Sheathless capillaire elektroforese-massaspectrometrie voor metabole of Biological Samples

LET OP: Het protocol hier beschreven voor het gebruik van sheathless CE-MS voor metabool profiel studies is alleen bedoeld voor gebruik laboratorium. De hieronder beschreven procedures zijn gebaseerd op de onlangs gepubliceerde werk 4,5. Verdere experimentele details zijn te vinden in deze documenten. Voorafgaand aan het gebruik van dit protocol, overleg met alle relevante veiligheidsinformatiebladen (VIB). Gebruik alle passende veiligheidsmaatregelen laboratorium procedures, met inbegrip van een veiligheidsbril, laboratoriumjas en handschoenen, bij het uitvoeren van de experimenten die in dit protocol. 1. Bereiding van reagentia en monsters Solutions Bereiding van de achtergrondelektrolyt (BGE) Bereid een nieuwe BGE-oplossing (10% (v / v) azijnzuur, pH 2,2) per dag. Voeg 9,0 ml water in een 10 ml glazen flesje en voeg 1,0 ml azijnzuur aan het water in een zuurkast. Meng de oplossing grondig met behulp van een vortex. Bereiding van metaboliet stand mengsel Los 50 pi van een 50 pM kationen standaard mengsel dat 60 kationische metabolieten in 50 pi water en meng de oplossing grondig. Bewaar bij -80 ° C wanneer niet in gebruik. Los 50 pi van een 50 pM anion standaard mengsel dat 30 anionische metabolieten in 50 pi water en meng de oplossing grondig. Bewaar deze oplossing in aliquots voorkomen vries / ontdooi cycli van dezelfde standaard mengsel bij -80 ° C wanneer niet in gebruik. OPMERKING: De metaboliet standaard mengsels zijn stabiel gedurende 3 maanden bij correcte opslag bij -80 ° C. De bereiding van uittreksels uit het glioblastoma cellijn Was de hechtende menselijke U-87 MG glioblastoom cellen drie maal met 1 ml ijskoude 0,9% natriumchlorideoplossing 21. Voeg 2 ml ijskoude methanol / water-oplossing (, / v 8/2 v) om de hechtende cellen en schraap met een rubberen getipt cel schraper 21. </li> Verzamel de methanol / water-oplossing in een buis en ultrasonicate gedurende 2 minuten. chloroform toevoegen methanol / waterfractie (eindverhouding 8/8/2, / / ​​v v v) en centrifugeer het monster gedurende 10 min bij 16.100 xg en 4 ° C. Verzamel de methanol / water laag en verdampt deze fractie met behulp van een vacuüm concentrator. Reconstitueer de gedroogde materiaal in 50 ul water voor analyse door sheathless CE-MS. Na gebruik bewaren het monster bij -80 ° C. 2. Het instellen van de Sheathless CE-MS-systeem Installatie van de kale fused silica cartridge met de poreuze tip emitter Plaats een nieuwe kale fused silica cartridge met een poreus tip emitter (30 urn inwendige diameter x 90 cm totale lengte) in de CE-instrument. Breng een voorwaartse spoeling bij 50 psi gedurende 15 min met de software regelen van de CE instrument met 100% methanol, visueel of vloeistof stroomt uit de capillary outlet tijdens deze spoelstap. Voer ook een spoeling in tegengestelde richting 50 psi gedurende 5 minuten met de BGE oplossing visueel onderzocht of vloeistof stroomt uit de geleidende capillair. Herhaal stap 2.1.2 bij een druk van 100 psi bij geen vorming vloeistofdruppel is in de capillaire uitlaat waargenomen. Plaats een nieuwe kale fused-silica cartridge indien geen vorming vloeistofdruppel tijdens deze stap waargenomen. Spoel de scheidingscapillair met water bij 50 psi gedurende 10 min, gevolgd door 0,1 M NaOH bij 50 psi gedurende 10 min, vervolgens met water bij 50 psi gedurende 10 min en tenslotte met BGE bij 50 psi gedurende 10 min. OPMERKING: Stappen 2.1.1 tot en met 2.1.4 zijn alleen nodig voor de installatie van een nieuw capillair cartridge. Koppeling van de capillaire poreuze tip emitter aan ESI-MS OPMERKING: Vóór de CE capillaire MS koppeling, opdat de MS instrument gekalibreerd en verbonden met de CE-systeem. Stel de ESI spanning0. Plaats de MS instrument met een nanospray bron. Gas 1, 2 gas en interface-heater temperatuur werd niet toegepast als ESI tegen zeer lage debieten gebeurt door gewoon de toepassing van de ion spuiten spanning ingesteld op 1500 V. Set het gordijn bij 5 psi. Verwijder de spuit tip van het gefuseerde silica cartridge uit het water buis en installeer het in de nanospray bron adapter voor het koppelen aan de MS-instrument. Zorg ervoor dat de hoogte van de BGE flacons in de CE-instrument overeenkomt met de hoogte van de spuit tip. Controleer het debiet van vloeistof door de geleidende capillair door spoelen met BGE bij 50 psi gedurende 5 min. Gedurende deze spoelstap een druppelvorming aan de voet van de ESI spuit naald moet worden genomen. Spoel de scheidingscapillair met BGE bij 50 psi gedurende 10 min in voorwaartse richting. Druppelvorming moeten worden geobserveerd op het puntje