Sheathless נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית מסה עבור מטבולית Profiling של דגימות ביולוגיות

הערה: הפרוטוקול המתואר כאן לשימוש sheathless CE-MS ללימודי פרופיל מטבולי הוא לשימוש במעבדה בלבד. הנהלים המפורטים להלן מבוססים על 4,5 יצירה שפורסם לאחרונה. ניתן למצוא את פרטי ניסוי לעומק במסמכים אלה. לפני השימוש בפרוטוקול זה, להתייעץ כל גיליונות נתוני בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS). השתמש כל נהלי הבטיחות במעבדה המתאימים, לרבות משקפי מגן, חלוק מעבדה וכפפות, כאשר עורכי הניסויים שתוארו בפרוטוקול זה. 1. הכנת פתרונות ריאגנטים דוגמאות הכנת האלקטרוליט רקע (BGE) כן פתרון BGE חדש (10% (v / v) חומצה אצטית, pH 2.2) כל יום. להוסיף 9.0 מ"ל של מים לתוך בקבוקון זכוכית 10 מ"ל ולהוסיף 1.0 מ"ל של חומצה אצטית במים במנדף. מערבבים את הפתרון ביסודיות בעזרת מערבולת. הכנת המטבוליט standarתערובת ד ממיסים 50 μl של תערובת רגילה 50 מיקרומטר קטיון המכיל 60 מטבוליטים קטיוני לתוך 50 μl של מים ומערבבים הפתרון ביסודיות. חנות ב -80 מעלות צלזיוס כאשר אינו בשימוש. ממיסים 50 μl של תערובת תקן אניון 50 מיקרומטר המכיל 30 מטבוליטים anionic לתוך 50 μl של מים ומערבבים הפתרון ביסודיות. אחסן את הפתרון הזה, ב aliquots כדי למנוע מחזורי הקפאה / פשרה של אותה התערובת רגילה, ב -80 מעלות צלזיוס כאשר אינו בשימוש. הערה: המטבוליט תערובות תקן יציבות במשך 3 חודשים, כאשר הם מאוחסנים כראוי ב -80 מעלות צלזיוס. הכנת תמציות מקו תא גליובלסטומה שוטף את תאי U-87 MG גליובלסטומה אדם החסיד שלוש פעמים עם 1 מיליליטר פתרון נתרן כלורי 0.9% קרים כקרח 21. הוסף 2 מיליליטר פתרון מתנול קר כקרח / מים (8/2, V / V) על התאים החסידים ולהתרפס באמצעות גומי הטה תא מגרד 21. </li> לאסוף את הפתרון מתנול / מים בצינור ואת ultrasonicate למשך 2 דקות. הוספת כלורופורם לשבר מתנול / מים (יחס הסופי 8/8/2, נ / V / V) ו צנטריפוגות מדגם למשך 10 דקות ב 16,100 XG ו -4 מעלות צלזיוס. אסוף את שכבת מתנול / מים להתאדות חלק זה באמצעות concentrator ואקום. מחדש את החומר היבש ב 50 מי μl לניתוח על ידי sheathless CE-MS. כאשר אינו בשימוש לאחסן את המדגם ב -80 מעלות צלזיוס. 2. הגדרת מערכת Sheathless CE-MS התקנה של המחסנית התמזג-סיליקה החשוף עם פולט הקצה הנקבובי מניח מחסנית התמזג-סיליקה חשוף חדש עם פולט קצה נקבובי (30 מיקרומטר אורך כולל פנימיים בקוטר x 90 סנטימטרים) במכשיר CE. החל לשטוף קדימה ב 50 psi במשך 15 דקות עם תוכנת שליטה על מכשיר לספירה באמצעות מתנול 100% ו חזותית לבדוק אם נוזל זורם החוצה מן capilשקע Lary במהלך שלב שטיפה זו. כמו כן לבצע שטיפה בכיוון ההפוך ב 50 psi במשך 5 דקות באמצעות פתרון BGE חזותי לבחון