Se presenta un protocolo para perfiles metabólicos de muestras biológicas mediante electroforesis capilar de espectrometría de masas utilizando un diseño de interfaz de punta porosa sheathless.
En la metabolómica, una amplia gama de técnicas de análisis se utiliza para el mundial de perfiles de metabolitos (endógenas) en muestras complejas. En este documento, un protocolo se presenta para el análisis de metabolitos aniónicos y catiónicos en muestras biológicas por espectrometría de capilar de electroforesis en masa (CE-MS). CE es muy adecuado para el análisis de metabolitos altamente polares y cargados como compuestos se separan sobre la base de su relación de carga a medida. Un sheathless interfaz de diseño de reciente desarrollo, es decir, una interfaz de punta porosa, se utiliza para acoplar CE para ionización por electrospray (ESI) MS. Este enfoque de interfaz permite el uso eficaz de la propiedad de flujo bajo intrínsecamente de CE en combinación con MS, lo que resulta en los límites de detección nanomolares para una amplia gama de clases de metabolitos polares. El protocolo que aquí se presenta se basa en el empleo de un capilar de sílice fundida desnudo con un emisor de punta porosa en condiciones de separación de pH bajo para el análisis de unaamplia gama de clases de metabolitos en muestras biológicas. Se demuestra que el mismo método sheathless CE-MS se puede utilizar para el perfilado de metabolitos catiónicos, incluyendo aminoácidos, nucleósidos y péptidos pequeños, o metabolitos aniónicos, incluyendo fosfatos de azúcares, nucleótidos y ácidos orgánicos, por solamente conmutar la detección de MS y polaridad de la tensión de separación. perfiles metabólicos altamente ricas en información en diferentes muestras biológicas, tales como orina, líquido cefalorraquídeo y los extractos de la línea celular de glioblastoma, se pueden obtener mediante este protocolo en menos de 1 h de análisis CE-MS.
En la metabolómica contemporáneos, técnicas de separación analítica de gama alta se utilizan para analizar una amplia gama de clases de metabolitos con el fin de obtener un representante de lectura del estado fisiológico de un organismo 1. El objetivo final de un estudio de la metabolómica es la obtención de una respuesta a una cuestión biológica / clínica dada. En la actualidad, la base de datos Metaboloma humana está compuesta por más de 40.000 entradas de metabolitos representan compuestos tanto endógenos como exógenos (estos últimos procedentes de nutrientes, la microbiota, drogas y otras fuentes) 2. Dado el enorme diversidad en las propiedades físico-químicas y rango de concentración de estos metabolitos, múltiples técnicas de análisis con diferentes mecanismos de separación deben ser utilizados en conjunto con el fin de perfil como muchos metabolitos como sea posible en una muestra biológica dada. Por ejemplo, Psychogios et al. Utilizó una combinación de técnicas de separación cinco análisis para prof metabólicaIling de suero humano que resulta en la detección de más de 4.000 químicamente diversos metabolitos 3.
En este trabajo, se prestará atención a las estrategias de CE-MS recientemente desarrolladas para el perfil metabólico de muestras biológicas 4,5. En CE, electroforesis más específicamente capilar de zona (CZE, normalmente se hace referencia como CE), los compuestos se separan sobre la base de su relación de carga con el tamaño y, por lo tanto, esta técnica analítica es muy adecuado para el análisis de metabolitos polares y cargados. El mecanismo de separación de CE es fundamentalmente diferente de las técnicas basadas en cromatográficas, proporcionando de este modo una visión complementaria sobre la composición metabólica de muestras biológicas 6-8. Soga y colaboradores fueron los primeros en demostrar la utilidad de CE-MS para el mundial de perfiles de metabolitos en muestras biológicas 9,10. Hasta ahora, la viabilidad y la utilidad de CE-MS para la metabolómica ha sido ampliamente demostrada 11-15.CE está generalmente acoplado a MS a través de una funda-líquido interfaz técnica 16,17; sin embargo, debido a la dilución del efluente capilar por la funda-líquido, la sensibilidad de detección se ve comprometida intrínsecamente.