van de poreuze tip emitter (spuit tip) tijdens deze stap. Plaats de poreuze tip emitter naar de ingang van de MS inlaat op een afstand van circa 2-3 mm. Breng een spanning van 30 kV met een stijging van 1 min, en begint MS-gegevens in de m / z bereik van 65 tot 1000 m / z voor metabool profilering studies waarbij eerst een ESI spanning van 0. LET OP: De massa spectrum nietig signaal als er geen elektrospray zou moeten zijn. Stel de ESI spanning tot 1.000 V, terwijl doorgaan meetgegevens. Verhoog de ESI spanning in stappen van 200 V totdat een constante achtergrondsignaal wordt gedurende minimaal 15 minuten. Optimaliseren van de poreuze top emitter positie ten opzichte van het midden van de inlaat MS door hem in de x, y, of z-richting, om te zien welke positie de maximale en meest stabiele MS signaal (totaal ion elektroferogram) bepaalt. Na optimalisatie van de positie van de poreuze top emitter en bepalen van de optimale ESI spanning, ingesteld ESI spanning 0 V en de spanning CE van 30 kV afnemen tot 1 kV met een aanlooptijd van 5 min. Maak een MS methode using de optimale ESI spanning en een CE methode op CE instrument voor de analyse van metaboliet normen en biologische monsters. 3. Analyse van Metabolite Standards and Biological Samples Prestatie-evaluatie van de sheathless CE-MS-systeem Overdracht 20 ul van de anionische metaboliet standaard mengsel in een lege 100 ul microvaatje (PCR flacon) die past in een CE flesje en zet dit flesje in de inlaat monster lade. LET OP: De minimale vereiste volume in het microvaatje voor een betrouwbare injectie 2 pl. Start de MS overname negatieve ionen-modus methode die tijdens stap 2.2.9 en vervolgens de CE-sequentie met behulp van de software regelen van de CE-instrument te starten. Spoel de scheidingscapillair met BGE bij 50 psi gedurende 3 min gevolgd door injectie van 2,0 psi gedurende 60 sec (20 nl overeenkomend met 3% van het capillaire volume) en vervolgens door BGE injectie bij 1,0 psi gedurende 10seconde LET OP: Vervolgens wordt MS data-acquisitie geactiveerd. Breng een spanning van -30 kV met een aanlooptijd van 1,0 min met een druk van 0,5 psi gedurende 30 min bij de inlaat. Na 30 minuten elektroforetische scheiding, stoppen MS data acquisitie en CE spanning -1 kV af met een helling van 5 min (een geleidelijke afname van de CE-spanning na de elektroforetische scheiding verbetert de duurzaamheid van de poreuze capillaire tip emitter). Tussen monster injecties Spoel de capillair met water, 0,1 M natriumhydroxide, water en BGE elk bij 30 psi gedurende 3 min. Analyseer de opgenomen data door bepaling van de migratietijden en de signaalintensiteit van de geanalyseerde anionogene metabolietmengsel. Beoordelen of de anionisch metaboliet standards in het gebied tussen 10 en 28 minuten. Controleer of drie structureel verwante isomeren, namelijk D-glucose-1-fosfaat, D-glucose-6-fosfaat en D-fructose-6-fosfaatgedeeltelijk gescheiden, dat wil zeggen, de resolutie tussen de eerste twee pieken is circa 0,75 en de laatste twee pieken is circa 0,50 (zie figuur 1). OPMERKING: Een resolutie van 1,5 wijst op een basislijn scheiding van twee aangrenzende pieken. Herhaal stap 3.1.1 en 3.1.2 voor de kationische metaboliet mengsel. Zorg ervoor dat de MS-detectie is nu in de positieve ion-modus en CE spanning 30 kV. Analyseer de opgenomen data door bepaling van de migratietijden en de signaalintensiteit van de geanalyseerde kationische metabolietmengsel. Beoordelen of de kationische metaboliet standaarden worden weergegeven in het gebied tussen de 8 en 22 minuten. Controleer of isoleucine en leucine migreren tussen de 15 en 15,5 min en bepalen of de resolutie is circa 0,5. Analyse van biologische monsters Herhaal stap 3.1.1 en 3.1.2 voor anionische metabole profilering van het extract van de glioblastoma cellijn. LET OP: De metabole content verkregen na voorbehandeling van het monster komt overeen met een celdichtheid van ongeveer 20 cellen / nl, dus een 20 nl injectie is het equivalent van 400 cellen per analyse. . Een gewonnen ion elektroferogram voor de metaboliet melkzuur (m / z 89,0243) met behulp van 5 mDa nauwkeurigheid van massa's en controleer of de signaalsterkte hoger is dan 100.000 telt. Herhaal stap 3.1.1 en 3.1.2 voor kationische metabole profilering van het extract van de glioblastoma cellijn. LET OP: Een zeer informatie-rijke totale ion elektroferogram moeten worden geobserveerd voor een 20 nl injectie in deze modus. Na de analyse of wanneer niet in gebruik, spoel het capillair met water bij 50 psi gedurende 15 min en bewaar het inlaatdeel van de capillair in een flacon met water en het poreuze deel (uitstroomgedeelte) in een buis ook water bevat.