We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.
Нажмите биохимический были исследованы для использования в многочисленных биоматериалов приложений, в том числе доставки лекарственных средств, тканевой инженерии и клеточной культуры. В частности, свет опосредованной реакции нажатия кнопок, таких как фотоинициированной тиоловых-ена и тиол-ина реакций, получают пространственно-временной контроль над свойствами материалов и открывает возможности для разработки систем с высокой степенью пользователем направленный контроль свойств. Изготовление и модификация гидрогель на основе биоматериалов с использованием точности, обеспечиваемой света и универсальность предлагаемой этими тиол-Х photoclick имеют химий растущий интерес, в частности, для культивирования клеток в четко определенных, биомиметические микросреды. Здесь мы описываем методы для photoencapsulation клеток и последующего photopatterning биохимических репликами в пределах матриц гидрогеля с использованием универсальных и модульные строительные блоки, полимеризованные с помощью реакции photoclick тиол-ена. В частности, подход представляется для сотрудничестваnstructing гидрогели из аллилоксикарбонил (Alloc) -functionalized пептидных сшивок и боковые остатки, пептидные и тиол-функционализированные поли (этиленгликоль) (ПЭГ), которые быстро полимеризуются в присутствии лития acylphosphinate фотоинициатора и cytocompatible доз длинноволнового ультрафиолетового (УФ) света. FACILE методы визуализации photopatterning и количественного определения концентрации пептидов, добавленных описаны. Кроме того, методы устанавливаются для инкапсулирования клеток, специфически человеческих мезенхимальных стволовых клеток, и определение их жизнеспособности и активности. В то время как образование и начальное структурирование тиол-Alloc гидрогелей приведены здесь, эти методы широко могут быть применены к ряду других легких и радикально-инициируемых систем материала (например, тиол-норборнен, тиол-акрилат) с образованием узорных субстратов.
Нажмите биохимический все чаще используются при разработке материалов для многочисленных биомедицинских применений, в том числе доставки лекарственных средств, тканевой инженерии, и контролируемой культуре клеток, вследствие их селективных, эффективных и часто cytocompatible реакционными. 1-3 Photoclick химии , которые используют свет для запуска или инициировать реакции (например, азид-алкина, 4 тиол-ена, 5 и тетразол-алкен 6) представляют особый интерес для формирования или модификации биоматериалов. Быстрые темпы в мягких условиях и контроля , когда и где они происходят со светом делают эти реакции хорошо подходит для пользователя направленного управления биоматериала свойств в присутствии клеток. 7,8 В частности, тиол-ена photoclick биохимический были использованы для генерации гидрогель на основе биоматериалов с прочными механическими свойствами и 5,9 для инкапсулирования широкого спектра типов клеток, в том числе, но нет в ограничительном смысле , мезенхимальных стволовых клеток человека (hMSCs), фибробласты, хондроциты и клетки поджелудочной железы, с перспективны для культуры и доставки клеток. 10,11 Кроме того, эти химические составы были использованы для пространственного паттернировании биохимических репликами , чтобы имитировать основные аспекты родной микросреды клеток и облегчения соответствующих клетка-матрица взаимодействий, в том числе адгезию, дифференцировку и вторжения. 3,12
Для строительства тиоловых-ен гидрогели со светом, пептиды , содержащие цистеинов (тиол) обычно вступают в реакцию с полимерами , функционализированных акрилатов или норборненов ( «ВСВ») для быстрого, фотоинициированной полимеризации при cytocompatible условиях. 13 Расширение этого инструментария, мы стремились создать методы формирования гидрогеля с новыми универсальными и доступными строительными блоками, которые требуют минимального синтетической обработки или были коммерчески доступны к их широкому использованию в качестве синтетических матриц. внеклеточного14 В частности, пептиды были модифицированы с аллилоксикарбонил (Alloc) лизинов: охраняемыми один для кулона, интегрин-связывающим группы для содействия клеточной адгезии [K (Alloc) GWGRGDS = Pep1Alloc] или два для неразлагающихся или клеточно-разлагаемые сшивок [K ( Alloc) RGKGRKGK (Alloc) G или KK (Alloc) GGPQGIWGQGK (Alloc) K = Pep2Alloc соответственно]. С использованием этих последовательностей, были созданы условия для быстрой реакции (1-5 мин) с четырьмя плеча тиол-модифицированные поли (этиленгликоль) (PEG4SH) с использованием cytocompatible дозы с большой длиной волны УФ – излучения (10 мВт / см 2 при 365 нм) и фотоинициатор лития фенил-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP). Полученные гидрогели были стабильны в условиях культивирования клеток в течение нескольких недель. Чтобы включить разложение и реконструирование клеток приводом, ферментативно расщепл емую пептид был включен в сшивок гель (т.е. GPQGIWGQ), 15 и модели первичной клетки, мезенхимальных стволовых клеток человека (hMSCs), остается весьма жизнеспособными после того, как инкапсуляция и Дьюринг культуры в пределах этих матриц. Кроме того, пептиды были пространственно узорной в этих материалах, и hMSCs сохраняют жизнеспособность и метаболическую активность в условиях photopatterning. Альтернативные последовательности кулон пептид, который не показан здесь (например, IKVAV, YIGSR, GFOGER и т.д.), также могут быть включены в матрицах , чтобы исследовать дополнительные взаимодействия клеток с окружающей микросреды. Эти результаты являются перспективными для применения этих гидрогелевых материалов на основе трехмерных (3D) культуры и доставки клеток для изучения и прямых взаимодействий клетка-матрикс для различных типов клеток.
