細胞培養アプリケーションのためのヒドロゲルの光媒介形成とパターニング

ヒドロゲル形成用材料の調製ペンダント（Pep1Alloc、AF488Pep1Alloc）を合成し、標準的な固相ペプチド合成（SPPS）技術および末端基の修飾（PEG4SH）のための3つの工程手順によってチオール官能化ポリマーによるペプチド（Pep2Alloc）を架橋する。14,16あるいは、PEG4SH（M購入商業的にn個 〜20 kDaの）、Pep1Alloc、およびPep2Alloc。 ドラフト内で（1.2.1-1.2.11）の合成手順を実行します。14,17以下の2段階反応により光重合開始剤（LAP）を合成し、化学物質を取り扱う際は注意してください（保護手袋、衣服、眼鏡を着用） 。 LAPはまた、商業的に購入することができます。 オーブンで乾燥した全てのガラス製品（> 2時間、80℃）。 空の単口丸底フラスコ（100ミリリットル）に攪拌棒を追加し、セプタムでカバーしています。 リングスタンドとクランプと磁気撹拌ホットプレートの上にフラスコを固定します。 私隔壁を通して針（18 G）をnsertし、大気に開放外端を残します。不活性ガスラインに取り付けられた第2の針を挿入します。不活性ガスライン（ 例えば 、アルゴンまたは窒素）を開き、10〜15分間、フラスコをパージします。 注：システムは、連続的に反応を通じて、不活性ガス、アルゴンや窒素でパージされます。 隔膜を貫通する針と注射器を使用して、フラスコに1.5グラム（〜1.4ミリリットル）のジメチルphenylphosphonite（注意）転送します。攪拌プレート（中速）をオンにして、内容がフラスコの側面上に飛散しないように注意してください。 1.6g加える（〜1.46 ml）の2,4,6-トリメチルベンゾイルクロリド（注意）隔壁を貫通する針と注射器を用いて、ジメチルphenylphosphoniteを含有するフラスコに滴下。 光から保護し、アルゴンまたは窒素下で18時間撹拌するホイルで反応容器をカバーしています。 次の日は、、、フラスコの高さを上げるスターラー上油浴を配置します慎重に油浴中にフラスコを下げるND。磁気攪拌を維持しながら、50℃にお風呂、フラスコを加熱します。 2-ブタノン50ml中に3.05グラムの臭化リチウムを溶解します。オイルバスからフラスコを持ち上げ、簡単にフラスコに注ぐためのセプタムを取り外し、丸底フラスコに臭化リチウム溶液を添加。 、：（セプタムはまだアルゴンラインおよび通気するための針につながる針を持つことになります。注意）バック加熱した油浴にフラスコを下げ、そして反応を10分間進行させる隔膜で再びフラスコを密封します。固体沈殿物を形成します。 10分後、アルゴンオフに熱からフラスコを取り外し、混合物は、感光性開始剤が製造されているように、光から保護するために箔で覆われた4時間（休息することを可能にする。通気針場所に保管してください。 適切なフィルターペーパーを敷いたガラスフリット漏斗または漏斗に製品を注ぎます。 rに2-ブタノン50mLですすぎ、ろ液3回未反応の臭化リチウムをemove。 ドライ（最初のベンチトップにした後、真空デシケーター中）およびD 2 O中での1 H NMRにより、製品を分析1.8〜1.9（6H、s）は、2.1~2.2（3H、s）は、6.7から6.8（2H、s）は、7.3〜7.4（2H、m）は、7.4から7.5（1H、m）は、7.5で特徴的なピーク-7.7（2H、M）14,17 ヒドロゲル（ 表1）を作るために準備する必要があり、各原液（PEG4SH、Pep1Alloc、Pep2Alloc、LAP）の体積および濃度を計算するためにスプレッドシートを使用してください。すべての反応基は、重合の間に消費されるように、非パターンゲルを作成するには、その[SH] = [のAlloc]を確認してください。ゲルのフォトパターニングが計画されている場合は、Pep1Allocと後で反応のための化学量論に基づいて、ゲル形成中のチオール官能基を過剰量（ 例えば 、0.2〜5 mMの、[SH]> [のAlloc]）が挙げられます。 NOTE：ゲル（5分以内）急速な重合を確実にするために5重量％（wt％）PEG4SH超えるを含むべきです。