생물 시료의 대사 프로파일 링에 대한 쉬스 모세관 전기 영동 - 질량 분석

참고 : 신진 대사 프로파일 링 연구를위한 쉬스 CE-MS의 사용을 여기에 설명 된 프로토콜은 연구용으로 만 사용됩니다. 아래에 설명 된 절차는 최근에 출판 된 작품의 4,5을 기준으로합니다. 또한 실험적인 세부 사항은이 논문에서 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 이 프로토콜에 설명 된 실험을 수행 할 때, 보호 안경, 실험실 코트와 장갑을 포함한 모든 적절한 실험실 안전 절차를 사용하십시오. 시약 솔루션 및 예제 1. 준비 백그라운드 전해질의 제조 (BGE) 새로운 BGE 용액 (10 % (V / V) 아세트산의 pH 2.2)을 매일 준비한다. 10 mL 유리 바이알에 9.0 mL의 물을 추가하고 흄 후드에서 물에 아세트산 1.0 mL로 추가한다. 충분히 와류를 사용하여 용액을 혼합한다. 대사 standar을 제조D 혼합물 물 50 ㎕를 60 양이온 대사 물질을 함유하는 50 μM 양이온 표준 혼합물 50 μl를 잘 용해 용액을 혼합한다. -80 ° C에서 보관 사용하지 않을 때입니다. 물 50 μL에 30 음이온 대사 물질을 함유하는 50 μM 음이온 표준 혼합물 50 μl를 잘 용해 용액을 혼합한다. 사용하지 않을 때에는 -80 ° C에서, 동일한 표준 혼합물의 동결 / 해동 사이클을 방지하기 위해 분량 씩,이 용액을 저장한다. 참고 : -80 ° C에서 제대로 저장 될 때 표준 혼합물 3 개월 동안 안정되어 대사 산물. 아교 모세포종 세포주 추출물의 제조 1 ㎖의 얼음처럼 차가운 0.9 % 식염수 (21)로 접착 인간 U-87 MG 아교 모세포종 세포를 세 번 세척 하였다. 자기편 셀에 2 ml의 얼음처럼 차가운 메탄올 / 물 용액 (8/2, v / v)의 추가 및 고무 세포 스크레이퍼 (21)를 밀고 사용 쳤어요. </l난> 2 분 동안 메탄올 / 물 튜브 용액 및 초음파 처리를 수집합니다. 16,100 XG, 4 ° C에서 10 분 동안 메탄올 / 물 분획 (최종 비율 8/8/2, V / v / v)로 원심 분리기에 샘플을 클로로포름을 추가합니다. 메탄올 / 물 층을 수집하고 진공 농축기를 사용하여이 부분을 증발. 쉬스 CE-MS에 의해 분석을 위해 50 μl의 물에 건조 된 자료를 복원합니다. 때 사용 -80 ° C에서 샘플을 보관하지. 2. 쉬스 CE-MS 시스템 설정 다공성 팁 터와 베어 융합 실리카 카트리지의 설치 은 CE 기기의 다공성 팁 터 (30 μm의 내경 X 90cm 총 길이)로 새로운 베어 융합 실리카 카트리지를 놓습니다. 100 % 메탄올을 사용하여 CE 기기를 제어하는 ​​소프트웨어와 함께 15 분 동안 50 psi에서 앞으로 린스를 적용하고 시각적으로 액체가 capil로부터 유출되었는지 확인이 헹굼 단계에서 라히 콘센트. 시각적으로 액체가 모세관 도전성로부터 유출되는지 여부를 검사 할 BGE 용액을 사용하여 5 분 동안 50 psi에서 역방향의 헹굼을 수행한다. 어떠한 액적 형성 모세관 출구에서 관찰되지 않은 경우에는 100 psi의 압력에서의 단계를 반복 2.1.2. 어떤 액체 방울 형성이 단계 동안 관찰되지 않은 경우 새로운 베어 융합 실리카 카트리지를 설치합니다. 10 분 동안 50 psi에서 물에 10 분 동안 50 psi에서 0.1 M NaOH를 다음 10 분 동안 50 psi에서 물을 분리 모세관 헹구고 10 분 동안 마지막 BGE와 50 PSI. 주 : 2.1.4 2.1.1까지 단지 새로운 모세관 카트리지의 설치에 필요한 단계. ESI-MS에 모세관 다공질 팁 이미 터 결합 참고 : MS 기기 교정 및 CE 시스템에 연결되어 있는지 확인, MS에 CE 모세관을 연결하기 전에. 에 ESI 전압을 설정0의 nanospray 소스와 MS 장비를 장착한다. 가스 한 기체 (2)와 인터페이스 히터 온도는 5 psi에서 1500 V. 세트 커튼 설정 이온 분무 전압을인가하여 발생하는 매우 낮은 유속으로 ESI 적용되지 않았다. 물 관에서 융합 실리카 카트리지의 스프레이 팁을 제거하고 MS 기기에 연결하기위한의 nanospray 소스 어댑터에 설치합니다. 은 CE 기기에서 BGE 튜브의 높이가 스프레이 팁의 높이를 일치하는지 확인합니다. 5 분 동안 50 psi에서 BGE와 린스에 의해 도전 모세관을 통해 액체의 흐름을 확인합니다. 이 세정 동안 ESI 분무기 바늘의 기지에서 드롭 형성이 관찰해야 단계. 순방향으로 10 분 동안 50 psi에서 BGE와 분리 모세관 플러시. 