При этом методы photoencapsulate клетки и впоследствии photopattern биохимические сигналы в рамках предлагаемой системы гидрогеля представлены (Рисунок 1). Методы для наблюдения и количественной оценки этих photopatterns также демонстрируются: в частности, я) количественное и качественное использование анализа Эллмана для определения modificaции свободных тиолов в пределах узорчатых субстратов и II) комплементарной качественного использования флуоресцентных пептидов (AF488Pep1Alloc) , чтобы наблюдать эти модели в трех измерениях. Кроме того, анализы для определения жизнеспособности (живой / мертвый жизнеспособность / цитотоксичность окрашивание) и метаболической активности (МТС; 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -5- (3-карбоксиметоксифенил) -2- (4-сульфофенил) -2H-тетразолия) представлены таким образом, чтобы пользователи могли определить cytocompatibility из photoencapsulation и photopatterning условий для различных клеточных линий внутри матриц гидрогеля. В то время как протокол демонстрируется на легкому света на основе системы photoclick гидрогеля, эти способы могут быть применены ко многим другим радикально-инициируемых гидрогелевых систем photoencapsulation и photopatterning в присутствии клеток.
Процедура, представленная здесь демонстрирует методы photoencapsulate клеток в гидрогели, образованных химии клик тиол-ена и впоследствии photopattern гели с биохимическими репликами. Использование света первоначально образуют гидрогели позволяет равномерное смешивание и суспензии клеток внутри раствора полимера до полимеризации. Быстра полимеризаци "замки" гель в форме, определенной пресс-формы и герметизирует подвешенный клеток внутри сети гидрогеля. Гели могут также быть отлиты в многочисленные различные формы (например, предметные стекла или кончиков шприца) , в зависимости от конечного применения желаемого. Например, клетки, заключенные в капсулы для 3D культуры в гидрогели, прикрепленных к предметные стекла особенно полезны для приложений для обработки изображений, как ослабление света ограничена в пределах тонкого образца. Шприц-формы могут быть использованы для быстрого инкапсулирования клеток, что позволяет большее количество образцов, приготовленных в течение короткого времени (по сравнению с предметное стеклоы), которые могут быть использованы для проведения экспериментов, требующих большого количества клеток, таких как проточная цитометрия или КПЦР. Впоследствии эти гели затем могут быть составлены по образцу с биохимическими репликами , чтобы вызвать желательные клеточные ответы , такие как дифференциация или вторжения. 30,31
Анализы для жизнеспособности и метаболической активности указывают на выживание клеток для системы материального и условий формирования паттерна представленных. Обратите внимание, что метаболическая активность не контролировали до 3-й день в неразлагающихся гелей (RGKGRK пептид поперечных связей), чтобы оценить начальные эффекты полимеризации и кучность условий на функции клеток. Кроме того, анализ целостности мембраны (живой / мертвый жизнеспособность / цитотоксичность окрашивание) из hMSCs через 1 и 6 дней после инкапсулирования в гелях с сформулированными разлагающегося пептида поперечную сшивку (GPQGIWGQ) поддерживает, что клетки сохраняют жизнеспособность и распространяются на 1 неделю в культуре. Жизнеспособность дополнительных клеточных линий было сообщено в условиях photopatterning 32 , аналогичных тем ,используется здесь и может быть оценена для описанной системы гидрогеля с использованием живого / мертвого окрашивания и анализы метаболической активности. В то время как мы не наблюдали проблем с жизнеспособности клеток с использованием этой системы материалов и связанных с ними процедур (4.2 и 4.3), некоторые типы клеток могут быть чувствительны к свободных радикалов и / или воздействие света. В этом случае пользователи могут рассмотреть вопрос об использовании не-фотоинициированной систем материалов, такие как азид-алкина, 12 FXIII, 31 или Дильса Альдера на основе химических составов пластовых гидрогель. 33