しかし、より低い重量％の範囲アプリケーションはより低い弾性率（ 例えば 、<0.5 kPaの）とのヒドロゲルのために呼び出す場合sが探求することができます。重合がチェックされ、これらの低質量％の組成物のために応じて調整する必要があります。同様に、Pep1Alloc濃度は、チオール官能化ペプチドについての文献に報告されているように、異なるアプリケーション（ 例えば 、0.2〜5 mM）のために調整されてもよい。18-21 LAPの濃度が0.067重量％（2.2ミリモル）以下、説明したように、のように周りに推奨されますより高い濃度は、細胞生存率を減少させることができます。 表1の計算に基づいて、細胞培養用の無菌条件下でPep1Alloc、Pep2Alloc、PEG4SH、およびLAPのストック溶液を準備します。 Pep1AllocとPep2Allocために、個別のペプチド合成からPep1AllocとPep2Allocの全質量を秤量し、1％ペニシリン/ストレプトマイシン（PS）および0.5 / mlのファンギゾン（FZ）を含む滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解します。準備原液の範囲の典型的な濃度ペプチドの20-100 mg / mlです。使用するまで-20℃で軟組織のアプリケーションに関連する最終的な弾性率（ヤング率〜0.5から5キロパスカル）を有するゲル。22,23小分けとストアを達成するために、これらの株式を混ぜます。 PEG4SHのために、滅菌マイクロチューブにPEG4SHを計量し、PBS + PS + FZに溶解します。 250から430 mg / mlでから、この原液の範囲の典型的な濃度（重量20〜30％のPEG4SH）。 LAPのために、滅菌マイクロチューブにLAPを計量し、7.5mg / mlの濃度にPBS + PS + FZに溶解します。 注：PEG4SHとLAPの新鮮なソリューションを準備するには、一貫性の重合時間を確保するためにあらゆるカプセル化またはゲル実験のために推奨されます。 ヒドロゲルを形成するための滅菌シリンジヒント金型を準備します。 慎重にカミソリの刃を使用して、1ミリリットル注射器のオフ先端をカットし、その後注射器シャフトからプランジャを取り外します。 15分のANを70％エタノールで注射器シャフトやプランジャを沈めます無菌の細胞培養フード中のd場所（30分間）乾燥させます。過剰のエタノール滴がシリンジシャフトの内部に残っている場合は、それらを押し出すためにプランジャーを使用しています。 ヒドロゲルを形成するための滅菌ガラススライド金型を準備します。 ガラススライドに（2の倍数）とゴムガスケットソーク（0.254ミリメートルの厚さを、シムとして使用する2小片を、ディスクの長方形を打ち抜き、または四角枠状）70％エタノール中で15分間、および無菌細胞培養フード内の場所乾燥する。 スライド表面にゲルの上部の付着を防止するために、製造業者の指示につき付着防止コーティングを有する滅菌スライドの被覆半分（4スライドがある場合、例えば 、2スライドを、抗接着剤でコーティングされます）。これらのガラススライド金型の上面となります。 注射器またはガラススライド金型用のランプを調整します。 注：これらの実験のために、外部フィルタアダプタアセンブリ及び365nmの外部フィルタを有する水銀アークランプを使用しました。その他のランプ他者によって報告され、長波長UV光の適切な強度を生成するのに使用されてもよい。24-27 すべてのサンプルにわたって比較的均一な光強度を確保するために、液体で満たされたライトガイドの先端にコリメータレンズを取り付けます。必要に応じて、目的のサンプルをカバーするスポットサイズを達成するために、サンプル（複数可）からの光ガイドの距離を調整します。 （垂直位置にシリンジ金型を保持するために）マイクロチューブホルダーにカットシリンジ金型を置きます。サンプルが開催されるシリンジ先端の高さで放射計を持って、365 nmで10 mWの/ cm 2の光強度を達成するために、シャッター（％オープン）を調整します。