicada uma tensão de -30 kV com um tempo de rampa de 1,0 min com uma pressão de 0,5 psi durante 30 min na entrada. Depois de 30 minutos de separação electroforética, pare de aquisição de dados de MS e diminuir a tensão CE para -1 kV utilizando um tempo de rampa de 5 minutos (uma diminuição gradual da tensão de EC após a separação electroforética melhora a durabilidade do emissor capilar ponta porosa). Entre as injecções de amostra, lavar o capilar com água, hidróxido de sódio 0,1 M, água e BGE cada a 30 psi durante 3 min. Analisar os dados registados mediante a determinação dos tempos de migração e a intensidade do sinal da mistura metabolito aniónico analisados. Avaliar se os padrões de metabolitos aniónicos aparecem na região entre 10 e 28 min. Verificar se três isómeros estruturalmente relacionados, isto é, D-glucose-1-fosfato, D-glicose-6-fosfato e D-frutose-6-fosfato sãoparcialmente separada, ou seja, a resolução entre os dois primeiros picos é cerca de 0,75 e dos dois últimos picos é cerca de 0,50 (ver Figura 1). NOTA: A resolução de 1.5 indica uma separação da linha de base de dois picos adjacentes. Repita os passos 3.1.1 e 3.1.2 para a mistura metabólito catiônica. Certifique-se de que a detecção MS está agora no modo de iões positivos e tensão CE é 30 kV. Analisar os dados registados mediante a determinação dos tempos de migração e a intensidade do sinal da mistura metabolito catiónico analisados. Avaliar se os padrões de metabolitos catiônicos aparecem na região entre 8 e 22 min. Verifique se isoleucina e leucina estão migrando entre 15 e 15,5 min e determinar se a resolução é de cerca de 0,5. Análise de amostras biológicas Repita os passos 3.1.1 e 3.1.2 para perfis metabólicos aniônica do extrato da linha de células de glioblastoma. NOTA: O con metabólicatenda obtida após pré-tratamento de amostra corresponde a uma densidade celular de cerca de 20 células / NL, por conseguinte, uma injecção de 20 nl é o equivalente a 400 células por análise. . Criar um electrofograma ion extraído para o ácido láctico metabolito (m / z 89,0243) usando 5 precisão em massa o MDA e verificar se a intensidade do sinal é acima de 100.000 contagens. Repita os passos 3.1.1 e 3.1.2 para perfis metabólicos catiônica do extrato da linha de células de glioblastoma. NOTA: A electrofograma total de iões altamente rico em informações devem ser observados durante uma injeção de 20 nl neste modo. Após as análises, ou quando não estiver em uso, enxaguar o capilar com água a 50 psi durante 15 min e armazenar a parte de entrada do capilar num frasco para injectáveis ​​contendo água e a secção poroso (parte de saída) num tubo também contendo água.