FACILE методы для обнаружения и количественного определения паттерна биохимических репликами в пределах гелей также представлены (3.1 и 3.2). Анализ Эллмана представляет особый интерес , поскольку реагенты являются коммерчески доступными и установка дополнительных шагов синтетической переработки или более дорогие реагенты (например, флуоресцентно-меченного пептида) не требуется. Анализ Эллмана может быть использован для точного определения модификации свободных тиолов с биохимическими репликами под differeнт photopatterning условия, а также быстро визуализировать модели. Для количественной оценки пептида инкорпорации, тиольную функциональную группу концентрацию до и после формирования паттерна, как количественная мера пептида включения, непосредственно оценивали с помощью анализа Эллмана. В то время как этот тип квантификации может быть сделано с флуоресцентно меченных пептидов, 34 формирования изображения на основе Количественное требует большего времени обработки и анализа шагов (например, синтез флуоресцентно-меченного пептида и генерации калибровочной кривой , чтобы связать флюоресценции концентрации пептида с помощью анализа изображений). Для визуализации пептида включения, реагент Эллмана могут быть непосредственно применены к образцам и немедленно визуализируется. В то время как ограничивается х и у-плоскостей для визуализации образов, метод может быть использован в качестве простого, рутинного метода, чтобы определить, является ли матрицы, содержащие свободные тиольные группы, которые были с рисунком. Важно отметить, что анализ Эллмана не Considered cytocompatible, так что в то время как он может быть использован для наблюдения и количественной оценки photopatterns, она не может быть сделано в присутствии клеток. Для получения изображения кучность в трех измерениях и в присутствии клеток, конъюгации флуоресцентных пептидов в матрицах гидрогелевых остается мощным и широко используемый подход. Разрешение шаблонов может быть оценена в x-, y-, и г-плоскости с помощью конфокальной микроскопии, и этот метод cytocompatible так, что клетки в узорчатых регионах или не-узорной регионах могут быть идентифицированы. Взятые вместе, методы анализа и обработки изображений на основе Эллман являются взаимодополняющими инструментами для исследователей, чтобы оценить как количественно, так и качественно photopatterning биохимических репликами в системе материалов.
Photoclick, или в более широком смысле Фотоинициированная, биохимический для формирования и модификации гидрогелей в присутствии клеток многочисленны. Формовочные, инкапсуляция и методы, представленные паттерна здесь не ИтITED к описанной материальной системы и могут быть применены к альтернативным основе света химических систем , таких как тиольные алкина, 35 азид-алкина, 4 и других тиоловых-ена химических (например, тиол-норборнен), 10,13, а также с разные фотоинициаторы, такие как Irgacure 2959, эозин Y и камфорохинона. Обратите внимание, что пользователи , возможно , потребуется настроить параметры процедуры (например, инкубационные времена, времена полимеризации, плотность ячеек) , чтобы гарантировать , что условия остаются cytocompatible для этих других систем. Поскольку процесс формирования рисунка требует диффузии Alloc-модифицированного пептида (ов) в гидрогель (2.2.3-2.2.5), этот процесс может оказаться наиболее полезным для добавления интегрин-связывающих фрагментов (например, пептидов или белков внеклеточного матрикса фрагменты) в гидрогеле, где присоединение лиганда к сети требуется для генерации тяговых усилий с помощью клеточного и полной активации интегрина. 36 Обратите внимание, что для биомолекул , который можетбыть так же активны в растворе или при иммобилизации (например, факторы роста или цитокины), стадию инкубации для диффузии фрагмента (~ 1 час) в гидрогель может привести к сигнализации событий, свернутые результаты формирования паттерна. Другие методы были созданы для фактора роста иммобилизации или местного секвестрации для их структурирование. 37-39 Кроме того, разрешение модели диктуется контроля над освещенности. Здесь, фотошаблонов позволяют создавать шаблоны через глубину геля и в х и у-плоскостей; Тем не менее, больше пространственный контроль над паттернировании биохимических репликами в гелей может быть достигнута с альтернативными методами облучения , такие , как использование двухфотонного конфокальный микроскоп для создания изображения в x-, y- и z- самолетов. 34,40 И, наконец, важно отметить, что в то время как материал, система используется в рамках этой процедуры, только изначально модифицирован с биохимическими репликами, ортогональные photoclick биохимический может быть использован, чтобы позволить AlteРационы в матричных свойств с течением времени. 12 Порядок и методы , представленные здесь разнообразить существующие подходы к созданию синтетических матриц с четко определенными и spatiotemporally-регулируемыми свойствами. В частности, коммерческая доступность реагентов и материалов, используемых в рамках данной процедуры будет полезна широкому кругу исследователей, заинтересованных в использовании гидрогеля на основе биоматериалов для применения в контролируемой культуре клеток.