後で使用するために調整した設定を記録します。 無菌の表面の上部にガラススライド金型を置きます（ 例えば 、バイオセーフティキャビネット内のピペットチップボックスの上部）。ガラススライド金型の高さで放射計検出器を持ち、10メートルの光強度を達成するために、シャッター（％オープン）を調整365nmのW / cm 2です。後で使用するために調整した設定を記録します。 2.ハイドロゲル形成と光パターン非パターン化ハイドロゲルの調製。 注：ヒドロゲルは、細胞培養の用途で使用される場合、プロトコルのこの時点で、後続のすべてのステップは、無菌のキャビネットまたはフードに無菌条件下で行うべきです。 （ 表1の例を参照）、スプレッドシートの計算によるとPEG4SH、Pep2Alloc、Pep1Alloc、LAP、およびPBS + PS + FZのストック溶液を混ぜます。溶液を混合さえも確実にするために積極的に得られたゲル前駆体溶液をピペット。 滅菌、切断された注射器の先端にゲル前駆体溶液（PEG /ペップ/ LAP / PBS）の10-20μLをピペットで注射器の先端に成形厚いヒドロゲルを準備します。注射器ごとに単一のゲルを作成し、ボリュームと注射器の直径に基づいて、厚さ約0.5〜1.5ミリメートル。 注：より大きなボリュームは探求に基づくことができます上限は、細胞培養中に/からカプセル化された細胞に光パターンおよび/または栄養素/廃棄物中にPep1Allocための拡散限界に基づいて存在する可能性が希望のゲルサイズ。 非コーティングされたガラススライドのエッジの周りにゴムパッキン（0.254-mm厚）を配置することによって、ガラススライド金型で薄いヒドロゲルを準備します。ピペット5-10μLゲル前駆体溶液は、非被覆ガラススライド上に（単一または複数5~10μlのゲルは、単一のスライド上に溶液の一つ以上のドットをピペッティングすることによって作製することができる）、および抗接着剤でコーティングされたスライドガラスを置きゲル溶液の上に（より大きいゲルは、ガラススライドのサイズまで、最終的な用途に応じて行うことができます）。安定化させるための小さなバインダークリップでガラススライドを固定します。 場所金型ランプの下で、ステップ1.7.2での測定値に基づいて、シリンジ先端金型やガラススライド金型用ゲル表面では10mW / cm 2とを達成するために、ランプ強度（ 例えば 、％シャッターオープン）を設定し、それぞれ1.7.3、。 ゲルの完全な重合を可能にするために、1〜5分間の光を適用します。内弾性率と完全に重合したヒドロゲルを製造するために、下部PEG4SH含量（5~8重量％、3~5分）でのゲルのためのより高いPEG4SHコンテンツ（8重量％以上、1分）より長いとゲルについて、より短い重合時間を使用軟組織の範囲（0.5〜5キロパスカル）。 場所は、滅菌非処理48ウェルプレートにシリンジ先端金型からゲル、および無菌皿にガラススライドを配置します。 以下に詳述するように計画された実験に基づいて、細胞培養培地または適切な緩衝液（ 例えば 、PBS + PS + FZ、エルマン反応緩衝液）で3×15分を洗い流します。 パターン化ハイドロゲルの調製。 Pep1Allocとの後の反応のための遊離チオール（0.2〜5 mm）を残して、スプレッドシートの計算によるとPEG4SH、Pep2Alloc、LAP、およびPBS + PS + FZのストック溶液を混ぜます。溶液を混合しても確実にするために積極的に前駆体溶液をピペットで。 ステップ2.1.6に2.1.2でレイアウトとして厚く、薄いヒドロゲルを準備します。 注：前の光パターンに増殖培地中でゲルを置かないでください。遊離チオールは、増殖培地中で種によって消費することができる（ 例えば 、ジスルフィドチオール含有タンパク質との形成）および追加の処理ステップのないゲルのパターニングを許可しません（ 例えば 、ジスルフィド結合の還元）。 Pep1Allocの溶液を調製する（最終濃度〜3-20 mg / mlで）および2.2ミリモルのLAP。 Pep1Alloc / LAP溶液で予め形成されたゲルを覆い、37℃で1時間インキュベートします。 