Recientemente, se demostró que el uso de una interfaz de sheathless mejoró significativamente la cobertura de detección de metabolitos presentes en diversas muestras biológicas en comparación con CE-MS que utiliza un interfaz de vaina-líquido clásico 5,18,19. Por ejemplo, se detectaron circa 900 características moleculares en la orina humana por sheathless CE-MS mientras que se observaron aproximadamente 300 características moleculares con la envoltura-líquido CE-MS 5. La interfaz sheathless utilizado se basó en un emisor de punta porosa, que fue inventado por Moini 20, lo que permite el uso eficaz de la propiedad de flujo bajo intrínsecamente de CE en combinación con nano-ESI-MS.
Con el fin de estimular el uso de sheathless CE-MS en el campo de la metabolómica,un protocolo se presenta la descripción de cómo este enfoque se puede utilizar para el análisis de metabolitos altamente polares en muestras biológicas, como se ejemplifica para el análisis de los extractos de la línea celular de glioblastoma. Se muestra que el método de CE-MS sheathless para el perfilado de metabolitos catiónicos también se puede utilizar para el perfilado de metabolitos aniónicos usando exactamente las mismas condiciones de capilares y de separación, lo que reduce el tiempo de análisis y proporcionar una sola plataforma analítica para el perfil global de la metabolitos cargadas. El protocolo también describe una estrategia para la alineación efectiva de la sheathless emisor punta porosa con el instrumento MS.
Un método de CE-MS sheathless empleando un emisor de punta porosa se ha presentado para el análisis de metabolitos altamente polares y cargados. Una característica única de este enfoque es que los metabolitos aniónicos o catiónicos se pueden perfilar sólo por conmutación de la detección y el voltaje de polaridad CE MS. Una amplia gama de metabolitos muy polares y cargados en muestras biológicas pueden ser analizados con una alta eficiencia de separación, que es crucial para los metabolitos estructuralmente similares, y con límites de detección en el (bajo) rango nanomolar. El protocolo presentado centra en el uso de sheathless CE-MS para el perfil metabólico de los extractos celulares con el fin de ejemplificar la utilidad del método para el perfil metabólico de una muestra biológica. El método descrito aquí también se puede utilizar para el perfil metabólico de otros tipos de muestras biológicas, tales como orina humana 5, dado que se utiliza un procedimiento adecuado de la muestra de pretratamiento.
La meto sheathless MS-CEd se basa en un emisor de punta porosa que permite el uso de la propiedad de flujo bajo intrínsecamente de la CE. En este contexto, una señal estable ESI es un pre-requisito para los estudios de perfiles metabólicos reproducibles. Por lo tanto, es importante que la punta de pulverizador está correctamente colocado en frente de la entrada MS. En esta configuración, el proceso de ESI depende principalmente de la naturaleza de la BGE y por lo tanto, BGE optimización es crítica. La configuración sheathless es menos versátil en comparación con los sistemas de CE-MS vaina-líquido en el que todos los tipos de composiciones de la vaina-líquido se pueden añadir para mejorar la eficiencia de ionización. La aguja sheathless pulverizador ESI debe estar completamente lleno de líquido conductor (es decir, solución BGE). Una señal ESI inestable puede resultar de un capilar parcial o totalmente enchufado. El enjuague a altas presiones con BGE puede resolver este problema. De lo contrario el capilar de separación tiene que ser reemplazado. Antes de la evaluación del rendimiento analítico, una señal de fondo estable ESIdebe ser generada primero lo que es consistente de un día para otro.