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана программами Delaware Кобре в Drug Discovery и в передовых биоматериалов, финансируемых за счет институциональных наград развития из Национального института медицинских наук Генералы в Национальном институте здоровья (P20GM104316 и P30 GM110758-01, соответственно), Благотворительные фонды Пью (00026178), Национальный научный фонд Карьера Award (DMR-1253906), то Burroughs Wellcome фонд (1006787), и программа Национального научного фонда IGERT SBE2 в университете штата Делавэр (общение Л. Савицкий). Авторы благодарят Delaware Biotechnology Institute биоимиджинга центра при Университете штата Делавэр для обучения и доступа к конфокальной микроскопии, г-жа Кэтрин Wiley за помощь во время съемок клипа, г-н Мэтью Реман за щедрое предоставление hMSCs, выделенные из костного мозга, профессор Кристофер Дж . Kloxin и г-н Стивен Ма за щедро обеспечивая фотошаблонов, и профессор Уилфред Чен для использования автоматизированной ридере. </p>
Custom Peptides | Various Vendors | —- | Peptides may also be synthesized via standard SPPS techniques with materials from vendors including ChemImpex and ChemPep. |
4arm PEG Thiol, MW 20k | JenKem USA | 4ARM-SH | Listed under Multi-arm Homofunctional PEGs. PEG4SH may also be synthesized as previously referenced. |
Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Colorado Photopolymer Solutions | Li-TPO | |
Dimethyl Phenylphosphonite | Sigma Aldrich | 149470 | Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
2.4.6-Trimethylbenzoyl Chloride | Sigma Aldrich | 682519 | Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Lithium Bromide | Sigma Aldrich | 213225 | |
2-Butanone | Sigma Aldrich | 360473 | |
Flask, Round Bottom, 100 mL | Chemglass | CG-1506-05 | |
80 mL Filter Funnel, Buchner, Medium Frit | Chemglass | CG-1402-L-02 | Filter paper inside a regular glass funnel may be used if desired. |
Magnetic Stir Bars | Various Vendors | —- | |
Magnetic Stirring and Hot Plate | Various Vendors | —- | |
Vacuum Dessicator | Various Vendors | —- | |
Deuterium Oxide | Acros Organics | 16630 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190-250 | |
Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
Fungizone | ThermoFisher Scientific | 15290-018 | |
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Select appropriate medium and trypsin depending on cell type. |
Microcentrifuge tubes | Various Vendors | —- | 1.5 or 2 mL sizes, sterile. |
BD Syringe with Slip (Luer) Tips (Without Needle) | Fisher Scientific | 14-823-16H | Product number listed here is for a 1 mL syringe (16H), Various sizes are available (14-823-XX). |
Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
High-Purity Silicone Rubber, 0.010" Thick, 6" x 8" Sheet, 55A Durometer (Gasket) | McMaster Carr | 87315K62 | |
Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
RainX, Original | Amazon | 800002243 | May be purchased from other vendors. |
Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2 | |
Photomasks | Advance Reproductions Corporation | —- | Photomask Division, different designs may be printed as desired. |
DTNB; Ellman's Reagent; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | ThermoFisher Scientific | PI-22582 | |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E6758 | |
Sodium Hydroxide, Pellets/Certified ACS | Fisher Scientific | S318 | |
Orthophosphoric Acid | Alfa Aesar | 33266 | |
Cysteine Hydrochloride Monohydrate | Sigma Aldrich | C7880 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | ThermoFisher Scientific | L-3224 | |
CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay | Promega | G3582 | |
Centrifuge | Various Vendors | —- | Capable of speeds at 90-110 x g. |
Multiwell Plate Reader | Various Vendors | —- | Capable of reading absorbance at 405 nm in a 96-well plate. |
Epifluorescent or Confocal Microscope | Various Vendors | —- | To visualize peptide patterns and cells within hydrogels. |
Omnicure Exfo Series 2000 | Excelitas Technologies | —- | Alternate light systems may be used to polymerize hydrogels. |
Zeiss Zen Lite Software | Zeiss | —- | Available at zeiss.com; compatible with images taken on Zeiss microscopes |
ImageJ | NIH | —- | Available at imagej.nih.gov; applicable for general image analysis |