過剰Pep1Alloc / LAPのソリューションを削除します。ゲルは、シリンジ先端に成形した場合には、慎重に、彼らはパターニングのための滅菌ガラススライドにインキュベートされた48ウェルプレートからゲルを転送するためにスパチュラを使用しています。 syringe-ガラススライド成形ゲルの上に直接所望のパターンを有するフォトマスクを配置します。マスクの印刷部分が最適PATTためのゲルに触れていることを確認してくださいERN忠実度（ すなわち 、マスクが右読み、ダウン乳剤側でなければなりません）。場所サンプルランプ下でスライドガラス（ステップ1.7.3）のために使用されるランプ設定で1分間照射します。 パターニング、滅菌48ウェル非組織培養処理プレートに代えシリンジ成形ゲルを、滅菌皿にガラススライドに付着されている場所スライドガラス成形ゲルました。 計画された実験に基づいて、細胞培養培地または適切な緩衝液（ 例えば 、PBS + PS + FZ、エルマン反応緩衝液）で3×15分を洗い流します。 3.可視化と光パターニングの定量光パターンヒドロゲル中に遊離チオールを検出および定量化するために、エルマンアッセイ。 以下に説明するように、エルマン反応緩衝液、システイン作業溶液、標準、およびエルマン試薬を準備します。 エルマン反応緩衝液については2.4グラムのリン酸ナトリウム二塩基性（のNa 2 HPOを溶解4）200mLのDIH 2 O（0.1 MのNa 2 HPO 4、1mMのEDTA）中に74.4 mgのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）。水酸化ナトリウム（NaOH）またはリン酸（H 3 PO 4）の溶液で7.5〜8のpHを調整します。 システイン作業溶液について、15ミリリットルの反応緩衝液（2mMのシステイン）に5.27 mgのシステインを溶解します。 システイン規格については、2、1.5、1.25、1、0.75、0.5、0.25、および0 mMのシステインの最終濃度になるように反応緩衝液中のシステイン作業溶液を希釈します。 エルマン試薬については、4 mgを1ミリリットルの反応緩衝液中のエルマン試薬を溶解させます。超音波処理は、完全にエルマン試薬を溶解します。 エルマンアッセイ（ 図2）を有するゲル中の遊離チオールの濃度を定量化します。 注：「シン」5μlのヒドロゲル、ガラススライドの間成形は、以下の手順で説明し、エルマン試薬tの迅速な拡散を可能にするために推奨されていますゲルhrough（ すなわち 、それは試薬に厚いゲルを通って拡散するのにより長い時間がかかります）。 Q.、体積膨潤率に基づいて、「薄い」5μlのゲル（VのS）の膨潤ゲルの体積を決定しますシリンジ金型を使用して、3つの20μlの「厚い」ゲルを作ります。エルマン反応緩衝液に入れゲル24時間、その後は（平衡腫れ質量、M S）を量ります。ゲルを凍結乾燥し、続いて（乾燥質量、M D）を重量を量ります。 Qによって比28膨潤体積を計算し、厚いゲルのための測定された質量を用いて、= 1 +ρ ポリマー /ρ 溶剤 （M S / M D -1）ρ ポリマー = 1.07グラム/ cm 3のPEGのため、29ρ 溶剤 = 1.0グラム/ cm 3のPBS / H 2 Oのために （ここで、5μlの「薄い」ゲルは、典型的にはUであるエルマンアッセイに使用されるゲルの理論上の乾燥質量を計算しますSED）、個々のコンポーネントPEG4SH、Pep1Alloc、およびPep2Alloc（M D = M PEG4SH + M Pep1Alloc + M Pep2Alloc）の質量を合計することによって。 M PEG4SHによって計算されるように、例えば、10重量％のPEG4SHを含む5μlのゲルは、約0.000535グラムのPEGが含まれています= 0.005センチ3×1.07グラム/ cmの3×0.10。 Pep1AllocとPep2Alloc質量はこれらの水溶液のためのρ≈は1.0g / cm 3とを想定して 、溶液中の重量％に基づいて、同様に（値のスプレッドシートを参照）を算出することができます。 注：ゲルはまた、代わりに理論的な乾燥質量を計算する乾燥し、秤量することができます。