האם הנוזל זורם החוצה מן נימי מוליך. חזור על שלב 2.1.2 בלחץ של 100 psi במקרה שאין היווצרות טיפת נוזל נצפתה במוצא הנימים. התקן מחסנית התמזג-סיליקה חשוף חדשה אם אין היווצרות טיפת נוזל נצפתה במהלך שלב זה. שוטפים את נימי ההפרדה עם מים ב 50 psi במשך 10 דקות, ואחריו 0.1 M NaOH ב 50 psi במשך 10 דקות, ולאחר מכן על ידי מים ב 50 psi במשך 10 דקות ולבסוף עם BGE ב 50 psi במשך 10 דקות. הערה: שלבים 2.1.1 עד 2.1.4 נדרשים רק עבור ההתקנה של מחסנית נימים חדשה. צימוד של פולט קצה הנימים הנקבובי כדי ESI-MS הערה: לפני צימוד נימי CE ל- MS, להבטיח כי המכשיר MS כבר מכויל ומחובר למערכת CE. הגדר את מתח ESI כדי0. התאימו את מכשיר MS עם מקור nanospray. גז 1 גז 2 ותנור חימום בטמפרטורה ממשק לא יושמו כפי ESI ברמות ספיקה נמוכה מאוד מתרחשת רק על ידי יישום מתח ספריי יון להגדיר ב 1500 V. סט הווילון 5 psi. הסר את הקצה המרסס של המחסנית-סיליקה התמזגה מצינור המים התקנת אותו מתאם מקור nanospray עבור צימוד למכשיר MS. ודא כי הגובה של בקבוקוני BGE במכשיר CE להתאים את גובה הטיפ המרסס. בדוק זרימת הנוזל דרך נימי מוליך על ידי שטיפה עם BGE ב 50 psi במשך 5 דקות. במהלך שטיפה זה צעד במערך ירידה בבסיס המחט מרסס ESI יש לשים לב. שטוף את נימי ההפרדה עם BGE ב 50 psi במשך 10 דקות לכיוון קדימה. היווצרות Drop יש לשים לב בקצה של פולט הקצה הנקבובי (טיפ מרסס) במהלך שלב זה. מקם את פולט הקצה הנקבובי לכניסה של כניסת MS ממרחק של גIRCA 2 עד 3 מ"מ. החלת מתח של 30 קילו וולט באמצעות זמן הרמפה של 1 דק 'ולהתחיל רכישת נתונים MS בטווח m / z מ -65 ל -1,000 מ' / z ללימודי פרופיל מטבולי באמצעות הראשון מתח ESI של 0. הערה: הספקטרום מונית צריך להיות ריק אות כמו שלא צריך להיות שום electrospray. הגדר את מתח ESI 1,000 V תוך להמשיך מדידת נתונים. להגביר את מתח ESI בקפיצות של 200 V עד אות רקע מתמדת הוא ציין עבור 15 דקות לפחות. מטב את עמדת פולט קצה הנקבובית ביחס במרכז כניסת MS על ידי הזזת אותו x, y, או z-הכיוון כדי לראות אילו עמדה ספק המקסימאלי שניתן אות MS היציבה ביותר (electropherogram יון הכולל). אחרי אופטימיזציה של המיקום של פולט הקצה הנקבובי וקביעת מתח ESI האופטימלי, להגדיר את מתח ESI ל -0 V ולהפחית את מתח CE מ 30 קילו עד 1 קילו וולט באמצעות זמן רמפה של 5 דק '. צור usin שיטת MSg מתח ESI אופטימלית שיטה לספירה על המכשיר CE לניתוח סטנדרטים המטבוליט דגימות ביולוגיות. 