El rendimiento analítico del método de CE-MS sheathless para estudios de perfiles metabólicos necesita ser comprobado diariamente utilizando mezclas estándar metabolito. En las mismas condiciones experimentales, los tiempos de migración consistente, es decir, la variación por debajo de 3% en el plazo de días (n = 10) y entre-día (n = 5) usando una inyección de 20 nl de una mezcla estándar de metabolito (12,5 M), pico se deben obtener alturas / áreas (variación inferior al 15%) y números de placa (que oscilan entre 60.000 y 400.000). Los límites de detección deben estar en el rango nanomolar para la mayoría de las normas de metabolitos. Sólo cuando se cumplen estos criterios es el método listo para perfiles metabólicos de las muestras biológicas. Si no, el instrumento MS necesita ser sintonizado y re-calibrado o el emisor de punta capilar porosa necesita ser cambiado.
Una etapa de aclarado eficaz entre CE-MS análisis es de gran importancia, no sólo paraevitar el arrastre potencial sino también para mantener el rendimiento de la separación. arrastre potencial puede ser causada por viales BGE contaminados con la muestra y, por tanto, que resuelve sustitución por nuevos viales de BGE. Cuando el método de CE-MS sheathless no está en uso, es importante para desconectar el capilar de separación y para almacenar el lado de entrada del capilar en el agua y el exterior sumergido con el manguito protector en un tubo que contiene el agua para prolongar la vida útil capilar.
En resumen, el método de CE-MS sheathless propuesto muestra un fuerte potencial de perfiles metabólicos de las muestras biológicas cuando se usa de acuerdo con los procedimientos indicados en el presente protocolo. En esta etapa, los datos de comparación entre laboratorios son sin duda necesarios para sheathless CE-MS con el fin de evaluar la reproducibilidad (a largo plazo) y la solidez de este enfoque para la metabolómica. Este protocolo puede estimular un estudio de este tipo. Varios retos analíticos todavía tienen que ser considerados. Por Potencia óptimaormance, la corriente CE debe mantenerse preferentemente por debajo de 5 mu y en esta etapa los capilares emisores punta porosa únicamente se proporcionan en una longitud de 91 cm que puede obstaculizar el desarrollo de ensayos de alto rendimiento. Por otra parte, se utilizó un tampón de separación de pH bajo para perfiles metabólicos aniónico que puede no ser el más óptimo para lograr una separación de línea de base de fosfatos de azúcares relacionados estructuralmente. También es importante que sólo los metabolitos aniónicos pueden ser analizados que son (parcialmente) cargado negativamente en las condiciones de separación utilizada. El siguiente paso es evaluar la utilidad del método CE-MS sheathless para los estudios clínicos de perfiles metabólicos en la actualidad, un único emisor de punta capilar porosa sólo se puede utilizar para el análisis de hasta 100 muestras biológicas.
En general, un mayor desarrollo en el enfoque sheathless CE-MS se abrirá una nueva dirección en el campo de la metabolómica, es decir, hacia una comprensión más profunda de las funciones biológicas en s-Amplias restringida casos.
The authors have nothing to disclose.
Dr. Rawi Ramautar would like to acknowledge the financial support of the Veni grant scheme of the Netherlands Organization of Scientific Research (NWO Veni 722.013.008).
CESI 8000 instrument | Sciex | A98089 | OptiMS adapter required to couple CESI to MS |
OptiMS Fused-Silica Cartridge, 30 μm ID x 90 cm total length | Sciex | B07367 | |
OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source | Sciex | B07363 | |
CESI vials | Sciex | B11648 | |
Micro vials | Sciex | 144709 | |
Glacial acetic acid | Sigma | A6283 | Use in fume hood |
Cationic metabolite mixture | Human Metabolome Technologies | H3304-3034 | |
Anionic metabolite mixture | Human Metabolome Technologies | H3304-1031 | |
Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv) | Sigma | 14262 | Use in fume hood |
Sodium hydroxide solution | Sigma | 72079 | 0.1 M |
U-87 MG Glioblastoma cell line | Sigma | 89081402 | |
Chloroform | Sigma | 650498 | Toxic; use in fume hood |