しかし、一貫して、薄い、5μlのゲルの乾燥質量を測定するために挑戦することができます。 予測乾燥質量と「厚い」ゲルから決定さQ値に基づいて、「薄い」ゲル（ステップ3.1.2.1.1での式）について予測腫れ質量M Sを計算します 。そのρ≈1.0グラム/ cmの前提としてい<sup> 3、その後、M S≈V S。定量的なエルマンアッセイを行うために、この計算されたV Sを使用してください。 注：上記の方法は、「薄い」5μlのゲルは計量のために転送することが困難であるように腫れてゲルについてV sを決めるため、お勧めします。 セクション2.2（5μlの体積）で説明したようにパターニングのための薄いヒドロゲルを形成します。具体的には、過剰の遊離チオールを有するゲルと光でゲル全体を露出させるフラッディングする明確なカバーガラスを使用してPep1Allocとこれらの試料の「パターン」の半分を行う（ 例えば 、過剰なチオールと6合計ゲル：3修正されていない非'patterned 'および3' '）パターン化。 注：このアッセイでは、「パターン化」ゲルは、フォトマスクなしで光に洪水にさらされています。この方法は、全体のゲル試料で消費遊離チオールの数を決定し、ペプチドを修飾することができる方法を効率的に遊離チオールを実証するために使用されます。この情報から、フォトマスクを用いてパターニングする間に消費遊離チオールの数は、ゲルの厚さとパターン領域（光に露光された領域）に基づいて予測することができます。 場所「パターン化」と非'patterned「ゲル4​​8ウェルプレートのウェルにし、発生する膨潤ゲルと均衡のうち、未反応種の拡散を可能にするために、エルマン反応緩衝液で3×15分をすすぎます。 V sの反応緩衝液では20μlと倍数であるように、すすぎゲルに余分なエルマン反応バッファーを追加します。予測V Sが 15μlである場合たとえば、5μlの反応バッファー（20μl）を追加し、予測されたV Sは、30μlのであれば、10μlの反応緩衝液（40μl）を追加します。 前のステップがV S +余分な反応Bを有する場合、 すなわち、（前のステップで使用される量に応じて、20μLの倍数で96ウェルプレートの（ゲルを含有しない）、個々のウェルにシステイン基準をピペット= 40μlのuffer、個々の空のウェルに各標準の40μlを添加します）。 反応バッファー（; 例えば 、20μlあるいはステップ3.1.2.5での40μlのための367.2μlのための183.6 180μlの反応緩衝液+ 3.6μlのエルマン試薬の倍数）でエルマン試薬を希釈します。 標準液およびサンプルを含むウェルに希釈されたエルマン試薬を追加します。 20μlのサンプルについて、各ウェルに183.6μlの溶液を加えます。 40μlのサンプル（またはサンプルの大きさに基づいて、それに応じてスケール）のために希釈されたエルマン試薬のダブルこの量。 溶液の色が黄色の2-ニトロ-5-チオベンゾエートジアニオン（TNBの十分な拡散を確保するために目視検査によってゲルの色と一致するまでインキュベートまたは場所で1時間30分間、シェーカー上で（室温）、またはゲルから、遊離チオールとのエルマン試薬の反応により生成されました2-）、。 サンプルおよびsから溶液100μlを取りますtandardsとは、96ウェルプレートのウェルに配置します。 プレートリーダーで405 nmの吸光度を読みます。 データを処理するために、標準曲線（ステップ3.1.1.3からのサンプル）（濃度対吸光度）をプロットし、線形関数にフィット。線形関数を使用して、「希釈ゲル」溶液（ゲル+反応バッファー）中の遊離チオールの濃度は、吸光度の読み取り値に基づいて計算することができます。最後に、アカウントに反応バッファーで「希釈」を取って、反応緩衝ないゲル中の遊離チオール濃度を決定します。 （15μlのゲルを5μlの反応緩衝液で希釈した場合、例えば 、20/15を掛けます）。 エルマン試薬（ 図3A）とphotopatternsの可視化。 1時間エルマン反応緩衝液中Pep1Allocでパターニング薄いヒドロゲルを浸します。 