드롭 형성은이 단계에서 다공성 팁 터 (스프레이 팁)의 끝에서 관찰해야한다. (C)의 거리에서 MS 입구의 입구 다공성 팁 이미 터를 배치IRCA 2mm 3. 1 분의 램프 시간을 이용하여 30 kV로의 전압을인가하고 65 0 먼저 ESI 전압을 이용하여 대사 프로파일 링 연구 1,000 m / z에 대한 m / z 범위에서 MS 데이터를 취득 시작한다. 참고 : 더 전기 분무가 없을 것 같이 질량 스펙트럼 신호의 무효합니다. 데이터 측정을 계속하는 동안 1000 V에 ESI 전압을 설정합니다. 일정한 배경 신호까지 200 V의 증가와 함께 ESI 전압을 증가 적어도 15 분 동안 관찰된다. 최대 가장 안정한 MS 신호 (총 이온 electropherogram)를 제공하는 위치를 참조하기 위해, X, Y 또는 Z 방향으로 이동하여 MS 입구의 중심에 대하여 다공질 팁 이미 터의 위치를 ​​최적화한다. 다공질 팁 이미 터의 위치를 ​​최적화하고 최적 ESI 전압을 결정한 후 0 V로 ESI 전압을 설정하고, 5 분의 램프 시간을 사용하여 1 kV의 30 kV로에서 CE의 전압을 감소시킨다. 석사 방법 날기 만들기g 최적 ESI 전압 및 대사 산물 표준 및 생체 시료의 분석을위한 CE 기기에 CE 방법. 대사 표준 및 생물학적 샘플 3. 분석 쉬스 CE-MS 시스템의 성능 평가 전송할 CE 유리 병에 맞는 입구 샘플 트레이에이 병을 넣어 빈 100 μL의 microvial (PCR 유리 병)에 음이온 성 대사 산물 표준 혼합물의 20 μL. 참고 : 신뢰할 수있는 주사에 대한 microvial에 필요한 최소 부피는 2 μL이다. 단계 2.2.9 중 작성된 MS의 인수 음이온 모드 방법을 시작하고 이후 CE 기기를 제어하는 ​​소프트웨어를 사용하여 CE 시퀀스를 시작합니다. 10 psi에서 1.0 BGE 주입 후 60 초에서 2.0 psi에서 주입 한 다음 3 분 동안 50 psi에서 BGE와 분리 모세관 린스 (NL 20 모세관 체적의 3 %에 해당) 및비서. 주 :이어서, MS의 데이터 획득이 트리거된다. 입구에서 30 분 동안 0.5 PSI의 압력으로 1.0 분의 램프 시간과 -30 kV로의 전압을인가한다. 30 분 전기 영동 분리 후, MS 데이터 취득을 중지하고 (전기 영동 분리 다공질 팁 모세관 터의 내구성을 향상 후 CE 전압의 점진적인 감소)을 5 분의 램프 시간을 사용 -1 kV의 세륨 전압을 감소시킨다. 샘플 주사 사이에, 3 분 동안 30 psi에서 물과 모세관, 0.1 M 수산화 나트륨, 물 및 BGE 각각 헹군다. 이주 회 분석 음이온 대사 혼합물의 신호 강도를 측정함으로써, 기록 된 데이터를 분석한다. 음이온 성 대사 산물 표준은 10, 28 분 사이의 영역에 표시할지 여부를 평가합니다. 세 개의 구조적으로 관련된 이성체, 즉, D- 글루코스 -1- 인산, D- 포도당 -6- 인산과 D- 과당 -6- 인산이 있는지 확인일부 분리, 즉 처음 두 피크 사이의 해상도는 0.75 경이고 마지막 두 피크들 (도 1 참조) 0.50 년경이다. 주 : 1.5의 해상도는 두 개의 인접한 피크의베이스 라인 분리를 나타냅니다. 반복 3.1.1 및 양이온 성 대사 산물 혼합물 3.1.2 단계를 반복합니다. MS 검출 긍정적 인 이온 모드에 있으며 CE 전압이 30 kV로 있는지 확인합니다. 이주 회 분석 양이온 대사 혼합물의 신호 강도를 측정함으로써, 기록 된 데이터를 분석한다. 양이온 성 대사 산물 표준 8과 22 분 사이의 영역에 표시할지 여부를 평가합니다. 이소류신과 루신 (15) 사이에 15.5 분을 마이그레이션 여부를 확인하고 해상도가 0.5 년경 있는지 확인. 생물학적 샘플 분석 반복 3.1.1과 아교 모세포종 세포주의 추출물의 음이온 성 대사 프로파일 3.1.2 단계를 반복합니다. 참고 : 대사 콘시료 전처리 후의 텐트 20 셀 / NL 년경의 셀 밀도에 대응하고, 따라서, 20 NL 주입 분석 당 400 세포에 상응한다. . 5 MDA 질량 정확도를 사용하여 대사 젖산 (m / z 89.0243)에 대한 추출 이온 electropherogram를 생성하고 신호 강도가 10 만 카운트 이상 여부를 확인합니다. 반복 3.1.1과 아교 모세포종 세포주의 추출물의 양이온 대사 프로파일 3.1.2 단계를 반복합니다. 참고 : 매우 풍부한 정보 전체 이온 electropherogram이 모드에서 20 NL 주사 관찰해야한다. 분석하거나 사용하지 후, 15 분 동안 50 psi에서 물과 모세관 헹구고 바이알 함유 물과 같은 물을 함유하는 튜브의 다공질 부 (배출 부)에서 모세관의 입구 부분을 저장한다.