3. ניתוח של תקני המטבוליט ו דגימות ביולוגיות הערכת ביצועים של מערכת CE-MS sheathless העברת 20 μl של התערובת תקן המטבוליט anionic לתוך microvial 100 μl ריק (בקבוקון PCR) אשר נכנס לתוך בקבוקון CE ולשים בקבוקון זה במגש מדגם מפרצון. הערה: ההיקף המינימאלי הנדרש microvial עבור זריקה אמינה הוא 2 μl. הפעל את שיטת מצב יונים שלילי רכישת MS שנוצרה במהלך השלב 2.2.9 ולאחר מכן להתחיל את רצף CE באמצעות תוכנת שליטה על המכשיר לספירה. שוטף את נימי הפרדה עם BGE ב 50 psi במשך 3 דקות ואחריו הזרקה ב 2.0 psi במשך 60 שניות (20 nl מתאימים 3% מנפח הנימים) ולאחר מכן על ידי הזרקת BGE ב 1.0 psi במשך 10שניות. הערה: בהמשך, MS רכישת נתונים מופעלת. החלת מתח של -30 ק עם זמן רמפה של 1.0 דקות עם לחץ של 0.5 psi במשך 30 דקות ב המפרצון. לאחר הפרדה 30 דקות electrophoretic, לעצור רכישת נתונים MS ולהפחית את המתח CE ל -1 קילו וולט באמצעות זמן הרמפה של 5 דקות (ירידה הדרגתית של מתח CE לאחר הפירוד electrophoretic משפר את העמידות של פולט נימי טיפ נקבובי). בין זריקות מדגמות, יש לשטוף את הנימים עם מים, 0.1 M נתרן הידרוקסידי, מי BGE כל 30 psi במשך 3 דקות. נתח את הנתונים שנרשמו על ידי קביעת הפעמים הגירה ואת עוצמת האות של תערובת המטבוליט anionic המנותחת. להעריך אם אמות המידה המטבוליט anionic להופיע באיזור שבין 10 ו -28 דקות. בדוק אם שלושת האיזומרים הקשורות מבנית, כלומר, D- גלוקוז-1-פוספט, D- גלוקוז-6-פוספט ו- D-פרוקטוז-6-פוספט הםחלקית מופרד, כלומר, ההחלטה בין שני השיאים הראשונים היא בסביבות 0.75 ושל שני השיאים האחרונים היא בסביבות 0.50 (ראה איור 1). הערה: על-פי החלטה 1.5 מצביעה על פרדת בסיס של שתי פסגות סמוכות. חזור על שלבים 3.1.1 ו 3.1.2 עבור תערובת המטבוליט קטיוני. ודא כי זיהוי טרשת נפוצה היא כעת במצב יון חיובי ומתח CE הוא +30 ק. נתח את הנתונים שנרשמו על ידי קביעת הפעמים הגירה ואת עוצמת האות של תערובת המטבוליט קטיוני המנותחת. להעריך אם אמות המידה המטבוליט קטיוני להופיע באיזור שבין דקות 8 ו -22. בדוק אם isoleucine ו לאוצין הם נודדים בין 15 ל 15.5 דקות ולקבוע אם ההחלטה היא בסביבות 0.5. ניתוח של דגימות ביולוגיות חזור על שלבים 3.1.1 ו 3.1.2 עבור פרופיל מטבולי anionic של תמצית של הקו הסלולרי גליובלסטומה. הערה: con מטבוליתאוהל המתקבל לאחר טיפול מקדים מדגם מקביל צפיפות התאים של בסביבות 20 תאים / NL, ולכן, זריקה 20 NL הוא המקבילה של 400 תאים לכל ניתוח. . צור electropherogram יון חילוץ עבור חומצה לקטית המטבוליט (m / z 89.0243) באמצעות 5 דיוק המוני מד"א לבדוק אם עוצמת האות הוא מעל 100,000 ספירות. חזור על שלבים 3.1.1 ו 3.1.2 עבור פרופיל מטבולי קטיוני של תמצית של הקו הסלולרי גליובלסטומה. הערה: electropherogram יון הכולל ביותר עתיר ידע יש לשים לב עבור זריקה 20 NL במצב זה. לאחר הניתוחים או כאשר אינו בשימוש, יש לשטוף את הנימים עם מים ב 50 psi במשך 15 דקות ולאחסן חלק המפרצון של הנימים בתוך מים המכילים בקבוקון בסעיף הנקבובי (חלק לשקע) בצינור גם המכיל מים.