優しく組織とヒドロゲルのエッジの周り拭いて過剰反応バッファーを削除します。 直接ゲルの表面にピペットエルマン試薬。すぐにカラーカメラの光10倍で顕微鏡や実体顕微鏡の画像。 注：可視化パターンがゲル全体に拡散し、非パターン領域におけるチオールとの反応時にエルマン試薬の切断によって生成黄色のTNB 2-イオンとして5分以内に消費しますので、ゲルはすぐに画像化されなければなりません。非パターン領域は肉眼でかすかに黄色に見えます。優れた分解能と小さいパターン、倍率（ 例えば 、顕微鏡の使用）のために必要とされます。 蛍光ペプチド（ 図3B）とPhotopatternsの可視化。 高い解像度または3次元でパターンを可視化するために、ステップ2.2でゲルにAF488-修正Pep1Alloc（または類似の蛍光性ペプチド）をphotopattern。 蛍光顕微鏡の画像。共焦点顕微鏡は、z-STを取るためにここで使用することができますゲルのACK画像パターンはx軸、y軸、およびz平面で観察することができるようにします。 注：蛍光では、ゲルは、AF488のフルオロフォアと最大蛍光の安定性を確保するために、光から保護されなければなりません。 （4℃、ホイルで包んで容器に店）光から保護した場合に蛍光性ペプチドはかなり安定しているので、ゲルはすぐに画像化される必要はありません。 ヒドロゲルおよびフォトパターン4.細胞のカプセル化収集とカプセル化のための細胞を調製します。 標準的な滅菌哺乳動物細胞培養の手順に従い、プレートから目的の細胞をトリプシン処理し、収集します。剥離が発生した後、増殖培地でトリプシンをクエンチ（ 例えば 、T-75フラスコ、5ミリリットルのトリプシン、5mlの培地でクエンチし、合計15ミリリットルのための5ミリリットル培地でプレートを洗浄）。 注：トリプシン処理時間は、細胞型の間で異なるが、一般的に5〜15分の間で発生する可能性があります。代替セルdetachmenT剤（ 例えば 、ベルセン）は、所望であれば、細胞を収集するために使用されてもよいです。 バルクの細胞懸濁液（90〜110×gで、5分間）遠心分離しながら、血球計または他の細胞計数装置を用いてトリプシン処理細胞懸濁液のアリコートからの細胞（100の最小または製造業者のプロトコール）を数えます。最初のトリプシン処理細胞懸濁液があまりに希薄された場合に最小限のPBSの体積または成長培地と再数の遠心分離後、細胞ペレットを再懸濁します。 （重合前に）ゲル溶液と混合したときに5,000細胞/μlのがありますように、マイクロ遠心チューブに各ゲル状態のためのPBSの最小容量のセルとのアリコート部分を再サスペンド。 注：標準の細胞アリコートを300,000-500,000細胞を含み、5,000細胞/μLで3~5×20μlのゲルのために使用することができるゲル/細胞懸濁液の60〜100μLを作るのに十分です。より高いまたはより低い細胞密度は、細胞の量に応じて、カプセル化のために使用することができます細胞 – マトリックス接触対それぞれ、所望の、及びアプリケーションごとに決定されるべきです。 遠心分離細胞/ PBSアリコート（90〜110×gで、5分）。 慎重に右のカプセル化の前に、マイクロ遠心チューブに細胞ペレットからPBSを吸引除去します。 注：細胞は、剪断力に対して敏感である場合は、2回目の遠心分離工程（ 例えば 、血球計）をカウントし、続いて各ゲル状態のために必要な部分にトリプシン処理細胞懸濁液（トリプシン+培地+細胞）を等分することによって除去することができます。これらのアリコート（90~110×gで、5分間）を1回遠心分離し、トリプシン+媒体は、カプセル化のために、細胞ペレットを残して、吸引されます。 非パターン化ヒドロゲルでカプセル化細胞。 すぐにPBSを吸引した後、/μlの5,000個の細胞の最終濃度になるように、スプレッドシートで計算されるようPEG4SH、Pep2Alloc、Pep1Alloc、LAP、およびPBS + PS + FZでペレット化した細胞を懸濁。 カビやDESCRなどのハイドロゲルを重合ステップでibedは2.1.6に2.1.2。 注：スライドガラス金型内のセルをカプセル化すると、細胞死をもたらすことができるゲルを、せん断防止するために、トップスライド後重合を除去する際に、注意が必要。金型からのゲルの除去を助けるために、スライド金型は、それが簡単にトップのスライドを削除すること、ガスケットおよびヒドロゲルを濡らすために、重合後に滅菌PBSまたは増殖培地中に配置することができます。完全この剪断を防止するための方法は、注射器金型を使用することです。 未反応の種と過剰LAPを除去するために、ゲルを、増殖培地中で3×10分を洗い流します。 さらなる分析のための所望の時点まで37℃で成長培地中でゲルをインキュベートし、5％CO 2。培地48時間ごと、またはアプリケーション（特定の細胞型とメディアのための例えば 、典型的な給紙間隔）のような決定を補充。 細胞の存在下で細胞と光パターンをカプセル化します。 すぐにPBSを吸引した後、/μlの5,000個の細胞の最終濃度になるように、スプレッドシートで計算されるようPEG4SH、Pep2Alloc、LAP、およびPBS + PS + FZでペレット化した細胞を懸濁。 Pep1Allocとの後の反応のための遊離のチオール（ 例えば 、2 mM）の適切な濃度のままにしておきます。 ステップ2.2.8に2.2.2で説明したように、金型は、重合、およびパターンのヒドロゲル。 未反応の種と過剰LAPを除去するために、パターニングした後、増殖培地中ですすぎゲルは、3×10分。 さらなる分析のための所望の時点まで37℃で成長培地中でゲルをインキュベートし、5％CO 2。培地48時間ごとまたはアプリケーションのように決定を補充。 5.カプセル化された細胞の生存率および代謝活性の決定カプセル化された細胞生存率（ 図4A）を決定するためにライブ/デッド細胞毒性アッセイを実行します。 グラムからの媒体の拡散を可能にするために、PBSで3×15分をゲルから成長培地を削除し、すすぎELS。 雪解け生/死細胞毒性アッセイ溶液（エチジウムホモダイマー1及びカルセインAM）。 1ミリリットル滅菌PBSに4 mMのカルセインAMソリューションの2mMのエチジウムホモダイマー1及び0.5μlと2μLを加えます。完全な混合を確実にするために渦。 48ウェルプレートの各シリンジ型ゲルを300μlの染色溶液を追加し、または滅菌シャーレ中のガラススライド上にゲルの表面をカバーするのに十分な、そして45分間インキュベートします。 余分な染色液を削除し、（PBSで3×15分）ゲルから余分な染料を除去するためにすすぎ。 10Xおよび525分の488 nmのEX /エムでの共焦点顕微鏡（zスタック画像）またはzスタック機能を備えたエピ蛍光顕微鏡上の画像。 Z-スタックを投影し、生（細胞体全体緑色）および死（赤核）画像化ソフトウェアを有する細胞の数を計数することにより生存細胞の数を定量化します。 細胞活性後のカプセル化（Figuを決定するために、代謝活性のアッセイを行います）図4（b）再。 アッセイの前に24時間は、新鮮な増殖培地でカプセル化された細胞を養います。 注：コントロール（バックグラウンドの読み）として（無細胞とのゲルまたはゲルを含まない）いくつかの余分なウェルに培地を追加します。 興味のある時点で、MTS試薬溶液を解凍。 注：時間をかけて代謝活性を測定するために、初期の時点で（12〜24時間後、カプセル化）後の時点と比較するための基準として推奨されています。 各ウェル（100μlの成長培地あたり20μl）をへのMTS試薬を追加します。 製造者の指示に従って、37℃で1-4時間、5％CO 2のためのサンプルをインキュベートします。 注：細胞はMTSを減少させ、ゲルからホルマザン生成物の拡散を可能にするためのインキュベーション時間で十分であるべきです。したがって、このような注射器の先端ゲルなどの厚いゲルは、十分なMTS削減と拡散のために、より長いインキュベーション時間（〜4時間）を必要とするかもしれません。 MTS /ミディアムを減少ピペットで100μlのプレートリーダー上で490nmで96ウェルプレートおよびレコード吸光度の清浄なウェルに。 ベースライン吸光度の値を生成するために、サンプルの吸光度値から、細胞なしのウェルのバックグラウンド吸光度を差し引きます。